4.3: MALDI-TOF 質量分析法

マトリックス支援レーザー脱離イオン化法(MALDI)は、生体分子の分析に最適な質量分析イオン源です。ほとんどのイオン源は、大きくて壊れやすい生体分子から構造情報を除去します。MALDIは、分子を質量分析装置に加速し、サイズと電荷に基づいて化合物を分離しながら、構造的完全性、したがって情報を維持します。MALDIと最も一般的に組み合わされるのは、飛行時間(TOF)質量分析計です。このビデオでは、一般的な手順であるMALDIイオン化の概念と、生化学におけるその使用の一部を紹介します。

質量分析が機能するためには、分子をイオン化して気体状態にする必要があります。MALDIでは、サンプルはマトリックス(通常は芳香族結合と共役二重結合を含む有機化合物)に埋め込まれます。

レーザーパルスがこの混合物に当たると、マトリックスはエネルギーの大部分を吸収し、急速に加熱され、表面から脱着または放出されます。通電したマトリックスは、そのエネルギーの一部を生体分子に伝達し、それらを脱着させてからイオン化します。

MALDIは通常、飛行時間(TOF)質量分析計とペアになります。電場はイオンに運動エネルギーを印加し、イオンをドリフトチューブと呼ばれる磁場のない領域に移動します。イオンがチューブ内を移動する際の速度は、質量電荷比に関係しているため、重い粒子は装置内をゆっくりと移動します。チューブの端にある検出器は、各イオンの飛行時間を測定します。この知識に加えて、チューブの長さや印加電界強度などから、各イオンの質量電荷比を解明することができます。

この質量電荷比に対する信号強度のプロットは、質量スペクトルと呼ばれ、収集されたスペクトルのライブラリと比較できます。一致するものが見つからない場合は、タンデム質量分析などのさらなる技術で分子を同定できます。詳細については、このトピックに関するこのコレクションのビデオを参照してください。

さて、MALDI-TOFの基本についてお話ししたところで、研究室でのプロセスを見ていきましょう。

実験を始める前に、サンプルを脱離するマトリックスの選択を検討することが重要です。レーザーエネルギーを吸収し、真空中で安定し、標的分子と反応せず、脱着できる必要があります。サンプルに応じて、異なるマトリックスが好ましい。大きなタンパク質の場合、CHCA と DHB の組み合わせは、個々のマトリックスよりも分離度と呼ばれるピークの分離が良好であることを示しています。

サンプルを調製するには、いくつかの方法があります。「ダブルレイヤー」または「サンドイッチ」メソッドとして知られているものを示します。まず、質量分析は汚染に非常に敏感であるため、MALDIプレートを超高純度試薬で洗浄します。プレートを不活性ガスの流れで乾かします。

次に、飽和マトリックス溶液を、典型的には有機溶媒を用いて作製する。溶液をMALDIプレートに縞模様にし、乾燥させます。トリフルオロ酢酸(TFA)を含有するマトリックスの第2の飽和溶液を調製する。TFAは、イオンが気相に入るのを助けます。

次に、乾燥したマトリックススポットの上にサンプル溶液を加えます。TFAを含むマトリックス溶液をサンプルの上に加えると、マトリックスの「サンドイッチ」が完成します。スポットの均一性は、低倍率の顕微鏡で確認することができます。

プレートは、広範囲の既知の質量との混合物であり、飛行時間をm/zに関連付けるために使用されるキャリブレーション標準です。最後に、マトリックスのみをネガティブコントロールとしてプレートします。

スポットを分析するには、ターゲットプレートを装置に入れます。破片が存在しないことを確認し、タイトな真空を形成できるようにします。ソフトウェアで、対象サンプル、ネガティブコントロール、サンプルを選択します。スポットに正しいIDのラベルを付けます。

イオン源とレンズの電圧を操作して、分析のパフォーマンスを向上させることができます。これは、装置とサンプルの詳細によって異なります。標準スポットに焦点を合わせ、ソフトウェアで機器を校正します。

次に、各サンプルスポットからスペクトルを収集します。収集したデータの品質を最大限に高めるために、その場でいくつかの異なる場所を試してみてください。完成したMALDIプレートは、洗浄後に回収して再利用することができます。

手順を確認したので、MALDIの使用方法とさまざまなイオン化技術を見てみましょう。

生体分子に加えて、MALDIは生細胞の分析にも使用できます。マクロファージは、その微小環境に基づいて、いくつかの異なる形態のいずれかをとる免疫細胞です。細胞をさまざまなシグナル伝達分子またはサイトカインにさらした後、それらをプレートに直接追加して分析することができます。MALDIスペクトルは、使用するサイトカインに応じて、固有の「フィンガープリント」として使用できます。

哺乳類の皮脂分泌物のような複雑な生体サンプルは、MALDI分析の前に精製のステップが必要です。薄層クロマトグラフィーは、コンポーネントの極性に依存するそのような手法の1つです。化合物はTLCパテから収集され、精製され、MALDIマトリックスに移されます。得られたスペクトルは、哺乳類の皮脂分泌物から分離された生体分子の同一性と純度を確認します。

生体分子のもう一つの一般的なイオン源は、エレクトロスプレーイオン化(ESI)です。この方法では、サンプルを装置に注入し、高電圧を印加して、帯電した液滴のエアロゾルを生成します。液滴中の溶媒が蒸発すると、電荷はサンプル分子に移動し、完全に気体になるまで移動します。ESIはスポッティング手順を必要とせず、サンプルを直接装置に注入できます。一方、ESIは緩衝成分やその他の汚染物質の存在に対してより敏感であるため、MALDIはより堅牢です。

JoVEのMALDI質量分析に関するビデオをご覧になりました。このビデオでは、この機器の背後にある理論を説明し、一般的な手順を説明し、この技術の使用の一部について説明しました。ご覧いただきありがとうございます!