定量的食物摂取の試金を組み合わせると強制的にショウジョウバエの食欲を勉強するニューロンを活性化

この手順の全体的な目標は、成体のショウジョウバエの食物摂取量を定量的に測定することであり、ニューロンの熱遺伝学的および光遺伝学的活性化などの遺伝子操作の影響を評価する手段を提供します。これらの対策は、空腹感、満腹感、食欲などの神経力学など、摂食分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、複数のハエのグループの食物摂取量を同時に定量化することであり、遺伝子スクリーニングで異常に摂食するハエを特定するのに特に有用です。

まず、外部コンテナを準備するための物資を集めます。0.5グラムのアガロースと50ミリリットルの二重蒸留水を懸濁します。頻繁に攪拌しながら加熱し、沸騰させてヒートプレート付きのマグネチックスターラーで完全に溶解します。

1%アガロースが約60°Cに冷えたら、5ミリリットルを空の外部容器に移し、アガロースが室温まで冷えるまで容器を開いたままにしてアガロースパッドを生成します。次に、0.5ミリリットルの二蒸留水に0.5グラムのアガロースを加えます。頻繁に攪拌して加熱し、沸騰させて、ヒートプレート付きのマグネチックスターラーで完全に溶解します。

1%アガロースが摂氏約60度に冷えたら、アガロースに1.71グラムのスクロースを加えて、100ミリモルのスクロースを得ます。アガロース溶液に0.25グラムの青色染料を加えて、染色ラベル食品の体積あたり0.5%の重量を得ます。次に、内部の容器を準備します。

空の容器を平らな水平面に置きます。次に、750マイクロリットルの青色染料でラベル付けされた食品を個々の食品容器に加えます。少なくとも5分間固めましょう。

充填された内部容器を準備した外部容器に移し、アガロースパッドの中央に配置します。バックグラウンド減算のために、無色素の食品で給餌チャンバーを準備します。供給チャンバーを室温で40分間開いたままにし、外側の容器の壁に結露がなくなるまで待ちます。

行動実験の前に、調製したフィーディングチャンバーを実験温度30°Cで2時間平衡化し、フィーディングチャンバー内の温度が比較的均一になるようにします。給餌プロセスを開始するには、20匹のハエを自宅のバイアルから予熱した給餌チャンバーに優しくたたいて慎重に移します。摂氏30度で60分間給餌プロセスを続けます。

摂氏マイナス80度で摂氏30分間栄養室を凍結することにより、摂食を停止します。1つのバイアルから20匹のハエを、優しくタッピングして慎重にフィーディングチャンバーに移します。次に、チャンバーを照明セットアップに横向きに置きます。

光遺伝学的操作には、光刺激の源としてオレンジ色のLEDのアレイを使用し、LEDの上に水平プレキシガラスプレートを固定して、照明中に供給チャンバーを支えます。セットアップを摂氏25度、湿度60%のインキュベーターに保管します。遺伝的制御を刺激する Taotie-GAL4 UAS CsChrimson フライと並行して飛ぶが、異なる給餌室で飛ぶ。

オレンジ色のライトによるバックライトで60分間給餌プロセスを続けます。次に、摂氏マイナス80度で給餌チャンバーを30分間凍結します。給餌を停止した後、給餌チャンバーから20匹のフライすべてを計量紙に注ぎます。

次に、柔らかいブラシを使用して1.5ミリリットルのチューブに移します。500マイクロリットルのPBSTをチューブに加え、60ヘルツの粉砕機で5秒間フライを均質化します。その後、身体部位の断片が検出できない場合に観察により、十分な均質化を確認します。

ホモジネートを含むチューブを1300 RPMで30分間回転させ、破片を取り除きます。遠心分離後、100マイクロリットルの上清を96ウェルプレートのウェルに移します。破片による吸収剤の計算ミスを避けるために、使用したチューブを遠心分離機からそっと取り出し、パレットを乱さずに上澄みを慎重に落とします。

すべてのサンプルがロードされたら、プレートをプレートリーダーに入れて、サンプルの吸収性を630ナノメートルで測定します。摂食反応は、腸内で検出可能な色素を持つハエを目視検査し、採点することで定量化しました。Taotieニューロンの活性化後、Taotie dTRPA1ハエの約58%が強い摂食行動を示しました。

そして、そのうちの23%が軽度の摂食行動を示しました。TRPA1による急性活性化Taotie-GAL4ニューロンは食物摂取量を劇的に増加させ、Taotie-GAL4標識ニューロンが成体のショウジョウバエの食物摂取の調節に関与していることを示唆しています。このビデオを見た後、ニューロンの活動を操作して成虫のDrosophila melanogasterの摂食制御の神経メカニズムを調査した後、食物摂取量を定量化する方法を十分に理解しているはずです。