X 線間のクロストークを解析のための共培養法照射 caco-2 細胞と PBMC

X 線照射したカコ 2 および末梢血単核球 (PBMC) 間のクロストークを調査するためのプロトコルを提案します。プロトコルはカコ 2 照射と PBMC; と共培養のセットアップから始まります。その後、上皮細胞の電気抵抗は、カコ 2 と PBMC の両方で実行 48 h および西部のしみを定期的に測定されます。

この共培養プロトコルの全体的な目標は、末梢血単核細胞の存在下または非存在下でのCaco-2上皮細胞単層透過性およびタイトジャンクション機能に対する電離放射線の影響を測定することです。この方法は、電離放射線被ばくと免疫細胞機能との間の相乗効果の可能性について、放射線生物学および放射線免疫療法の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、アドホックな補完測定を通じて、さまざまな刺激と細胞集団をテストし、分離された現象を観察できることです。

放射線治療は、Caco-2細胞単層を腫瘍体積に適切なビームと正確な線量測定で照射することを目的としています。彼らの照射の1週間前に、2ミリリットルの完全培地中のCaco-2細胞を5回10〜5回、6ウェルの細胞培養プレート内のウェルあたり1マイクロメートルの細孔径の細胞培養インサート1つの滅菌に播種します。各ウェルの底部コンパートメントに3ミリリットルの新鮮な完全培地を加え、細胞を摂氏37度、5%Co2の加湿細胞培養インキュベーターに7日間置きます。

インキュベーションの最終日に、50ミリリットルの円錐管に25ミリリットルのFicollを追加します。そして、採取したばかりの全血25ミリリットルをFicollの上に慎重に重ねます。密度勾配遠心分離により細胞を分離します。

また、パスツールピペットを使用して、界面の末梢血単核細胞またはPBMCを新しい15ミリリットルの円錐管に移します。次に、分離されたPBMCを2回の10ミリリットルPBS洗浄で洗浄します。そして、PBMCを新鮮な完全培地で細胞培養インキュベーター内で3〜5時間以内培養します。

光子X線エネルギーを6メガボルトのピークに設定します。そして、Caco-2細胞培養物をX線の軌道内、放射線源から100cmの厚さのプレキシガラスシートの上に置きます。次に、各サンプルに厚さ0.57センチメートルのボーラスを配置して、後方散乱放射線成分と荷電粒子の平衡を確保します。

また、平坦で対称的な20×20平方センチメートルの放射線場と毎分3グレイの線量率を使用して、細胞に放射線を照射します。Caco-2細胞の代謝活性と生存率を評価するには、24ウェルプレートの各ウェルに1.25ミリリットルの完全培地を照射する24時間前に、24ウェルプレートの各ウェルに10回から5番目のCaco-2細胞を2回播種します。その後、細胞を細胞培養インキュベーターに21時間戻します。

翌日、各ウェルに5ミリグラム/ミリグラムのMTT溶液を100マイクロリットル加え、さらに3時間細胞をインキュベートします。細胞を1ミリリットルのPBSで洗浄した後、各ウェルに500マイクロリットルのジメチルスルホキシドを加えてCaco-2細胞から放出されたホルマザン結晶を溶解し、570ナノメートルのラムダでマルチウェルプレートリーダーで吸光度を評価します。Caco-2細胞の生存率を評価するには、ウェルあたり1ミリリットルのPBSで細胞を洗浄し、その後、100マイクロリットルのトリプシンEDTA溶液で37°Cおよび5%CO2で2分間

500マイクロリットルの完全培地で反応を停止し、細胞を個々の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移して遠心分離します。チューブあたり50マイクロリットルのPBSにペレットを再懸濁し、得られた細胞懸濁液を等量のTrypan Blue生存率色素溶液と混合します。室温で3分後、血球計算盤で未染色の生存細胞と染色不能な生存細胞の数を数えます。

Caco-2細胞の経上皮電気抵抗またはTEERを評価するために、照射直後にCaco-2細胞培養物の半分を各ウェルに3ミリリットルの新鮮な完全培地を入れた新しいプレートに挿入し、挿入培養物の半分をウェルあたり完全培地3ミリリットルあたり6番目のPBMCに10回播種した新しいプレートに挿入します。次に、最初の6時間は1時間ごとに、その後は照射後48時間まで3時間ごとに、TEER箸電極を細胞培養インサートに挿入します。ウェスタンブロット解析では、照射後48時間後に、Caco-2細胞およびPBMCを1×10あたり40マイクロリットルで細胞溶解バッファーの6番目の細胞に

Caco-2細胞を溶解および掻き取るときは、多孔質膜がインサートから剥がれないように注意してください。溶解した細胞サンプルは、マイナス20°Cで保存します。ビシンコニン酸法により各細胞溶解サンプル中の総タンパク質量を定量した後、β-メルカプトエタノールを添加したLaemmliサンプルバッファーを、個々の微量遠心チューブ内の各総タンパク質サンプルに同量加えます。

サンプルを摂氏95度で5分間加熱します。次に、変性したタンパク質を遠心分離で回収し、各サンプルから同量のタンパク質を4〜20%のプレキャストゲルにロードします。サンプルを120ボルトで1時間実行します。

次に、セミドライ電気転写システムを使用して、タンパク質をポリフッ化ビニリデン膜に転写します。次に、メンブレンを容器に入れ、0.2%Tween 20を添加したPBS中の5%脱脂粉乳で非特異的結合部位を室温で60分間、穏やかに攪拌しながらブロックします。ブロッキングインキュベーションの終了時に、10ミリリットルの0.2%PBS Tween 20で1回の洗浄につき5分間メンブレンを3回洗浄し、適切な目的の一次抗体でメンブレンを室温で1時間穏やかに攪拌しながら標識します。

摂氏4度で一晩インキュベートした後、穏やかに攪拌しながら、先ほど示したようにメンブレンを0.2%PBS Tween 20で3回洗浄し、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体とメンブレンを室温で60分間静かに攪拌しながらインキュベートします。PBSを3回洗浄した後、強化化学発光溶液キットでメンブレンをインキュベートします。次に、適切なスキャンシステムで結果のフィルムを画像化し、適切な画像分析プログラムで結果を定量化します。

10グレイまでの照射は、照射後24時間または48時間でCaco-2細胞の代謝活性を変化させませんが、細胞の生存率は両方の用量で時間とともに低下します。2つのグレイの照射に曝露した後の非共培養Caco-2細胞のTEER評価では、照射後48時間まで一貫したTEER値が明らかになります。しかし、10グレイの照射後、細胞は照射後3時間でTEERの長期にわたる減少を示します。

PBMCとの共培養は、両方の用量で照射後3時間から照射後30時間まで明らかなTEERの減少をもたらし、その時点でTEER値は比較的一貫しているように見えます。タイトジャンクションタンパク質のウェスタンブロット解析では、照射および/またはPBMC共培養に応答したClaudin-1またはOccludinの発現に違いは見られませんが、さまざまなスカフォールドタンパク質で大きな変動が観察されます。さらに、NF-κB総タンパク質はどちらの照射線量でも影響を受けませんが、XIAPタンパク質レベルは両方の線量で4倍にアップレギュレーションされます。

この手順を使用して、腸内細菌のような他の生物学的刺激を追加して、電離放射線被ばくに対する良好な単分子膜の応答を異なる生物学的刺激がどのように変更できるかについての追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、電離放射線と免疫細胞がCaco-2細胞の透過性とタイトジャンクション複合体の発現に及ぼす影響を測定する方法について十分に理解できるはずです。