Name: 枯草菌の単一細胞マイクロ流体解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 学ぼう、Bacillus subtilisを用いた単一細胞マイクロ流体解析法。厳密な環境制御下で細菌の系統を長期観察し、ストレス応答や表現型変動を研究する強力な技術です。

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このプロジェクトは、GM018568 の下で健康の国民の協会によって賄われていた。このプロトコルで行われた一部中心ナノスケール システム (CNS)、メンバーの国家ナノテクノロジー調整インフラストラクチャ ネットワーク (NNCI)、全米科学財団 NSF 賞第 1541959 の下でサポートされているの。中枢神経系は、ハーバード大学の一部です。多くのおかげでは、妊娠とここと装置の元のバージョンのビルドに示されるデバイスに使用されるマスター テンプレートを加工で自分の仕事のトーマス ・ ノーマンとネイサンの主原因です。また、ヨハン ・ アンデルセンと彼の貴重なコラボレーション アドバイスをありがとう、彼らのアドバイスや細菌マイクロ流体装置の継続的な改善の彼の研究室のメンバーに感謝します。

1. PDMS 装置鋳造
<ol><li>埃のない環境で PDMS ポリマーと 10:1 の比率で硬化剤を混ぜるし、ドガの少なくとも 10 分のための真空の下で。</li>
	<li>ポリスチレン ペトリ板に切れ目のないアルミ箔の部分にシリコン マスター (またはのエポキシまたはポリウレタン レプリカ) を配置します。表面の泡を破るに空気の穏やかな流れの深さの約 5 mm. ドガ ペトリ プレートで少なくとも 10 分間使用するマスター シェイプの上脱 PDMS 混合物を注ぐ。 注: 使用する 2 層デバイスの寸法に表示される付随 CAD ファイル5 (補足のファイル 1を参照してください)。プラスチック製レプリカ マスターが脱ガス; 中のフロートの一部このような場合は、きれいなプラスチック アプリケーター付きレプリカを押し下げます。</li>
	<li>60 ° C のオーブンで 1 時間、少なくとも PDMS を治すし、室温に冷却します。ペトリ プレートからマスターと硬化 PDMS を含むアルミ箔を削除します。マスターの後ろからアルミ箔を慎重に剥がし、慎重にマスターから PDMS の皮をむきます。 注: また、PDMS が治るかもしれない一晩室温で。シリコン ・ ウェハ マスターの相対的な脆弱性エポキシ接着剤を使用して 1/16 インチのウエハーを恒久的に結合することで解決できます-ウェハと同じサイズの厚いアルミ ディスク。</li>
	<li>ウェーハは通常 (補足ファイル 1参照) 寸法の違ういくつかのマイクロ流体デバイスを含む、クリーン、鋭いメスを使用してサイズを変更する 1 つのデバイスをカットします。 注: ルーチン枯草の仕事、C または付属の CAD ファイルに F が付いている 1.0 μ m 全体セル塹壕でデバイスを使用します。</li>
</ol>2. デバイス パンチと接合
<ol><li>半透明のオフィスのピースを配置はテープ パターン機能の可視性を高めるために装置のパターン側 (材料の表を参照してください)。入口と出口ポートは、(図 1) 表示されている流路の両端に円形の領域として識別されます。入口と出口のピンのデバイスに穴を開けるときは、視認性を向上させるため、細いマーカーを用いたドットの入口および出口をマークします。 注: に入口と出口のピンが混雑してないことを確認、他のすべてのチャネルはパンチ、最初にデバイスのアルファベット指定子のすぐ下にチャネル。</li>
	<li>パターン側がダウンして、PDMS デバイスを反転し、0.75 mm 生検パンチ; を使用してマークのドットをデバイスを通してパンチpunchings を破棄します。 注: 生検パンチによる穴は通常少しフレアのパンチがポリマーに入るために、デバイスが柄側を下とパンチをされています。逆向きでデバイスをパンチング穴パターン側がシャープな境界線を持っていることを保証します。</li>
	<li>顕微鏡を使用して、デバイスの入口と出口の部分にパンチ穴が重なっているを確認します。パンチ穴から PDMS の任意の余分なフラグメントを削除するのにには、先の細いピンセットを使用します。</li>
	<li>きれいなポリスチレン ペトリ プレートにデバイスと場所の両側からほこりを削除するのにには、粘着テープを使用します。100% イソプロピル アルコールとぬれ性とクリーン ルームで拭きます; 摩擦によって 22 × 40 mm カバーガラスを準備します。乾燥した埃のない空気または窒素のストリーム。</li>
	<li>パンチ PDMS デバイス機能側を洗浄カバー ガラスと一緒に酸素プラズマ クリーナー。<ol>
<li>プラズマ治療以下の設定でデバイス: 真空、70 mTorr;O2気圧、200 mTorr;持続時間 15 秒。電源、w. 30 プラズマ治療期間が終了した直後にデバイスとカバーガラスから削除、プラズマ クリーナー。</li>
		<li>PDMS を反転し、カバーガラスのセンターに配置パターン側連絡先ガラス;(入口と出口の領域の間を実行する) 供給チャンネルがカバー ガラスの長い軸に整列することを確認します。ガラスに対して PDMS シールように非常に軽く押し込みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>60 ° C で少なくとも 1 時間オーブンで組み立てられた装置を焼く焼成後、手動でデバイスの 1 つのコーナーにそっと押すことで、ガラス、PDMS が結合されるを確認します。 注: デバイスを結合すると、一度それが使 24 h 内でポリマーがプラズマ処理後の時間の増加とともにますます疎水性になるので</li>
</ol>3. マイクロ流体配管の準備
<ol><li>ポリマー (内径 (ID) 外径 (OD) 0.06 インチ 0.02 インチ) を適切な長さに使用する場合、シリンジ ポンプからスイッチング装置に達すると顕微鏡に取り付けたときにデバイスにチューブの長さをカットします。マイクロ流体のレーンがあるので多くの長さをカットします。</li>
	<li>切断および柔軟なシリコーンの管 (0.065 インチ OD 0.03 インチ ID) の"Y"のトップの棘、"Y"の下のバーブにシリコン チューブ 1 cm 長さ 2 cm 長さを割り当てることによって (使用する場合) ピンチ弁 Y 接合を組み立てる</li>
	<li>カット樹脂チューブ; の長さを 10 cm (または適切です)スイッチの接合部に 1 つの端を接続する"Y"の下のバーブに 1 cm シリコーン チューブ セグメントに挿入することにプラスチック注射器アダプターから曲がって約 90 ° 約 9 mm 針の端から削除されている 21 G 針にもう一方の端にそれらを接続します。</li>
	<li>21 G 鈍針を注射器からスイッチ装置管に針を挿入することによって実行されますチューブ セグメントの一方の端に接続します。Y ジャンクションの入口バルビツール剤のシリコーン チューブ セグメント チューブの各長さの他の端に挿入します。 注: 場所; でピンチ弁とジャンクションを保持する装置のいくつかの並べ替えを使用して、これは簡単にマイクロ ピペット チップ ボックス (図 2 D) から可能です。</li>
	<li>デバイスのプラグをコンセントから廃棄物を廃棄物を運ぶための樹脂チューブの長さをカットします。曲がった 21 G 針用意して上記のように一方の端にそれらを接続します。廃棄物ビーカーにチューブのもう一方の端をテープします。</li>
	<li>0.1 Mg/ml とウシ血清アルブミン (BSA) を含むメディアの適切なボリュームを準備し、目的のサイズと注射器の数を入力します。インレット チューブと負荷の注射器にシリンジ ポンプに接続されている準備された 21 G 針に BSA ロードされた注射器を接続します。 注: の各 20 mL 注射器でデバイスの 5 つのチャンネルを使用すると、典型的な実験。媒体が切り替えられる実験 5 シリンジの 2 銀行が必要になります。ここでは、最初の銀行を含むポンプ フェーズ 1 ポンプと呼ばれます、後のスイッチの中で、2 番目の銀行を含むポンプ フェーズ 2 ポンプと呼ばれます。</li>
	<li>高流量でシリンジ ポンプを実行して、入口配管から空気をパージ (> 500 μ L/分)、シリンジ ポンプを垂直方向に定位と上部に空気の泡をもたらすため注射器をタップして開始します。空気が注射器からパージされて、一度シリンジ ポンプを水平方向に配置、徐々 にタップかの除去、空気の泡を削除にスイッチ装置を注射器から高分子線をフリックします。(メディアの切り替え) の場合は、注射器の 2 番目の銀行のこのプロセスを繰り返します。</li>
	<li>空気の泡を削除後設定フェーズ 2 シリンジ ポンプ (すなわち、使用される媒体を第二に、スイッチの後) 1.5 μ L/分、流れを一時停止し。第 2 中期段階に対応する Y ジャンクションの分岐にフレキシブル チューブのセグメント上に小さなバインダー クリップを配置します。インレット チューブから 2 番目のメディアを削除するのには、少なくとも 30 分の適度なフロー率 (例えば、10 μ L/分) に相 1 シリンジ ポンプを実行し続ける Y ジャンクションの下流。</li>
</ol>4. セル文化準備
<ol><li>固定相に必要な媒体の興味のひずみの清酒を一晩、成長します。細菌の緊張は、セルがデバイスのチャネルから泳ぐしないでください、不動、セルをレンダリングする突然変異を含める必要があります。 注: このプロトコルでは、細菌株は枯草3610魔女A233Vの置換 (この突然変異を引き起こす螺旋状、防止の細胞の運動性ではなくまっすぐに鞭毛) を含む PrsbV- mNeonGreen細胞ストレスの記者と構成 Phyperspank- mNeptune (レッド) レポーターのセルを強調表示します。LB レノックス培地は、例のプロトコルで使用されます。マイクロ流体実験の代表的な菌株には、細胞の自動検出を容易にする 1 つ以上の蛍光転写記者と恒常生産、細胞質の蛍光タンパク質が含まれています。成長の欠陥は認められなかった LB レノックス豊富なメディアを使用した、しかし、分泌されるのでマイクロ流体条件下で最小限のメディアの枯草の成長が阻害されるかもしれないときシデロフォアは中型の流れによって洗い流されます。このような状況下では、S750中11の報告として成長をクエン酸ナトリウムと、中に塩化第二鉄添加による復元があります。</li>
	<li>実験の朝は、成長培地を 25 mL を含む困惑して 250 mL フラスコに 1:50枯草細胞を希釈します。1 より大きい光学密度 37 ° C で文化を振動で 5-6 時間細胞を成長します。 注: 定常相菌細胞は小さく、頻繁に見られるセルを少なくするため高密度細胞培養が望ましいチェーン、デバイス読み込みを促進します。細菌種は、最適なローディングのための他の媒体または成長条件を必要があります。</li>
	<li>枯草セル チェーン (エシェリヒア属大腸菌の必要はありません、他の種と必要ない場合があります) を削除する 15 mL コニカル チューブに細胞培養の約 15 mL をフィルター 5 μ m の孔径フィルターが装備する注射器を使用して。 注: 比較的少数の細胞を削除する必要があります。濾液は混濁する必要があります。</li>
	<li>室温で 4,000 x g で 10 分間のフィルター処理された文化を遠心します。上清を注ぎ、残りの細胞懸濁液をピペッティングを容易にする必要がある場合、新鮮な媒体の約 500 μ L を追加する管内残留液の上澄みで細胞ペレットを再懸濁します。</li>
</ol>5. デバイス読み込み
<ol><li>ゆっくりと空の薄いゲル読み込みマイクロ ピペットを置きます (材料の表を参照) をマイクロ流体デバイスのコンセント穴にヒントします。</li>
	<li>マイクロ チャンネル (図 2 a) の充填を監視するコンセントの穴に先端を観察入口穴に 1 mg/mL BSA を添加した培地を注入することによってデバイスをパッシベーション P200 ピペットで薄いゲル ロード ヒントを使用して、します。約 5 分間室温でデバイスを孵化させなさい。 注意: BSA はブロックまたは不活性化剤としては、PDMS 高分子の疎水性表面にバインドその親水性を増加し、他の蛋白質または細胞 (細胞表面分子) を経由してのバインドに使用されます。</li>
	<li>薄いゲル ロード ヒントを使用して、(セクション 4) から再懸濁細胞 (図 2 b) デバイスを介して細胞の進行状況を監視するアウトレット チャネルでヒントを使用して各チャネルを読み込みます。 注: 読み込みは最大 200 μ L のボリュームに P200 ピペットを設定し、セルの少量 (約ピペット チップの薄いセクションの半分の量) を吸引する前に空気のクッションを吸引によって促進されます。PDMS デバイスのボリュームが、マイクロ ピペットのそれと比較して小さい、再懸濁細胞量が正確には、する必要ではありません。細胞懸濁液はデバイスに戻ことができます限り、再懸濁細胞の密度に限度額なしのわかってください。細胞塊はデバイスを詰まらせることができ、徹底的なピペッティングおよび/または渦混合によって避けるべきであります。</li>
	<li>ゆっくり 1 つずつデバイスに損傷を防ぐための作業、コンセント穴からゲルの読み込みヒントを削除します。</li>
	<li>10 分 (図 2) の約 6,000 x g で適切なローター アダプターでベンチトップ遠心機でデバイスを遠心します。 注: 遠心ローター (図 2) に収まるように設計されたカスタム加工アルミニウム ローター アダプターは使用された;異なる遠心モデルを使用して、適切なローター アダプターで可能性があります。アダプターの重要な特徴は、サイド チャンネルにさせ細胞細胞トレンチのクローズド エンドの方向の水平力を提供することです。</li>
	<li>顕微鏡 (図 3) の下でロードの成功を確認、挿入なしでスライド ホルダー ・ ステージにデバイスを送れます。 注: このプロトコルは、60 X で 1.4 NA Ph3 油浸対物レンズがこの段階で両方の検証とその後のイメージングのために使用されます。</li>
</ol>6. デバイス アセンブリ、平衡、および取り付け
<ol><li>慎重にステージの挿入の下に PDMS の両側にカバーガラスをテーピングによってステージの挿入に読み込まれるデバイスをマウント (すなわちデバイスを取り付ける前にステージの挿入を反転)。PDMS を向いているので、ステージ挿入デバイス アセンブリを反転し、埃のないワイプ (図 2 D) などのソフト面に配置。</li>
	<li>フェーズ 1 シリンジ ポンプ 35 μ L/分の流量を調整する入口針し、口針を挿入、時に 1 つの車線を操作、(すなわち、廃棄物ビーカー; を実行して図 2 e)。</li>
	<li>クリーン無塵ワイパーで任意の過剰の中を拭いて、リークのためのデバイスを目視で確認します。余分なセル (通常濁ったストライプとして表示される) および廃棄物ビーカーに向かってゆっくりと移動中のメニスカスの外観のアウトレット チューブを調べます。</li>
	<li>廃棄物ビーカーに接続されているすべてのレーンを排出しているまで 35 μ L/分約 15-30 分で実行するデバイスを許可します。</li>
	<li>フェーズ 1 シリンジ ポンプを 1.5 μ L/分に設定し、流れを停止します。(このプロセスはローリング カートにすべて配置することによって助け) 顕微鏡に全体のポンプと装置の器具を持参し、1.5 μ L/分で中型の流れは慎重に倒立蛍光顕微鏡にデバイスとステージの挿入をマウント フェーズ 1 を再起動を使用してインレットとアウトレット チューブをルートに必要なテープ。</li>
	<li>イメージング デバイス上の目的の位置を検索し、必要に応じて画像を開始します。細胞は通常数時間 (約 10 世代) 定常状態指数段階成長に到達するを必要とは、画像集録の開始が遅れる、イメージングの平衡期間後開始を希望します。 注: 指数段階で開催された細胞の定常成長は、細胞分裂時間を追跡し、彼らが最小値は定数に達していることを確認それに続く画像解析時に確認する必要があります。</li>
</ol>7 媒体の切り替え
<ol><li>イメージングの連続ラウンドの間には、フェーズ 1 シリンジ ポンプの流れを一時停止します。フェーズ 2 シリコーン チューブ、シリコン チューブにそれぞれの Y ジャンクションのフェーズ 1 の分岐に移動からバインダー クリップを慎重に外します。国連-休止フェーズ 2 の流れはシリンジ ポンプ (これは 3.8 の手順で 1.5 μ L/分に設定された) とイメージングを続けます。 注: ポリマー チューブ下流の 10 cm の長さで 1.5 μ m/分で第 2 フェーズ中 Y ジャンクションの約 50 分のデバイスに到達します。デバイスには、蛍光トレーサー粒子を含むメディアを使用して経験的テストことができます。</li>
</ol>

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</ol>

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このマイクロ プロトコルは柔軟性手順の多くは、特定の種やひずみ、あるいは特定の目的のための使用を最適化するために変更する場合があります。確かに、このプロトコルでは我々 は枯草と使用を最適化するために元の「マザーマシン」コンセプト4に変更を加えました。多くの場合、セルの限定トレンチはこのプロトコルでセルを囲む浅いチャネルと 2 層セル トレンチを使用に対し単一レイヤー機能を構成します。2 層の設計は特に長いに栄養素や枯草の細胞からの代謝物質のフラックスを最大にする方法として導入されました (> 75 μ m) トレンチ5;ただし、単一レイヤー機能しばしば最適な細胞の成長のために足りるし、一般的用途エシェリヒア属大腸菌、特に短い (〜 25 μ m)4のとき。主な供給チャネル5の中型の流れによってのトレンチから引き出されている枯草セル チェーンは、確率的に発生する、頻度が少なく、私...

地球上の生命の最も顕著な特徴の 1 つは、偉大な回復力と様々 な。分子生物学の中心的な目標は、細胞の遺伝子そして蛋白質を最大限に使用彼らの成長とさまざまな環境条件下でフィットネス ロジックを理解します。この目標を達成するために科学者が、自信を持ってを確認できる必要がありますどのように個々 の細胞は、成長、分類し、特定の条件セットの下で彼らの遺伝子を表現、細胞がその後の環境の変化に反応する方法注意すること。しかし、微生物学の従来の分析方法は対処できる質問の種類に影響を与える技術的な限界にあります。たとえば、一括文化に基づく分析は長年にわたって非常に有用されているまだ意味のある細胞に変化または総人口の細胞の小さいサブ集団の行動を隠すことができる人口レベルのデータのみを提供します。光顕的観察に基づく生きた細菌の単一細胞解析は単一細胞の挙動を明らかにするも技術的に限られています。細菌成長培地を含む agarose パッドに固定されている通常細胞の成長と分裂の群衆ミクロな視点、、観測時刻1を実質的に制限するちょうど少数の細胞周期後利用できる栄養素を使い果たす 2。さらに、ローカル栄養素の枯渇と細胞増殖による代謝副産物の併用の蓄積は常に測定や予測が難しい方法でローカル セル成長環境を変化します。アガロースのパッドを使用してこのような環境変化の定常状態の動作または成長条件3の特定の変化に対する細胞応答の研究に課題があります。
マイクロ流体技術、微細加工素子を液体培地が継続的に受け渡される古典的な実験的限界への解決策を提供しています。マイクロ流体デバイスを成長媒体の流れは常に新鮮な栄養素と細胞を提供する、均一な成長を作成することにより、余分な細胞と代謝副産物を洗い流しながら、生細胞の顕微鏡検査のための位置に個々 の細胞を保つことができます。環境。一定の成長条件の下で細胞の挙動は細胞の内部ロジックの妨げられていないビューを許可する環境要因の影響から分離して観察できます。流体の流れは、マイクロ流体デバイスを防止細胞と混雑になっているから、数十または数百の世代のための単一細胞系譜の観察可能な4,5になります。このような長い観測時間は、そうでなければ検出できない長期的またはまれな細胞挙動の検出を許可します。最後に、デバイスを流れることができます変更する培地の組成は、細胞ストレスの発症に、導入、または特定の化合物の除去に対応する、観察することができます。
マイクロは、重要なアプリケーションの数をすでに楽しんでいます。例えば、それは組織、器官、または種類の人間の細胞は、生体内での条件6をシミュレートするために共培養体オンチップ デバイスで使用されています微細環境7の線虫の動きの研究のため細菌バイオ フィルム (例えば、 8); 間の相互作用を調べるしてカプセル化と細胞や化学物質 (例えば、 9) の小さなボリュームの操作。マイクロ流体デバイスが物理として特に (優秀なレビューを参照してください10および11) の微生物学の分野でますます人気のあるもになるし、流動性が自然微生物ニッチ12に似合い。例えば、マイクロ流体最近として採用されている微生物によってそのような目的の細胞成長と分裂13,14,15、病原体の動き16の分析を正確に測定監視クォーラム センシング17および生理学的転移18とタンパク質19、他の多くの例の中で数をカウントします。ここで紹介した方法の系統や種の組み合わせではなく、単一の細菌細胞系譜の解析設計されます。ここに示すマイクロ流体デバイスを利用して「マザーマシン」デザインの4細胞が単一ファイルを栽培されて 1 つのバリエーション 1 つクローズド エンドと 1 つのオープン エンド; マイクロ トレンチ内オープン エンドのうち上下にプッシュ子孫細胞成長と分裂をセル流体の流れにします。私たちの分析は、通常、海溝のクローズド エンドに限られている「母」のセルだけに集中します。我々 は以前光顕微鏡ベース単一細胞解析技術、アガロース パッドの細胞固定化などで進歩としてこのメソッドを考慮します。メソッドは他の細菌種に適用もここでモデルとして使用されますが、枯草(大腸菌は別の共通モデル; 異なるセルのサイズや形態のいくつかの種は、新しいデバイスの作製を必要があります異なる寸法)。細胞をマークし、遺伝子発現の変化を可視化する蛍光レポーターの使用遺伝子扱いやすい種の使用が必要です。しかし、細胞の増殖と形態の解析に蛍光マーカーがなくても対応可能です。
現在のプロトコルを除く5; 写真平版は、他の場所で広範囲にわたって記載されているを使用してシリコン マスターを製造する工程マスターズは、微細加工設備から簡単に外部委託も可能です。強化シリコン マスターから PDMS デバイスの成形が含まれていますカバー ガラスの部分にデバイスのボンディングマイクロ流体の入口と出口の配管の組み立て、含むピンチ弁中程度の切り替えを許可するにはデバイスを不動態化、細菌のセルの準備および細菌細胞とデバイスの読み込み配管をデバイスに接続して, 細胞;蛍光顕微鏡イメージングのためにデバイスを読み込みます。多くの別の画像集録および処理ソフトウェア ツールを使用して視覚化および金利4、5のさまざまなデータを分析することができます、例の画像を表示し、画像キャプチャ方法はこのプロトコルには含まれません。

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>(240)4019862</td><td>これはプロトコルではPDMSと呼ばれています。10:1の比率で混合された2つの成分</td></tr>があります <tr><td>0.75mm生検パンチ</td><td>ワールド精密機器</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>22×40mm No.1.5 カバーガラス</td><td>VWR</td><td>48393 172</td><td></td></tr><tr><td>プラズマエッチング PE-50</td><td>プラズマエッチング株式会社</td><td>PE-50</td><td>酸素プラズマ処理を使用してPDMSをガラスに結合するために使用される機器</td></tr><tr><td>Tygonフレキシブルチューブ ID 0.02", OD 0.06"</td><td>サンゴバンPPLコーポレーション</td><td>AAD04103</td><td>チューブの主要部分、例えば針に取り付けられる部分用</td></tr><tr><td>シリコーンチューブ、0.04インチ内径、0.085インチ 外径</td><td>HelixMark 標準シリコーンチューブ</td><td>60-795-05</td><td>ピンチバルブおよびYジャンクション接続用</td></tr><tr><td>牛血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td>不動態化剤として使用</td></tr><tr><td>ARTゲルピペットチップ(P200)</td><td>Molecular BioProducts</td><td>2155</td><td>培地および細胞をデバイスにロードするための</td></tr><tr><td>Acrodisc 32-mmシリンジフィルター、5-&mu;m Supor 膜</td><td>ポール ライフサイエンス</td><td>4560</td><td></td></tr><tr><td>21 ga の鈍い針、1 インチ</td> <td>McMaster-Carr</td><td>75165A681</td><td></td></tr><tr><td>Y コネクタ、200 シリーズ バーブ、1/16 インチ ID チューブ、ポリプロピレン</td><td>ノードソン</td><td>メディカル Y210-6005</td> をロードする前に培養をろ過します 同社は <td>AKA Value Plastics Eclipse</td></tr><tr><td>Ti-E 倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td>ですこのユニットはメーカーによって製造中止になり、Ti 2 Eに置き換えられました。</td></tr><tr><td>LB Lennox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis株 NCIB3610</td><td>Bacillus Genetic Stock Center</td><td>3A1</td><td>野生型の親株は、このプロトコルで示されている実験で使用するために変更</td></tr><tr><td>されました 重力対流オーブン</td><td>VWR</td><td>414005-106</td><td>PDMSを硬化させ、ベーキングするために組み立てられましたデバイス</td></tr><tr><td>スコッチ溶接エポキシキット</td><td>3M</td><td>2216 B / A</td><td>は、シリコンウェーハをアルミニウムバッキングプレート</td></tr><tr><td>スコッチマジックテープ、3/4インチ幅</td><td>3M</td><td></td>に接着するために使用することができます<td>PDMSデバイスからほこりをきれいにし、視認性を高めるために機能の上に置くために(プロトコルで「オフィステープ」または「粘着テープ」と表示)</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ800N</td><td>例としてここにリストされています。ほぼすべての実体顕微鏡は、</td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>W292907</td><td>カバーガラスシ</td></tr><tr><td>リングポンプ、6チャンネル</td><td>ニューエラポンプシステム株式会社</td>をきれいにするために行います。<td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kimwipes Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>ダストフリーワイプのブランド</td></tr></tbody></table>

枯草菌の単一細胞マイクロ流体解析

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

マイクロ流体技術は、微生物学の伝統的な分析手法を制限の多くを克服します。単一セルの解像度との世代の数百に及ぶ時間長い観察併設して大量培養方法とは異なりアガロース パッドを用いた顕微鏡とは異なり厳密に管理することができる均一な生育条件があります。成長媒体の連続的な流れを分離細胞の増殖と代謝、増殖への応答と遺伝子発現の本格的な変化によって引き起こされるローカル化学環境で予測不可能な変化からマイクロ流体デバイスの細胞をから特定の刺激より自信を持って観察できます。枯草を使用ここでは「マザーマシン」を示すモデルの菌種として-細胞解析法を入力します。構築しマイクロ流体デバイスを垂直、細胞でそれをロード、顕微鏡イメージングを開始、1 つの成長媒体から別に切り替えることによって刺激する細胞を公開する方法を示します。ストレス応答の記者は、このメソッドによって得られるデータの種類を明らかにするための例として使用されます。我々 も簡単にさらに実験、細菌の胞子形成の分析などの他の種類のこのメソッドのアプリケーションを議論します。

すべてまたはほぼすべてを含む 1 つまたは複数の細菌細胞 (マイクロ流体側チャンネルの読み込み、デバイス、マイクロ流体配管を取り付ける前に位相差顕微鏡により評価した成功の最初のセルと見なされる3 a を図)。各チャンネル内の複数のセルを表示する最適な読み込みが、チャンネルはそれにもかかわらず平衡期間 (図 3 b) 細胞の増殖により細胞を詰めます。貧しい人々 を読み込むで比較的車線数 (&lt; 50%) チャンネルがセル搭載側は使用されるかもしれませんが、結果のデータ密度が少ないセル血統各画像の位置に描画されるため低くなります。
デバイスが読み込まれる最初、マイクロ流体配管を取り付けると、中を流れる比較的高い 35 μ L/分の流量でデバイスによって平衡です。平衡のステップでは、デバイスから供給チャネルの空気の泡や余分なセルを削除し...

例として枯草菌を使用して個々 の細菌細胞系譜のマイクロ流体解析手法を提案します。メソッドは、しっかりと制御し、均一な生育条件下で細胞世代の何百もの観察を許可することで微生物学の伝統的な分析手法の欠点を克服します。

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

このマイクロ流体実験装置の全体的な目標は、一定で高度に制御された環境条件下で個々の細菌細胞を長期的に観察できるようにすることです。この方法は、ストレスに対する個々の細胞の長期的な応答パターンは何か、集団全体の不均一な表現型が時間とともにどのように変化するかなど、細菌生理学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、一定で均一で高度に制御された環境条件下で、数十世代または数百世代にわたって個々の細胞系譜を観察できることです。テキストプロトコルに従ってPDMSポリマーを調製した後、ポリスチレンペトリ皿の壊れていないアルミホイルにシリコンマスターを置きます。脱気したPDMS混合物をマスターに約5mmの深さまで注ぎます。次に、皿を少なくとも10分間ガス抜きします。PDMSを60°Cのオーブンで少なくとも1時間硬化させ、室温まで冷却します。次に、マスターと硬化したPDMSを含むアルミホイルをプレートから取り外します。丁寧に切り込みを入れ、マスターの裏側からアルミホイルを剥がします。次に、マスターからPDMSを慎重に剥がします。ウェーハとして、通常、わずかに異なる寸法のいくつかのマイクロ流体デバイスが含まれます。清潔で鋭利なメスを使用して、単一のデバイスを適切なサイズにカットします。半透明のオフィステープをデバイスのパターン化された側面に貼り付けて、パターン化された機能の視認性を高めます。入口ポートと出口ポートは、目に見える流体チャネルの両端にある円形の領域として識別されます。パターン面を下にしてPDMSデバイスを裏返し、0.75ミリメートルの生検パンチを使用して、マークされたドットまでデバイスをパンチスルーします。次に、パンチングを捨てます。デバイスからパンチングを取り外すためにピンセットが必要になる場合があります。洗浄して乾燥させたカバーガラスとPDMSデバイスを酸素プラズマクリーナーに挿入し、ここに示す設定でデバイスをプラズマ処理します。プラズマ処理が終了したらすぐに、デバイスを取り外し、プラズマクリーナーからガラスを覆います。PDMSを反転させ、パターン面がガラスに接触するようにカバーガラスの中央に置きます。供給チャネルがカバーガラスの長いアクセスと位置合わせされていることを確認してください。PDMSがガラスに対して密閉されるように、非常に静かに押し下げます。組み立てたデバイスを摂氏60度のオーブンで少なくとも1時間焼きます。ベーキング後、デバイスの片隅を軽く押して、PDMSがガラスに接着されていることを手動で確認します。テキストプロトコルに従ってポリマーチューブを切断した後、ピンチバルブのY字型ジャンクションを組み立てます。使用する場合は、Y字型の上部のとげに2センチメートルの長さのフレキシブルシリコンチューブを切断して取り付け、Y字型の下部のバーブに1センチメートルの長さのシリコンチューブを取り付けます次に、10センチメートルの長さのポリマーチューブを切断し、1センチメートルのシリコンチューブセグメントに挿入して、一端をスイッチジャンクションに接続します。Y.もう一方の端にあるチューブの長さを、プラスチック製のシリンジアダプターから取り外し、針の端から約90ミリメートルに約90度曲げた9ゲージの針に接続します。21ゲージの鈍い針を、注射器からスイッチ装置まで走るチューブセグメントの一方の端に、針をチューブに挿入して接続します。各長さのチューブのもう一方の端を、Y字型ジャンクションのインレットバーブにあるシリコンチューブセグメントに挿入します。シリンジにBSAを添加した細菌増殖培地を充填した後、テキストプロトコルに従って、ロードされたシリンジを準備した21ゲージの針に接続し、インレットチューブに取り付けてシリンジをシリンジポンプにロードします。シリンジポンプを高流量で運転し、シリンジポンプを垂直に向け、シリンジを軽くたたいて気泡を上部に持ってきて、入口配管から空気をパージします。シリンジから空気がパージされたら、シリンジポンプを水平に置き、シリンジからポリマーラインをスイッチ装置を通じて徐々にタップまたはフリックして、気泡を取り除き、パージします。メディアを切り替える場合は、シリンジの 2 番目のバンクに対してこのプロセスを繰り返します。気泡がパージされた後、フェーズ2シリンジポンプを毎分1.5マイクロリットルに設定し、フローを一時停止します。第 2 中相に対応する Y 字型ジャンクションの分岐部にあるフレキシブル チューブのセグメントに小さなバインダー クリップを配置し、フェーズ 1 ポンプを運転し続けて、Y 字型ジャンクションの下流にある第 2 媒体をパージします。PDMSデバイスをロードするには、まず、空の薄いゲルローディングマイクロピペットチップをマイクロ流体デバイスの出口穴にそっと挿入します。P200マイクロピペットで細いゲルローディングチップを使用して、1ミリグラム/ミリリットルのBSAを含む媒体を入口穴に注入し、チップと出口穴を観察してマイクロ流体チャネルの充填を監視することにより、デバイスを不動態化します。デバイスを室温で約5分間インキュベートします。次に、同様のチップを使用して、アウトレットチャネルのチップを使用して各チャネルに再懸濁されたセルをロードし、デバイスを介したセルの進行状況を監視します。ゲルローディングチップを出口穴からそっと取り外し、デバイスの損傷を防ぐために一度に1つずつ作業します。適切なローターアダプターのベンチトップマイクロ遠心分離機で、約6, 000回gで10分間遠心分離します。顕微鏡下で、デバイスをスライドホルダーステージインサートに固定せずに、正常にロードできることを確認します。PDMSの両側にあるカバーガラスをステージインサートの下部にテープで留めて、ロードされたデバイスをステージインサートに慎重に取り付けます。ステージインサートデバイスアセンブリを反転させてPDMSが上を向くようにし、ほこりのないワイプなどの柔らかい面に置きます。フェーズ1シリンジポンプの流量を毎分35マイクロリットルに調整します。次に、一度に1レーンずつ作業し、入口針を挿入し、次に廃棄物ビーカーに走る出口針を挿入します。デバイスの漏れを目視で検査した後、アウトレットチューブを調べて、中メニスカスに濁った縞模様として現れる余分なセルの外観を確認します。装置が約15分間稼働したら、フェーズ1シリンジポンプを毎分1.5マイクロリットルに設定し、流れを一時停止します。ポンプとデバイス装置全体を倒立型蛍光顕微鏡に持ち込み、フェーズ1の媒体流を毎分1.5マイクロリットルで再開します。デバイスを備えたステージインサートを顕微鏡に慎重に取り付け、必要に応じてテープを使用してインレットチューブとアウトレットチューブを配線します。イメージング用のデバイス上の適切な位置を特定し、必要に応じてイメージングを開始します。細胞は通常、定常状態の指数関数的な成長を読み取るのに数時間を要し、画像取得の開始を必要に応じて遅らせることができるので、平衡化期間後にイメージングが開始されることに注意してください。イメージングの連続するラウンド間で媒体を切り替えるには、フェーズ1シリンジポンプの流れを一時停止し、フェーズ2シリコンチューブからバインダークリップを慎重に外し、それぞれをYジャンクションのフェーズ1ブランチのシリコンチューブに移動し、フェーズ2シリンジポンプの流れの一時停止を解除してイメージングを続行します。位相差顕微鏡法で評価すると、マイクロ流体配管をデバイスに取り付ける前に、マイクロ流体サイドチャネルのすべてまたはほぼすべてに1つ以上の細菌細胞が含まれていれば、初期細胞ローディングは成功したと見なされます。デバイスが最初にロードされると、比較的高い流量で平衡化されます。ここに示すように、平衡化したデバイスを顕微鏡で検査すると、ほとんどのサイドチャネルで1つのファイルに閉じ込められたいくつかの細胞が明らかになるはずです。平衡化したデバイスを摂氏37度で毎分1.5マイクロリットルの流れ下で顕微鏡に置くと、細胞は約2時間にわたって均一で一定の指数関数的な相成長を再開します。指数関数的な成長を再開した細胞は、明視野顕微鏡または蛍光顕微鏡を使用して少なくとも24時間確実にイメージングできます。培地スイッチを導入することで、実施できる実験の範囲が広がりますが、入口に気泡や細胞クラスターが存在することで、壊滅的な細胞死イベントの頻度も増加します。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、約5時間で完了します。この手順を使用することにより、さまざまな蛍光レポーター、菌株、および環境条件で、非常にまれなイベントや一過性のイベントを含む、さまざまな生理学的現象を調べることができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、上皮細胞や細菌の同時およびローカライズされた文化のためのマイクロ流体の共培養モデルを説明します。このモデルは、推定されるプロバイオティクス菌株の有効性を病因の異なる水溶性分子シグナルの役割を調べるだけでなく、画面に使用することができます。...

マイクロ流体可溶性シグナルを介した相互作用を調査するために上皮細胞や細菌の共培養

このプロトコルは、自動化された蛍光タイムラプス顕微鏡を用いて時間の異なる細菌の単セルの動作を監視するためにステップバイステップ手順を提供します。さらに、我々は、顕微鏡画像を分析する方法のガイドラインを提供します。...

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

微生物のバイオフィルムは、一般的に特殊化した細胞の異なる集団によって構成されています。これらの集団の単一細胞解析では、蛍光レポーターを使用する必要があります。ここでは、いくつかのsubpopulationswithinを視覚化し、監視するためのプロトコルについて説明します。...

の単一細胞解析枯草菌</em蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて>バイオフィルム

我々は最近、単純な細菌検出用蛍光アッセイを "ミックス·アンド·読む"を設定するために適用できる蛍光DNAザイムプローブを生成するための斬新なアプローチが報告されています。これらの特殊なDNAプローブは、それによって蛍光シグナルの生成に細菌検出を翻訳する特定の細菌によって産原油の細胞外液（CEM）の存在下で発色団修飾DNA-RNAキメラ基質の切断を触媒する。本報告では、特定のDNAザイムプローブは、...

蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

出典: Pioli、R.、 et al.、 シーケンシャルキャピラリティアシストアセンブリによる微生物と微粒子のパターニング。 J. Vis. 経験。 (2021年)このビデオでは、カーボンフリー懸濁液と制御されたフローを使用して、マイクロ流体トラップで単一の蛍光タグ付き 大腸菌(大腸菌)...

マイクロ流体パターニングと蛍光に基づく単一細胞細菌増殖の追跡

出典:ケイビーン、M. T.らバチルス・サブティリスの単細胞マイクロ流体解析。J. Vis.

マイクロ流体システムにおける細菌増殖を単細胞分解能で追跡

このプロトコルでは、原核微生物のシングルセル分析のためのマイクロ流体ピコリットルバイオリアクター(PLBR)の製作、セットアップ、および基本的な操作が紹介されています。工業的に関連性のある微生物を原理の証明として分析し、従来の方法では不可能だった特定の期間の成長率、形態、表現型の不均一性についての洞察を可能にしました。...

微生物シングルセル解析のためのマイクロ流体ピコリットルバイオリアクター:作製、システムセットアップ、操作

このプロトコルは、単一細胞および細胞集団レベルでのストレス条件下での細菌増殖の時間分解された記述を可能にする。...

ストレス治療下での細菌増殖の多スケール分析

細菌細胞のイメージングは、大きな高分子機械の機能を決定する静的および動的プロセスの定義に焦点を当てた新しいシステム生物学アプローチです。ここでは、定量的ライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の統合により、レジオネラ菌型肺炎球体系IV型分泌系のアーキテクチャと機能を研究しています。...

レジオネラ肺球菌ドット/Icm分泌系の空間的特徴を解決するためのライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の適用

抗生物質の持続性は、敏感な同質遺伝子集団内の小さな亜集団が高用量の殺菌性抗生物質に一時的に耐える能力を表します。.本プロトコルは、 大腸菌...

大腸菌における抗生物質持続性の集団および単一細胞解析

このプロトコルは、フローサイトメトリーとカウントビーズを使用して、エチジウムブロマイドで標識された細菌胞子を定量化することに焦点を当てています。この方法は、無傷の胞子の表面におけるタンパク質の共有結合を分析するのにも効率的です。...

フローサイトメトリーにおける 枯草菌 胞子の計数と標識解析の改善

学ぼう、Bacillus subtilisを用いた単一細胞マイクロ流体解析法。厳密な環境制御下で細菌の系統を長期観察し、ストレス応答や表現型変動を研究する強力な技術です。

枯草菌の単一細胞マイクロ流体解析

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