Name: X 線間のクロストークを解析のための共培養法照射 caco-2 細胞と PBMC (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: 学ぶX線照射Caco-2細胞とPBMCの共培養法。上皮細胞の透過性とタイトジャンクション機能をTEER測定とウェスタンブロットで48時間評価し、放射線生物学と放射線免疫療法の相乗効果を解明する。

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イタリア語研究所核物理 (INFN) の部分的マニアック子午線プロジェクトを通じてこの仕事の資金。著者がマニアック子午線プロジェクト調整; 教授エドアルド ・ Milotti (イタリア、トリエステ大学物理学部) を認める博士ロベルト Chignola (バイオ テクノロジー学科、ヴェローナ大学、イタリア)、オーム、caco-2 細胞を提供するため、彼の貴重なヘルプとトレーニング。我々 はまたテクニカル サポート Agnese ソラリを認めます。

次のプロトコルは、健常人血中撤退を含まれます。ドナーには、入学前に書面によるインフォームド コンセントが用意されています。この手順はヘルシンキ宣言に従って、血引き出し専門の医療アシスタントによって実行されていました。
1. 細胞培養と培養セットアップ
<ol><li>1 週間、照射前に、mL の 10% 牛胎児血清 (FBS)、2 ミリメートル L グルタミン、100 U/mL ペニシリンと 100 μ g/mL ストレプトマイシンと新鮮な RPMI1640 培/2.5 × 105細胞を含む細胞懸濁液カコ 2 を準備します。</li>
	<li>種子滅菌 1 μ m 孔径細胞培養の細胞懸濁液 2 mL 6 ウェル プレートの挿入、挿入 6 ウェル プレートに。 注: セル文化挿入は、培養細胞の播種前に完全培地滅菌でアクティブにする必要があります。この場合、文化メディアを破棄され、細胞懸濁液媒体を交換する必要があります。</li>
	<li>10 %fbs、2 mM L グルタミン、100 IU/mL ペニシリン各下部コンパートメントの 100 μ g/mL ストレプトマイシンと新鮮な RPMI1640 培の 3 mL を加えるし、5% CO2を含む加湿雰囲気のインキュベーターで 37 ° C で培養します。</li>
	<li>カコ 2 細胞照射の同じ日、市販リチウム ヘパリン コーティング 6 mL チューブでひと全血を収集 (チューブのサイズ: 13 × 100 mm)。</li>
	<li>その後、Ficoll のグラデーションを用いた末梢血単核球 (PBMC) を分離します。50 mL の円錐形遠心管と層全血の等量で Ficoll の 25 mL を入れ、PBMC を分離 Ficoll サーフェイス RPMI1640 と 1:1 希釈。 注: 通常健康なドナーは通常約 4-10 × 10 6/mL の PBMC を持っています。</li>
	<li>室温で 30 分間 400 x g で 50 mL のチューブを遠心します。</li>
	<li>優しく Ficoll とプラズマのパスツール ピペット吸引により界面 PBMC を収集し、15 mL の円錐管に入れてください。</li>
	<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 mL を追加し、PBMC を 10 分間 250 × g で遠心分離によって 2 回、PBMC を洗います。</li>
	<li>文化 PBMC T25 で 3-5 h の最大の cm2フラスコで完了 RPMI1640 媒体、37 ° c 5% CO2を含む加湿雰囲気で、前に説明したよう。 注: は、実験の日に PBMC を収集し、シード 2 × 106細胞/ウェル、3 mL の共培養の底部のコンパートメントで、完全の RPMI1640 培で中断します。Caco-2 細胞を挿入は、その照射後 PBMC 含む井戸 30 分で転送されます。全血から収集した PBMC できない以上約 72 時間、文化で維持されない例えば刺激。な (PHA) は、細胞の生存率が失われました。 注意: すべての血液や血液製剤の安全性と品質は、プロセス全体を通して保証されなければなりません。</li>
</ol>2. 照射設定
注: caco2 細胞の照射は、異なったタイプの癌を治療するために定期的に使用される線形加速器の Istituto ・ ディ ・ Ricovero 電子クーラ Carattere Scientifico (IRCCS) s ・ モージュ (パヴィア、イタリア) の放射線治療部門で行われました。
<ol><li>6 MV ピークに光子 x 線エネルギーを設定します。線形加速器パルス政権で動作 (4 ms の約 2 つの連続したパルス間の時間; 線量で 5 μ s の単一パルスの期間率は最大 1 × 10-3 Gy/p)。</li>
	<li>カコ 2 1.4 cm 厚プレキシ グラス (使用される放射線の蓄積よりも少し大きな距離に対応する) でシート 100 cm 放射の源からの x 線の軌道上の挿入を含む 6 ウェル プレートを配置します。</li>
	<li>照射の前に後方散乱放射成分と荷電粒子平衡を保証する各サンプルに 0.5 cm の厚さの塊を配置します。</li>
	<li>セルに照射 (2-10 Gy の範囲で用量) フラットと対称 (± 2%)20 × 20 cm2放射フィールド、3 Gy/分の線量率。 注: 制御「シャム」-照射細胞照射室に入ることがなく、照射物の同じ手続き型条件を施行した (受け取られた線量: 0 Gy)。 注意: 電離放射線を生み出す装置は専門スタッフによってのみ使用する必要があります。</li>
</ol>3. セル実行可能性の試金 (MTT の試金)
注: カコ 2 細胞代謝活性は 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ブロマイド (MTT) アッセイ14によって評価しました。
<ol><li>シード 2 × 105カコ 2 24 ウェル プレート 24 h で 1.25 mL の完全培地の照射前に。</li>
	<li>2.1 2.4 の手順で説明するよう細胞に照射し、37 ° c 5% CO2を含む加湿雰囲気で細胞をインキュベートします。</li>
	<li>照射後 21 h を 5 mg/mL の MTT 溶液を 100 μ l 添加し、37 ° c 3 時間 5% CO2を含む加湿雰囲気で細胞を維持します。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、1 ml の PBS のセルを洗浄してください。</li>
	<li>各ウェル内のジメチルスルホキシド (DMSO) 500 μ L を追加することで塩の結晶を溶解し、λ のウェル プレート リーダーで吸光度を評価 = 570 nm。</li>
	<li>照射後ステップ - 3.3 3.4 3.5-3.6 45 h を繰り返します。 注: 結果は、100% に正規化された対応する偽状態から摂動として表示されます。 注意: DMSO は引火しやすいおよび刺激剤皮膚、目、呼吸器系 (GHS07、GHS08 です)。目に接触した場合豊富な水で十分に洗い流して、医師の診察。MTT は、皮膚、目、呼吸器系 (GHS07、GHS08) の刺激剤です。目に接触した場合直ちに多量の水で洗浄し、医師の診察。</li>
</ol>4. 生菌測定 (トリパン ブルー色素排除試験) の割合
注: 実行可能な細胞の割合は、トリパン ブルー色素排除法によって評価されました。
<ol><li>シード 2 × 105カコ 2 24 ウェル プレート 24 h で 1.25 mL の完全培地の照射前に。</li>
	<li>0 の範囲内の用量で細胞を照射 - 10 Gy (手順 2.1 2.4 参照)、37 ° c 24-48 h の 5% CO2を含む加湿雰囲気でセルを孵化させなさい。</li>
	<li>2 つの選ばれた時ポイント、PBS のセルを洗浄して、それを破棄し、トリプシン エチレンジアミン edta 溶液を 100 μ l 添加します。37 ° C でセルを入れて 2 分間 5% CO2を含む加湿雰囲気し、酵素反応を阻止する完全培地を追加します。</li>
	<li>1.5 mL チューブに細胞を収集し上澄み 500 x g で 5 分間破棄でチューブを遠心し、50 μ L の PBS のセルを再停止します。</li>
	<li>細胞懸濁液を混ぜてトリパン ブルー色素溶液を 50 μ l 添加し、室温で 3 分間混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>ステンド_グラス カウント (現実的な) Bürker 室 (実行可能な) セルを無染色。</li>
</ol>5. トランス上皮電気抵抗 (TEER)
<ol><li>シード 5 × 105カコ 2 セル 6 ウェル プレートに照射する前に 1 週間共培養 (ポリエチレンテレフタラート (PET) 2 x 106毛穴/cm2) の挿入。</li>
	<li>照射直前に 1 h を測定電圧計/オームと TEER。</li>
	<li>手順 2.1 2.4 では、細胞を照射します。</li>
	<li>37 ° c 5% CO2を含む加湿雰囲気で PBMC 共培養の有無で caco-2 細胞を孵化させなさい。</li>
	<li>最初数時間後照射測定 TEER 毎の時間とその後 48 時間まですべての 3 h。</li>
</ol>6. 西部のしみのクローディン 1、オクルディン、Afadin、ZO 1、ZO-2 の解析、Nf-kb など XIAP
<ol><li>シード 5 × 105セル 6 ウェル プレート共培養における x 線暴露の前に 1 週 (ペット、2 × 106毛穴/cm2) を挿入し、手順 2.1 2.4 で説明されているように細胞を照射します。</li>
	<li>37 ° c 5% CO2を含む加湿雰囲気で PBMC 共培養の有無で caco-2 細胞を孵化させなさい。</li>
	<li>照射後 48 h 準備カコ 2 と PBMC セル lysates セル換散とセルを扱うことによってバッファーに格納し、-20 ° C で試料を保存 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
	<li>ビシンコニン酸 (BCA) 法による総蛋白量を定量化します。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
	<li>総蛋白の同量を混ぜて β-メルカプトエタノールを追加 Laemli サンプル バッファー (β-メルカプトエタノールの最終濃度は 5%)、95 ° C、5 分でサンプルを加熱し、10,000 x g でそれらをスピンします。</li>
	<li>ロード 4-20% のサンプルはゲルをプレキャストし、polyvinildiene ビニリデン (PVDF) 膜の 1 h. 転送蛋白質の 120 V で電気泳動を行います。</li>
	<li>5% 脱脂乾燥したミルク (NFDM) PBS の 0.2% に追加で室温で PVDF 膜の孵化によって非特異的結合部位をブロック トゥイーン 20 (PBT)。0.2 %10 mL で 3 回膜を洗って 5 分 PBT です。</li>
	<li>次の一次抗体の 4 ° C で一晩に配置されている前に室温で 1 時間穏やかな攪拌と膜を孵化させなさい: 反クローディン 1、アンチ ZO 1、アンチ ZO 2、反 afadin、アンチ オクルディン、抗 NF kB、アンチ XIAP、および抗アクチン。0.2 %10 mL で 3 回膜を洗って 5 分 PBT です。</li>
	<li>穏やかな攪拌と室温で 1 h の西洋わさびペルオキシダーゼ HRP 標識二次抗体と膜を孵化させなさい。0.2 %10 mL で 3 回膜を洗って 5 分 PBT です。</li>
	<li>常温で強化された化学発光キットと膜の孵化によって写真フィルムを開発します。</li>
	<li>写真フィルム スキャン システムを取得して適切な画像解析ソフトで得られたバンドを定量化します。 注: ZO 2、ZO-1 Afadin Occludin クローディン 1 の評価は、caco-2 細胞で実行されます。PBMC で Nf-kb など XIAP の評価を行います。 注意: β-メルカプトエタノールは有毒である (GHS05、GHS06、GHS08、GHS09)。蒸気を呼吸に、環境への放出を避けることし、個々 の保護デバイスと呼吸用保護具を着用しません。飲み込んだ場合は、すぐに医学的なアドバイスを求めます。</li>
</ol>7. 統計解析
<ol><li>放射線被ばくと共培養が統計的に有意な摂動を誘発するかどうかを確認するのに繰り返し測定のため (ボンフェローニ事後テストを比較するとの双方向の分散分析 (ANOVA) 多重比較テストを実行する.複製を意味)。</li>
	<li>記載のない場合は、2-スチューデントの両側 t 検定で有意 (p) を計算します。各値は、3 の独立実験 ± 標準誤差の意味 (SEM) の平均値です。</li>
</ol>

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</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

先進国での発生が高いの大腸がんは、罹患率と死亡率、人口の最も頻繁な原因の一つです。それは通常、手術、化学療法、および放射線治療1によって管理されます。放射線治療の枠組みでの注目は、健康な組織の露出4の効果に与えられなければなりません。また、放射線被曝と免疫システムの関係に関する分類学的研究、ラジオ免疫療法3のアプローチを開発のための基礎。
この作品で採用する方法論は、caco-2 細胞と PBMC クロストークの調査に調整されています。我々 は腫瘍細胞の x 線暴露の影響に焦点を当てたが、同じプロトコルが薬理学的エージェントを用いた研究に適応することができます。標準的な細胞培養に関する生理学的な条件に近いが、このメソッドの強力な利点は複雑なシステムでは、異なる種類の細胞とのリリースの両方を分析の可能性を与えられたの完全切除の可能性シグナル分子自体共培養の 2 つのコンパートメントに。このように、日常的に応用生物学的方法は携帯関連のメカニズムを相互作用の理解を助けることができます。
Caco-2 細胞に対する X 線照射効果の初期特性が 2 つの相補的な測定に基づいていた、すなわちMTT 比色定量法とトリパン ブルー色素排除試験。これらの 2 つの試金の別の焦点によって、外見上矛盾した結果を説明できます。MTT は、トリパン ブルーの染料は、生きている細胞の排除色素メカニズムに基づいている間、酸化還元酵素の酵素活性を評価します。
カコ 2 PBMC の相互作用の調査には、上皮性単分子膜共培養の 2 つのコンパートメント間の完全な分離につながることができるの作成が必要です。共培養挿入 caco-2 細胞を播種の可能性によりこの細胞集団のみの照射ができます。照射後共培養を開始、以来、PBMC の任意の偶発的な暴露のためのバイアスはありません。6 ウェル プレート他挿入の動きの時に、細胞膜に必要して損傷 (または汚染) を避けるために慎重に処理するこのセットアップ。慎重に実行されると、TEER 測定、単分子膜の透過性を調べるシンプルかつ非侵襲的な方法です。この試金は厳密に共培養セットアップに関連し、単分子膜の透磁率の調査のための唯一の選択肢ではないです。それは新鮮な完全培地によく校正されて一度対策の良い再現性をことができます。一般的な試金 1 つ下「基底」に上部「頂」コンパートメントから化学染料の普及に焦点を当てる (例:かに (FITC)-デキストラン アッセイ)16。ただし、PBMC が本研究の基底外側コンパートメントに存在するので、実験化学試薬の導入を避けるためにしました。
この作品で採用した別のテクニック、TEER 測定のみである共培養セットアップ17,18を必要とします。ただし、他の一般的な実験技術は細胞の培養に適用するセットアップ生理に近い条件の調査をようにデータより強い生物学的意義があるとより有益な結果を提供します。その一方で、多孔質支持体上に成長した細胞の使用は西部にしみが付くことによって分析される細胞抽出物の調製のためのセル換散などのサンプルを準備するために必要な操作のいくつかの困難につながることを注意しなければなりません。
本研究で採用システム改良、例えば物質の細胞外マトリックスの環境を再作成することができるアプリケーションとさらにする可能性があります。これはまた、システムの複雑さの増加になり、セットアップの完全な郭清は達成するが難しくなります。
細胞培養のためのセットアップは確かに生体外で研究の進歩のため、複雑なシステムを理解するための強力なツールを表しています。このテクニックは基礎研究への新しい入力を提供する分子シグナルと免疫システムの枠組みの中の活動の変調可能なアプリケーションの基本的なメカニズムに知識を増やす可能性を秘めてください。腫瘍臨床患者管理。

今回採用した方法論は、大腸癌細胞と通常の 2次元細胞培養と比較して生理的状態に近いセットアップを利用する免疫システムの間の相互作用を調査するため設計されました。
大腸癌 (CRC) は、第三に最も頻繁なタイプの癌、以上 100 万世界中のケースのと (グローバルがん天文台、癌、世界保健機関、http://gco.iarc.fr の研究のための国際機関) と見なされます。CRC の管理は、手術、化学療法や放射線療法の1によって日常的に行われます。手術や化学療法のような侵襲的な技術と比較して、放射線治療は、主に、放射線のローカライズされた配信のおかげで、これらの臨床的アプローチから派生する典型的な有害な全身反応を回避します。しかし、周囲の健康な組織に健康な細胞への直接作用と非ターゲット効果2,3、4を介した損傷炎症をトリガーに副作用が生じる。大腸癌治療中の照射による副作用を中心に、2 つの側面は調査する必要があります。まず、腸の不浸透性の原因である機構は、ターンでは、細菌の人口の変更された原子格納容器および分子と溶質の傍細胞通過による副作用の可能性を引き起こす放射の配達によって変更できます。第二に、腸管関連リンパ組織 (GALT) の存在は、細菌の増殖を制御して、全般的な免疫応答5,6,7を仲介することの機能を免疫システムの前哨基地として機能します。これらの機能を果たすためには、細胞の膜の複合体の作用により腸の不浸透性が保たれます。これらの理由から、x 線の異なる投与量により誘導される有害な結果で調べた caco-2 細胞単独でそして PBMC と共培養。
細胞培養の研究は生物医学研究における調査の最初 setline が、異なる種類の細胞の細胞生物学および相互相互作用を駆動メカニズムの詳細な知識の欠如が重大になるとき臓器、システム、および実験室で簡単に再作成できない器具の生理学の研究に近づいています。したがって、我々 は一緒に 2 つの細胞集団の研究と細胞間および細胞のメカニズムに関連する側面の郭清可能共培養セットアップを採用すること。
培養は、上皮の機能と異なる種類の細胞間の相互作用を学ぶとき悪用手法です。特に、上皮の極性によって特徴付けられる細胞から成っているので、このような技術の使用は我々 の場合に必須になります。腸管バリアの場合腸を示す根尖との明確に定義された分極と基底のポールは通常タイトな接合を作成する接着分子の存在のために区切られました。この区画は、人身売買と断固とした分子のみ通行許可は傍細胞を避け、組織生理学に必要です。この機能は、もちろん正常なセットアップを培養細胞で再現することが可能。さらに、共培養セットアップの採用は、頂端表面 (腸管に対応) はありませんが他の細胞と接触して直接基底面でのみ免疫細胞の存在を再現します。
最近、カコ 2 細胞は腸粘膜バリアーの生体外モデルとしてより重要性を得た。ひと大腸癌由来、caco-2 細胞分化機能を維持、作成機能偏光膜8、共培養挿入で育てられたとき細胞膜特性の調査を可能にします。
カコ 2 養殖多孔質膜上腸管膜の老舗の in vitroモデルですが、以来、改善はカコ 2 と他の細胞との共培養をされています。この設定は、頻繁に採用されているメジャー間クロストーク タイプ9セルし、カコ 2 を解明するため摂動カコ 2 単独で培養に関しての共培養の外因性の刺激への応答。
多くの研究は、カコ 2 を対処している動作と両方の非病原性細菌の共培養と末梢血単核細胞、特に免疫システム10のクロストークを明らかにします。ポソ ルビオら11は、ビフィズス菌 caco-2 細胞を刺激することで炭酸カルシウム-2/PBMC 培養でいくつかのサイトカインの発現を検討しました。自分の仕事には、PBMC の有無で細菌の刺激によってサイトカイン発現プロファイルに実質的な変更が強調表示されます。その結果は、ビフィズス菌に PBMC の存在がカコ 2 の感受性を高めるという結論に導きます。
Caco-2 細胞の非病原性と病原性細菌に対する異なるは、異なる研究チームによって評価されています。Parlesakら。12は、大腸菌に対する caco-2 細胞の免疫抑制効果を実証-PBMC を刺激します。また、ハラーら。13腸管病原大腸菌属または非腸管病原細菌に関する大腸菌属、caco-2 細胞両方のリポ多糖 (LPS) の刺激の応答を検討した乳酸桿菌属、強化、caco-2 細胞の応答厳密に共培養セットアップ中の白血球の存在に依存するいると推測します。
別の相補的な研究所の試金の実行によって (例えば西部のしみ、トランス上皮電気抵抗、MTT、等)、共同文化で育つ異なったセルタイプの分析に加えて全体の方法論の約束結果より、何が本当に起こるかin vivoの代表ともいえる。さらに、この設定により、関連するセル型の研究だけでなく、細胞間シグナル分子の上対下のコンパートメントにまたはの存在下でリリースを許可する別の共培養区画の分離対共培養の不在。

<table><tbody><tr><td>ThinCert マルチウェルプレート用6ウェル細胞培養インサート</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657610</td><td>機器</td></tr><tr><td>細胞培養マルチウェルプレート、6ウェル&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td>プラスチック</td></tr><tr><td>細胞培養マルチウェルプレート、24ウェル&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td>プラスチック</td></tr><tr><td>RPMI 1640 L-グルタミンなし</td><td>ロンザ</td><td>12-167F</td><td>試薬</td></tr><tr><td>胎児 ウシ血清</td><td>ロンザ</td><td>DE14-801</td><td>試薬</td></tr><tr><td>L-グルタミン 200 mM</td><td>ロンザ</td><td>17-605C</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン&nbsp; 10K/10K</td><td>ロンザ</td><td>17-602E</td><td>試薬</td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td>Heal Force</td><td>HF240</td><td>装置</td></tr><tr><td>Ficoll Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>試薬</td></tr><tr><td>チューブ、50 mL、PP、円錐底</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227261</td><td>プラスチック</td></tr><tr><td>チューブ、15 mL、PP、円錐底</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td>プラスチック</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>ThermoScientific</td><td>CL31R</td><td>装置</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td>試薬</td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ、25 cm2、PS</td><td>Greiner Bio-one</td><td>690175</td><td>Plastic</td></tr><tr><td>Clinac 2100 線形加速器</td><td>Varian</td><td>CLINAC 2100C/D</td><td>機器</td></tr><tr><td>3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド (MTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>試薬</td></tr><tr><td>マルチウェルプレート</td><td>リーダーGDV</td><td>DV990BV6</td><td>機器</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液0,4%&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>K940</td><td>試薬</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td>試薬</td></tr><tr><td>1.5 mL チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>0030125150</td><td>試薬</td></tr><tr><td>Millicell-ERS 電圧計/電圧計</td><td>ミリポア</td><td>MERS 00001</td><td>機器</td></tr><tr><td>Cell Lysis Buffer (10x)</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>#9803</td><td>試薬</td></tr><tr><td>B&uuml;rker血球計算盤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR719520</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>BCA Protein Quantification Kit</td><td>Abcam</td><td>ab102536</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>#1610737</td><td>試薬</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>#1610710</td><td>試薬</td></tr><tr><td>アキュブロック デジタルドライバス</td><td>Labnet International Inc.</td><td>D1100</td><td>機器</td></tr><tr><td>4&ndash;20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels, 10 well, 30 &micro;L</td><td>BioRad</td><td>#4568093&nbsp;</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ミニプロティアン&nbsp;ミニプレキャストゲル用テトラ縦型電気泳動セル、4ゲル</td><td>BioRad</td><td>#1658004</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>PowerPac HC大電流電源</td><td>BioRad</td><td>#1645052&nbsp;</td><td>備品</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein WesternC ブロッティングスタンダード</td><td>BioRad</td><td>#1610385&nbsp;</td><td>試薬</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS Running Buffer</td><td>BioRad</td><td>#1610732&nbsp;</td><td>試薬</td></tr><tr><td>トランスブロット&nbsp;Turbo Mini PVDF トランスファーパック</td><td>BioRad</td><td>#1704156</td><td>試薬</td></tr><tr><td>トランスブロット&nbsp;ターボトランスファーシステム</td><td>BioRad</td><td>#1704150</td><td>装置</td></tr><tr><td>ブロッティンググレードブロッカー&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>#1706404</td><td>試薬</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93773</td><td>試薬</td></tr><tr><td>Claudin-1 (D5H1D) XP&nbsp;ウサギのmAb&nbsp;</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>#13255</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>ZO-1 (D7D12) Rabbit mAb&nbsp;</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>#8193</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ZO-2 抗体&nbsp;</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>#2847</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Afadin (D1Y3Z) Rabbit mAb</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>&nbsp;#13531</td><td></td></tr><tr><td>試薬 抗オクルージン抗体</td><td>Millipore</td><td>ABT146</td><td>試薬</td></tr><tr><td>抗NF-kB p65抗体 [E379]</td><td>Abcam</td><td>ab32536</td><td>試薬</td></tr><tr><td>抗XIAP抗体&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab21278</td><td>試薬</td></tr><tr><td>アマシャム ECL マウス IgG、HRP リンク全 Ab (ヒツジ由来)</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>NA931V</td><td>試薬</td></tr><tr><td>アマシャム ECL ウサギ IgG、HRP リンク全 Ab (ロバ由来)</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>NA934V</td><td>試薬</td></tr><tr><td>クラリティ ウエスタン ECL 基質、200 mL</td><td>BioRad</td><td>#1705060&nbsp;</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ケアストリーム&nbsp;コダック&nbsp;オートラジオグラフィーGBX現像液/補充剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7042</td><td>試薬</td></tr><tr><td>Carestream&nbsp;コダック&nbsp;オートラジオグラフィーGBXフィクサー/補充剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7167</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ケアストリーム&nbsp;コダック&nbsp;バイオマックス&nbsp;ライトフィルム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z370401</td><td>試薬</td></tr><tr><td>Gel Doc EZ System</td><td>BioRad</td><td>#1708270&nbsp;</td><td>備品</td></tr></tbody></table>

x 線間のクロストークを解析のための共培養法照射 caco-2 細胞と pbmc

A Co-culture Method to Investigate the Crosstalk Between X-ray Irradiated Caco-2 Cells and PBMC

プロトコル採用でこの作品がどのように x 線摂動の腸粘膜バリアー機能大腸腫瘍細胞と免疫系との相互作用に焦点を当てて解明目指します。大腸癌は、癌が手術、化学療法、放射線治療によって通常の最も一般的な種類の一つです。腫瘍を対象に放射線治療の利点は、よく知られています。ただし、健康な組織の限られた露出は特に腸のバリアと免疫システムに及ぼす影響について、大きな懸念のです。採用のセットアップは通常細胞培養と比較して生理学的に同じような条件で 2 つの細胞集団間の相互作用を研究することができます。このため、我々 はさまざまなテクニックに頼るし、体外培養モデル、単分子膜と同じ培養培地を共有 PBMC 分化 caco-2 細胞に基づきます。このプロトコルは、フォーカス マクロ的効果、すなわち細胞生存率とトランス上皮電気抵抗 (TEER) と、西部のしみ、分子の変化、すなわち炎症経路の活性化に開発されています。免疫細胞、caco-2 細胞のタイト結合蛋白質の表現。TEER がオーム計で一定の時間間隔で測定した中、3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ブロマイド (MTT) とトリパン ブルーの試金、評価されたのカコ 2 セル実行可能性の放射線照射効果の初期評価共培養系に特化しました。このように、放射線、プレゼンスの末梢血単核細胞 (PBMC)、および最終的に彼らの相乗効果による効果を示すことができます。これらの相補的な技術によって PBMCs を追加したとき、ラジオ - の抵抗が高いカコ 2 2 10 Gy の x 線およびカコ 2 単分子膜の透過性が亢進の範囲内を観察しました。特に、PBMC の存在はタイト結合足場蛋白質発現の変化に関連する発見されました。

1 週間、実験前にセルを挿入の多孔質膜に播種して次の日の間に育つことができます。倒立顕微鏡を使用するか合流点のレベルをチェックすることができますまたは TEER 値の測定。確かに、成長段階では、TEER をすべての多孔質膜は、細胞によって覆われているし、彼らは分化細胞単層を形成するまで増加し続けます。細胞増殖速い/遅い場合実験は、シードされている後以前/以降の時点で開始でした。Confluence (コンフルエンス) 時はセルは、有無/下部コンパートメント (図 1A) でシード PBMC 培養を開始する前に与えられる環境ストレス (温度、pH) を最小限に抑え、照射設備に持って来られるか、caco-2 細胞増殖を評価しています。初期播種密度を考える日目 0 セルする必要があります 100% の合流点に達するし、図 1Bに示す TEER の高原で観察することができます上皮細胞の分化した単分子膜を作成します。細胞がこのような状態に達すれば、TEER 値に次の週では、比較的一定保持され限り古い培養液は新鮮な媒体に置き換えられます、少なくとも週に一度 (図 1B)。図 1Cに示すようは、24 h でも (最大 10 Gy) を受けた線量とは関係なく、48 h で MTT の試金は caco-2 細胞の増殖状態の任意の統計的に有意な変化を表示されません。
異なる結果は caco-2 細胞の短期死亡率に関する観察されました。両方の時点でセル死亡率の用量依存性の増加を示すトリパン ブルー染色します。死んだ細胞の割合が最高線量 (10 Gy) が大まかにしかも細胞死 (図 1D) の 20% を生成することを考慮すると非常に低いように見えますが、これらの結果は放射線被曝の明確な効果を示します。
試料共培養下のコンパートメントの PBMC の有無。PBMC が増殖する任意の外部刺激を受信しなかったこと事実を考えると、48 h 実験は死ぬことを始めて PBMC によって導入されたバイアスを避けるために最適と考えられました。したがってから、照射直前 TEER 定期的に測定した 48 時間照射プロトコルによって引き起こされる可能な一時的な効果を追跡します。(1200-1500 Ω·cm2の順序が) 前処理条件に関して相対的な変化は x 線照射による摂動をハイライトとして TEER の値が表示されます図 1 E Fのようと共培養の PBMC の有無によってまたは。両方のケースで初期の一時的なピークがはっきりわかります最初の時点で、照射プロシージャに帰することができる放射線暴露後。
セルが TEER の長期減少を示していない PBMC (図 1E) との共培養で TEER 値場合は、48 h をほぼ一定 10 Gy x 線の後、3 時間後照射で始まります。PBMCs の存在は完全に TEER ダイナミクス (図 1F) を変更します。すべての用量 TEER が一定値 (図 1F) で解決されたら、TEER の減少は約 30 時間照射後、最大 3 h からの観測では明らかに。
西部のしみの分析を通じてカコ 2 セル lysates のタイト結合複合体の発現量を調べた。Caco-2 細胞 (0、2、および 10 Gy の線量) の電離放射線にさらされる、(図 2A ~ Fで示すように)、その後単独で、または 48 h の下部コンパートメントの PBMCs との共培養を栽培します。クローディン 1 と Occludin (図 2A、2 b) は、x 線および/または PBMC との共培養により大きく変化がないと見つけられました。変動幅が大きい代わりに、足場蛋白質 ZO 1、ZO 2、Afadin (図 2C、2 D、2 e) で観察されました。特に、カコ 2 は単独で育っていたとき既に 10 Gy でのみ PBMC 培養時に 2 Gy 後 ZO 2 発現レベルの低下が観察されます。Afadin 式レベル代わりにカコ 2、PBMCs との共培養時の追加削減 10 Gy x 線の後にのみ影響は。
炎症性の状態に関する PBMCs カコ 2 共培養を行った、特に、核トランスクリプション要因 kB (NF kB) とアポトーシス蛋白 (XIAP) X 連鎖阻害剤を検討した (図 2 G-私)。NF kB 合計金額カコ 2 異なる放射線量 (図 2G) にさらされると共培養によって影響されなかった。どころか、XIAP レベルは大きな変動需要高くそのような変動を削減しより良い統計的検出力を得るために分析したサンプル数が 4 倍アップ規制 2 Gy で 10 Gy 共培養をだった。
図 2Fと2 iのように、いくつかの非特異的バンドが興味の蛋白質の予想される分子量の横に表示されます。真と非特異的バンドがわかりやすい、場合を除き、異なる抗体および BSA または NFDM 濃度を考慮されなければなりません。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56908/56908fig1.jpg"> 図 1.全体的な実験装置と放射線被曝や PBMC 培養のマクロ的効果です。A) 共培養モデルの模式。B) TEER 値は caco-2 細胞単一層の適切な成長および分化状態を評価するための初期シードから毎日測定。C) 細胞生存率及び D) カコ 2 (0、2、5、および 10 Gy) x 線にさらされて死亡。E) TEER caco-2 細胞単位照射 0、2、および 10 Gy の x 線をせず培養または F) PBMCs の。各値は、3 の独立実験 ± SEM. の平均 * p ヴァル &lt; 0.05;* * p va l &lt; 0.01;p ヴァル &lt; 0.001。グラフ モリーニらから適応。15.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56908/56908fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56908/56908fig2.jpg"> 図 2。カコ 2、PBMC の lysates の西部のしみの結果。PBMC 培養の有無、0、2、および 10 Gy の x 線後カコ 2 タイト結合蛋白質 (クローディン 1 (A)、オクルディン (B)、ZO-1 (C)、ZO 2 (D)、および Afadin (E)) の発現レベル。値は、アクチン レベルで正規化されます。各タイト結合蛋白質および条件の例示の上映をパネル (F)。NF-κ B (G) と XIAP (H) caco-2 細胞と共培養 PBMCs の発現レベル。NF kB、XIAP、アクチンに代表作は、パネルに表示されます。各値は、3 の独立実験 ± モリーニらから適応 SEM. グラフの平均です。15.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56908/56908fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

X 線照射したカコ 2 および末梢血単核球 (PBMC) 間のクロストークを調査するためのプロトコルを提案します。プロトコルはカコ 2 照射と PBMC; と共培養のセットアップから始まります。その後、上皮細胞の電気抵抗は、カコ 2 と PBMC の両方で実行 48 h および西部のしみを定期的に測定されます。

X 線間のクロストークを解析のための共培養法照射 caco-2 細胞と PBMC

The protocol adopted in this work aims at unraveling how X-rays perturb the functioning of the intestinal barrier, focusing on the interplay between ...

この共培養プロトコルの全体的な目標は、末梢血単核細胞の存在下または非存在下でのCaco-2上皮細胞単層透過性およびタイトジャンクション機能に対する電離放射線の影響を測定することです。この方法は、電離放射線被ばくと免疫細胞機能との間の相乗効果の可能性について、放射線生物学および放射線免疫療法の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、アドホックな補完測定を通じて、さまざまな刺激と細胞集団をテストし、分離された現象を観察できることです。放射線治療は、Caco-2細胞単層を腫瘍体積に適切なビームと正確な線量測定で照射することを目的としています。彼らの照射の1週間前に、2ミリリットルの完全培地中のCaco-2細胞を5回10〜5回、6ウェルの細胞培養プレート内のウェルあたり1マイクロメートルの細孔径の細胞培養インサート1つの滅菌に播種します。各ウェルの底部コンパートメントに3ミリリットルの新鮮な完全培地を加え、細胞を摂氏37度、5%Co2の加湿細胞培養インキュベーターに7日間置きます。インキュベーションの最終日に、50ミリリットルの円錐管に25ミリリットルのFicollを追加します。そして、採取したばかりの全血25ミリリットルをFicollの上に慎重に重ねます。密度勾配遠心分離により細胞を分離します。また、パスツールピペットを使用して、界面の末梢血単核細胞またはPBMCを新しい15ミリリットルの円錐管に移します。次に、分離されたPBMCを2回の10ミリリットルPBS洗浄で洗浄します。そして、PBMCを新鮮な完全培地で細胞培養インキュベーター内で3〜5時間以内培養します。光子X線エネルギーを6メガボルトのピークに設定します。そして、Caco-2細胞培養物をX線の軌道内、放射線源から100cmの厚さのプレキシガラスシートの上に置きます。次に、各サンプルに厚さ0.57センチメートルのボーラスを配置して、後方散乱放射線成分と荷電粒子の平衡を確保します。また、平坦で対称的な20×20平方センチメートルの放射線場と毎分3グレイの線量率を使用して、細胞に放射線を照射します。Caco-2細胞の代謝活性と生存率を評価するには、24ウェルプレートの各ウェルに1.25ミリリットルの完全培地を照射する24時間前に、24ウェルプレートの各ウェルに10回から5番目のCaco-2細胞を2回播種します。その後、細胞を細胞培養インキュベーターに21時間戻します。翌日、各ウェルに5ミリグラム/ミリグラムのMTT溶液を100マイクロリットル加え、さらに3時間細胞をインキュベートします。細胞を1ミリリットルのPBSで洗浄した後、各ウェルに500マイクロリットルのジメチルスルホキシドを加えてCaco-2細胞から放出されたホルマザン結晶を溶解し、570ナノメートルのラムダでマルチウェルプレートリーダーで吸光度を評価します。Caco-2細胞の生存率を評価するには、ウェルあたり1ミリリットルのPBSで細胞を洗浄し、その後、100マイクロリットルのトリプシンEDTA溶液で37°Cおよび5%CO2で2分間細胞を剥離します。500マイクロリットルの完全培地で反応を停止し、細胞を個々の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移して遠心分離します。チューブあたり50マイクロリットルのPBSにペレットを再懸濁し、得られた細胞懸濁液を等量のTrypan Blue生存率色素溶液と混合します。室温で3分後、血球計算盤で未染色の生存細胞と染色不能な生存細胞の数を数えます。Caco-2細胞の経上皮電気抵抗またはTEERを評価するために、照射直後にCaco-2細胞培養物の半分を各ウェルに3ミリリットルの新鮮な完全培地を入れた新しいプレートに挿入し、挿入培養物の半分をウェルあたり完全培地3ミリリットルあたり6番目のPBMCに10回播種した新しいプレートに挿入します。次に、最初の6時間は1時間ごとに、その後は照射後48時間まで3時間ごとに、TEER箸電極を細胞培養インサートに挿入します。ウェスタンブロット解析では、照射後48時間後に、Caco-2細胞およびPBMCを1×10あたり40マイクロリットルで細胞溶解バッファーの6番目の細胞に溶解します。Caco-2細胞を溶解および掻き取るときは、多孔質膜がインサートから剥がれないように注意してください。溶解した細胞サンプルは、マイナス20°Cで保存します。ビシンコニン酸法により各細胞溶解サンプル中の総タンパク質量を定量した後、β-メルカプトエタノールを添加したLaemmliサンプルバッファーを、個々の微量遠心チューブ内の各総タンパク質サンプルに同量加えます。サンプルを摂氏95度で5分間加熱します。次に、変性したタンパク質を遠心分離で回収し、各サンプルから同量のタンパク質を4〜20%のプレキャストゲルにロードします。サンプルを120ボルトで1時間実行します。次に、セミドライ電気転写システムを使用して、タンパク質をポリフッ化ビニリデン膜に転写します。次に、メンブレンを容器に入れ、0.2%Tween 20を添加したPBS中の5%脱脂粉乳で非特異的結合部位を室温で60分間、穏やかに攪拌しながらブロックします。ブロッキングインキュベーションの終了時に、10ミリリットルの0.2%PBS Tween 20で1回の洗浄につき5分間メンブレンを3回洗浄し、適切な目的の一次抗体でメンブレンを室温で1時間穏やかに攪拌しながら標識します。摂氏4度で一晩インキュベートした後、穏やかに攪拌しながら、先ほど示したようにメンブレンを0.2%PBS Tween 20で3回洗浄し、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体とメンブレンを室温で60分間静かに攪拌しながらインキュベートします。PBSを3回洗浄した後、強化化学発光溶液キットでメンブレンをインキュベートします。次に、適切なスキャンシステムで結果のフィルムを画像化し、適切な画像分析プログラムで結果を定量化します。10グレイまでの照射は、照射後24時間または48時間でCaco-2細胞の代謝活性を変化させませんが、細胞の生存率は両方の用量で時間とともに低下します。2つのグレイの照射に曝露した後の非共培養Caco-2細胞のTEER評価では、照射後48時間まで一貫したTEER値が明らかになります。しかし、10グレイの照射後、細胞は照射後3時間でTEERの長期にわたる減少を示します。PBMCとの共培養は、両方の用量で照射後3時間から照射後30時間まで明らかなTEERの減少をもたらし、その時点でTEER値は比較的一貫しているように見えます。タイトジャンクションタンパク質のウェスタンブロット解析では、照射および/またはPBMC共培養に応答したClaudin-1またはOccludinの発現に違いは見られませんが、さまざまなスカフォールドタンパク質で大きな変動が観察されます。さらに、NF-κB総タンパク質はどちらの照射線量でも影響を受けませんが、XIAPタンパク質レベルは両方の線量で4倍にアップレギュレーションされます。この手順を使用して、腸内細菌のような他の生物学的刺激を追加して、電離放射線被ばくに対する良好な単分子膜の応答を異なる生物学的刺激がどのように変更できるかについての追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、電離放射線と免疫細胞がCaco-2細胞の透過性とタイトジャンクション複合体の発現に及ぼす影響を測定する方法について十分に理解できるはずです。

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