枯草菌の単一細胞マイクロ流体解析

このマイクロ流体実験装置の全体的な目標は、一定で高度に制御された環境条件下で個々の細菌細胞を長期的に観察できるようにすることです。この方法は、ストレスに対する個々の細胞の長期的な応答パターンは何か、集団全体の不均一な表現型が時間とともにどのように変化するかなど、細菌生理学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、一定で均一で高度に制御された環境条件下で、数十世代または数百世代にわたって個々の細胞系譜を観察できることです。

テキストプロトコルに従ってPDMSポリマーを調製した後、ポリスチレンペトリ皿の壊れていないアルミホイルにシリコンマスターを置きます。脱気したPDMS混合物をマスターに約5mmの深さまで注ぎます。次に、皿を少なくとも10分間ガス抜きします。

PDMSを60°Cのオーブンで少なくとも1時間硬化させ、室温まで冷却します。次に、マスターと硬化したPDMSを含むアルミホイルをプレートから取り外します。丁寧に切り込みを入れ、マスターの裏側からアルミホイルを剥がします。

次に、マスターからPDMSを慎重に剥がします。ウェーハとして、通常、わずかに異なる寸法のいくつかのマイクロ流体デバイスが含まれます。清潔で鋭利なメスを使用して、単一のデバイスを適切なサイズにカットします。

半透明のオフィステープをデバイスのパターン化された側面に貼り付けて、パターン化された機能の視認性を高めます。入口ポートと出口ポートは、目に見える流体チャネルの両端にある円形の領域として識別されます。パターン面を下にしてPDMSデバイスを裏返し、0.75ミリメートルの生検パンチを使用して、マークされたドットまでデバイスをパンチスルーします。

次に、パンチングを捨てます。デバイスからパンチングを取り外すためにピンセットが必要になる場合があります。洗浄して乾燥させたカバーガラスとPDMSデバイスを酸素プラズマクリーナーに挿入し、ここに示す設定でデバイスをプラズマ処理します。

プラズマ処理が終了したらすぐに、デバイスを取り外し、プラズマクリーナーからガラスを覆います。PDMSを反転させ、パターン面がガラスに接触するようにカバーガラスの中央に置きます。供給チャネルがカバーガラスの長いアクセスと位置合わせされていることを確認してください。

PDMSがガラスに対して密閉されるように、非常に静かに押し下げます。組み立てたデバイスを摂氏60度のオーブンで少なくとも1時間焼きます。ベーキング後、デバイスの片隅を軽く押して、PDMSがガラスに接着されていることを手動で確認します。

テキストプロトコルに従ってポリマーチューブを切断した後、ピンチバルブのY字型ジャンクションを組み立てます。使用する場合は、Y字型の上部のとげに2センチメートルの長さのフレキシブルシリコンチューブを切断して取り付け、Y字型の下部のバーブに1センチメートルの長さのシリコンチューブを取り付けます次に、10センチメートルの長さのポリマーチューブを切断し、1センチメートルのシリコンチューブセグメントに挿入して、一端をスイッチジャンクションに接続します。Y.もう一方の端にあるチューブの長さを、プラスチック製のシリンジアダプターから取り外し、針の端から約90ミリメートルに約90度曲げた9ゲージの針に接続します。21ゲージの鈍い針を、注射器からスイッチ装置まで走るチューブセグメントの一方の端に、針をチューブに挿入して接続します。各長さのチューブのもう一方の端を、Y字型ジャンクションのインレットバーブにあるシリコンチューブセグメントに挿入します。

シリンジにBSAを添加した細菌増殖培地を充填した後、テキストプロトコルに従って、ロードされたシリンジを準備した21ゲージの針に接続し、インレットチューブに取り付けてシリンジをシリンジポンプにロードします。シリンジポンプを高流量で運転し、シリンジポンプを垂直に向け、シリンジを軽くたたいて気泡を上部に持ってきて、入口配管から空気をパージします。シリンジから空気がパージされたら、シリンジポンプを水平に置き、シリンジからポリマーラインをスイッチ装置を通じて徐々にタップまたはフリックして、気泡を取り除き、パージします。

メディアを切り替える場合は、シリンジの 2 番目のバンクに対してこのプロセスを繰り返します。気泡がパージされた後、フェーズ2シリンジポンプを毎分1.5マイクロリットルに設定し、フローを一時停止します。第 2 中相に対応する Y 字型ジャンクションの分岐部にあるフレキシブル チューブのセグメントに小さなバインダー クリップを配置し、フェーズ 1 ポンプを運転し続けて、Y 字型ジャンクションの下流にある第 2 媒体をパージします。

PDMSデバイスをロードするには、まず、空の薄いゲルローディングマイクロピペットチップをマイクロ流体デバイスの出口穴にそっと挿入します。P200マイクロピペットで細いゲルローディングチップを使用して、1ミリグラム/ミリリットルのBSAを含む媒体を入口穴に注入し、チップと出口穴を観察してマイクロ流体チャネルの充填を監視することにより、デバイスを不動態化します。デバイスを室温で約5分間インキュベートします。

次に、同様のチップを使用して、アウトレットチャネルのチップを使用して各チャネルに再懸濁されたセルをロードし、デバイスを介したセルの進行状況を監視します。ゲルローディングチップを出口穴からそっと取り外し、デバイスの損傷を防ぐために一度に1つずつ作業します。適切なローターアダプターのベンチトップマイクロ遠心分離機で、約6, 000回gで10分間遠心分離します。

顕微鏡下で、デバイスをスライドホルダーステージインサートに固定せずに、正常にロードできることを確認します。PDMSの両側にあるカバーガラスをステージインサートの下部にテープで留めて、ロードされたデバイスをステージインサートに慎重に取り付けます。ステージインサートデバイスアセンブリを反転させてPDMSが上を向くようにし、ほこりのないワイプなどの柔らかい面に置きます。

フェーズ1シリンジポンプの流量を毎分35マイクロリットルに調整します。次に、一度に1レーンずつ作業し、入口針を挿入し、次に廃棄物ビーカーに走る出口針を挿入します。デバイスの漏れを目視で検査した後、アウトレットチューブを調べて、中メニスカスに濁った縞模様として現れる余分なセル

装置が約15分間稼働したら、フェーズ1シリンジポンプを毎分1.5マイクロリットルに設定し、流れを一時停止します。ポンプとデバイス装置全体を倒立型蛍光顕微鏡に持ち込み、フェーズ1の媒体流を毎分1.5マイクロリットルで再開します。デバイスを備えたステージインサートを顕微鏡に慎重に取り付け、必要に応じてテープを使用してインレットチューブとアウトレットチューブを配線します。

イメージング用のデバイス上の適切な位置を特定し、必要に応じてイメージングを開始します。細胞は通常、定常状態の指数関数的な成長を読み取るのに数時間を要し、画像取得の開始を必要に応じて遅らせることができるので、平衡化期間後にイメージングが開始されることに注意してください。イメージングの連続するラウンド間で媒体を切り替えるには、フェーズ1シリンジポンプの流れを一時停止し、フェーズ2シリコンチューブからバインダークリップを慎重に外し、それぞれをYジャンクションのフェーズ1ブランチのシリコンチューブに移動し、フェーズ2シリンジポンプの流れの一時停止を解除してイメージングを続行します。

位相差顕微鏡法で評価すると、マイクロ流体配管をデバイスに取り付ける前に、マイクロ流体サイドチャネルのすべてまたはほぼすべてに1つ以上の細菌細胞が含まれていれば、初期細胞ローディングは成功したと見なされます。デバイスが最初にロードされると、比較的高い流量で平衡化されます。ここに示すように、平衡化したデバイスを顕微鏡で検査すると、ほとんどのサイドチャネルで1つのファイルに閉じ込められたいくつかの細胞が明らかになるはずです。

平衡化したデバイスを摂氏37度で毎分1.5マイクロリットルの流れ下で顕微鏡に置くと、細胞は約2時間にわたって均一で一定の指数関数的な相成長を再開します。指数関数的な成長を再開した細胞は、明視野顕微鏡または蛍光顕微鏡を使用して少なくとも24時間確実にイメージングできます。培地スイッチを導入することで、実施できる実験の範囲が広がりますが、入口に気泡や細胞クラスターが存在することで、壊滅的な細胞死イベントの頻度も増加します。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、約5時間で完了します。この手順を使用することにより、さまざまな蛍光レポーター、菌株、および環境条件で、非常にまれなイベントや一過性のイベントを含む、さまざまな生理学的現象を調べることができます。