4.2: 酵素試金とカイネティクス

酵素は、生命に不可欠な生化学的触媒です。酵素アッセイは、酵素反応の速度論的特性を研究するために使用され、酵素の触媒効果を解明します。このビデオでは、酵素の動態とアッセイを取り上げ、一般的な手順を説明し、いくつかのアプリケーションを紹介します。

酵素は、基質と呼ばれる特定の反応物に作用するタンパク質、またはそれほど多くはないRNAです。酵素は、生化学反応を開始するために必要な活性化エネルギーを減らし、反応をより速い速度で起こします。

酵素反応は、3つの基本要素に分けることができます。第一は、基質の酵素活性部位への結合によって形成される酵素 - 基質複合体の形成である。複合体は、元の成分に分解できます。これが2番目の基本反応です。あるいは、複合体は生成物を形成し、酵素、すなわち第三の基本反応を回復させることができる。

素反応の動力学は、素速度法則方程式によって与えられます。レート法則方程式は、反応物の濃度とレート定数でレートを示します。各基本反応には、独自の速度定数を持つ個別の速度法則方程式があります。これらの方程式は、Michaelis-Menten方程式として知られる動力学モデルに蒸留できます。これにより、基質濃度に関する反応速度が得られます。これは実験的に決定できます。酵素反応の一般的な傾向は、Michaelis-Menten方程式を使用して特定できます。基板濃度が高いと、Vmaxと呼ばれる飽和点に達します。ここで、速度は総酵素濃度と、酵素が所定の時間あたりに生成物に変換する基質分子の数(kcatとも呼ばれます)によって制限されます。Michaelis-Menten kinetics では、kcat は反応速度を支配する 2 つの定数の 1 つです。もう 1 つの定数である KM は、親和定数として知られています。KMは、反応速度が2分の1Vmaxに相当する濃度にも相当します。親和性が高い酵素はKMが低く、Vmaxに早く到達しますが、親和性が低い酵素はKMが高くなり、Vmaxに到達するのに時間がかかります。kcatとKMを知ることで、酵素を比較することができます。これを行うには、酵素効率と呼ばれる比率を使用します。kcat が高く、KM が低いほど効率が高くなり、kcat が低く KM が高いほど効率が低くなります。

酵素動態を解明するための因子は、実験的に決定する必要があります。これらのアッセイは、通常、制御された環境で酵素と基質溶液を混合することによって実行されます。観察は、基質、生成物、または副生成物の濃度の時間に対する変化を測定することによって行われます。

時間の経過に伴う濃度の変化は、反応速度を決定するために使用されます。速度論を決定するには、複数の濃度で速度データを取得する必要があります。逆初期速度と逆初期濃度のプロット (Lineweaver-Burk プロット) が線形である場合、反応は Michaelis-Menten 速度論に従います。ラインの傾きと切片により、速度論パラメータKMとVmaxの決定が可能になり、これを使用してkcatと酵素効率を計算できます。

酵素動態の原理について説明したところで、一般的な酵素アッセイがどのように行われるかを見てみましょう。

この手順では、比色アッセイが実証されます。?最初のステップは、吸光度と基質濃度を相関させる標準曲線を生成することです。既知の濃度の溶液をコントロールサンプルと共に調製します。基質と反応する現像液を添加して、着色化合物を生成します。吸光度を測定し、濃度に対してプロットして標準曲線を生成します。

アッセイを実施するために、既知の濃度の基質を適切な量の酵素とともに調製します。酵素と基質を混合し、設定された時間間隔でインキュベートします。pHと温度は、緩衝液と加熱ブロックで制御されます。反応を止めるために焼入れ剤を添加します。その後、開発者ソリューションが反応に追加され、混合されます。次に、溶液をキュベットに入れ、吸光度を測定します。消費される基質の量は、測定された吸光度を標準曲線と比較することによって決定されます。収集したデータを使用して、経時的な濃度をプロットすることにより、初期反応速度を決定します。最後に、速度データと濃度を使用して、Michaelis-Mentenプロットが作成されます。これにより、代謝回転数や酵素効率などの酵素の速度論的特性を決定することができます。

アッセイの手順を確認したので、アッセイの他の方法とその応用について見てみましょう。

この手順では、FRET分析を使用して、タンパク質のペプチド結合を加水分解するプロテアーゼの動態を研究します。これらの排出量を測定できるため、基質の消費と生産の連続的かつ定量的な分析が可能になり、反応速度の決定に役立ちます。

酵素アッセイは、環境科学において、環境中の細胞外酵素活性のレベルを決定するために使用できます。水、土壌、堆積物は、環境から収集し、実験室で処理することができます。これらの材料の細胞外酵素活性は、酵素アッセイを用いて特徴付けることができます。これは、環境が有機物をどのように処理するかを理解するのに役立つツールです。

細胞のDNA修復メカニズムは、核に見られる酵素の動態を研究することで評価できます。酵素がDNAの損傷または損傷を除去する速度は、蛍光分子ビーコンを使用して測定できます。蛍光分子ビーコンは、固有のDNA配列に結合した場合にのみ蛍光を発します。DNA修復のレベルは、蛍光標識された切断産物を検出することにより、リアルタイムで測定できます。

JoVEの酵素動態とアッセイに関するビデオをご覧になりました。このビデオでは、酵素動態について説明し、アッセイの概念を取り上げ、一般的な手順を説明し、いくつかのアプリケーションについて説明しました。

ご覧いただきありがとうございます!