トランス内部細胞のキメリズム率が高いため、胚性幹細胞の大量注入
May 29th, 2018
ここで新しい機器を使用せずキメラを増産するためのプロトコルを提案する.胚の注入のための簡単な方向の変更は生産、胚の数を増やすし、潜在生殖するタイムラインを削減できます。
この修正された手順の全体的な目標は、追加コストや長いトレーニング期間を負担することなく、キメラの生産を増やすことです。この方法は、特にES細胞が最適でない場合に、ラボがキメラ生産をより効率的に行うのに役立ちます。この手法の主な利点は、追加の機器や専門的なトレーニングを必要としないことです。
今日、その手順を実演するのはトーマス・ハグラーです。彼は生物学者であり、コアラボで働く大学院生です。胚を採取するには、子宮を実験組織で拭き取って余分な血液を取り除き、臓器を新しい60ミリメートル皿に低倍率解剖顕微鏡で入れます。
解剖鉗子を使用して子宮を卵管の近くに注意深く優しく保持し、10ミリリットルのブラスト収集培地が入った10ミリリットルの注射器に取り付けられた25ゲージの針を、鉗子の先端のすぐ向こうの子宮の中心にできるだけ平行な平面で挿入します。鉗子に圧力をかけて針を子宮内に固定し、子宮角を通して約1ミリリットルの培地を静かに洗い流します。すべての胚盤胞が排出されたら、マウスピペット装置を組み立て、マウスピペットを使用して、個々の胚を2番目の60ミリメートル皿内のブラストコレクション培地の1滴に移します。
次に、各胚を2滴目のブラストコレクション培地で洗浄し、胚を注入するまで4ウェル皿に移します。まず、マイクロインジェクターを使用して、注射針に真空を塗布します。注射針と胚ホルダーピペットを取り付けた注射顕微鏡の下にES細胞の皿を置きます。
注射を成功させるには、顕微鏡を適切にセットアップするために時間をかけることが不可欠です。これには、針の適切な量のメディアとz軸の正しい位置合わせが含まれます。マイクロインジェクターを使用して、注射針に真空を塗布します。
細胞間のスペースをできるだけ少なくして、胚の皿から明らかな欠陥のない滑らかな表面の小から中型の胚細胞を引き込みます。少なくとも15個の細胞を収集した後、ホルダーの開口部の近くに胚を配置します。真空を適用して胚をホルダーに固定し、保持ピペットを上下に動かして、胚がスライドにちょうど触れるまでz軸を調整します。
透明眼球のゾーンに微細に焦点を合わせ、針の先端近くの胚細胞に焦点が合うまで注射針のz軸を調整します。必要に応じて、注射針を使用して、内部細胞塊が注射に適した位置になるまで胚盤胞を穏やかに転がします。しっかりと制御されたプッシュを使用して、注射針を透明眼のゾーンから内部細胞塊に挿入し、注射針のマイクロインジェクターにわずかな圧力を加えて、胚盤胞が崩壊するのを防ぎます。
針が胚盤線を貫通したら、マイクロインジェクターに圧力をかけてすべての胚性幹細胞を胚に移し、針の斜角が胚から出始めると少し一時停止して、細胞を保持したまま胚の圧力を正常に戻します。すべての胚盤胞が注入されたら、非外科的胚移植装置を使用して、製造元の指示に従って胚を胚期2.5スイスウェブスターマウスに送達し、各移植後、送達およびその後の離乳を通じてマウスを個別に収容します。この代表的な実験では、トランス細胞内細胞塊を注入した群と対照群の間で妊娠率は変わらず、各群から同数の子犬が離乳まで生き残った。
特に、離乳時のマウスの数は変化しなかったが、トランスインナーセル質量注入群の子犬の数は、対照注射群と比較して毛色のキメラ現象を示した。この技術の最も優れた点は、キメラでのより大きな生産を促進するために、胚の向きを単純に変更するだけでよいことです。顕微鏡の適切なセットアップが不可欠です。
顕微鏡とマニピュレーターが適切に設置され、適切にメンテナンスされていないと、注入プロセスは機能しません。胚注入に不慣れな方は、繰り返し学ぶしかないでしょう。初心者にとって、胚の取り扱いは手順の最も難しい部分になる傾向があります。
胚を1つの皿から別の皿に効率的に移動できることは、実験の最も重要な部分です。このビデオを見た後、標準の注入技術を簡単に変更するだけで、キメラ生産の効率を高める方法についてよく理解できるはずです。
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概要
この記事では、追加の機器を必要とせずにキメラの生産を増加させることを目的とした修正プロトコルを紹介します。この技術は、注射中の胚の簡単な向きの変更に焦点を当てており、胚の収率を向上させ、潜在的に生殖系への伝達までのタイムラインを短縮することができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 発生生物学
- 遺伝学
背景
- キメラの生産は様々な生物学的研究に不可欠です。
- 従来の方法には高価な機器と広範な訓練が必要かもしれません。
- キメラ生産の効率を向上させることで多くの研究室に利益をもたらす可能性があります。
- このプロトコルは効果を維持しつつ、プロセスを簡素化することを目指しています。
研究の目的
- 追加コストをかけずにキメラの生産を向上させること。
- 研究室の人員の訓練時間を減少させること。
- 研究者によって容易に採用できる簡単な方法を提供すること。
使用された方法
- 過剰な血液を除去するために子宮を拭いて胚を収穫すること。
- 胚の配置に低倍率の解剖用顕微鏡を使用すること。
- 注射中の修正された胚の向きを実施すること。
- 訓練を受けた生物学者による手順の実演。
主な結果
- 修正された手順はキメラの生産を成功裏に増加させました。
- 研究室は追加コストなしで効率の向上を報告しました。
- 参加者はこの方法を学び実装しやすいと感じました。
- 生殖系への伝達までのタイムラインを短縮する可能性が観察されました。
結論
- このプロトコルはキメラの生産を向上させるための費用効果の高い解決策を提供します。
- それはプロセスを簡素化し、より多くの研究室にアクセス可能にします。
- 将来の研究では、この技術のさらなる最適化を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient generation of genetically modified mouse models is a critical inflection point in early discovery and target validation pipelines. The trans-inner cell mass (TICM) injection protocol increases chimerism rates without additional equipment or specialized training, directly improving throughput and resource allocation for in vivo model generation. This operational advance supports portfolio-wide acceleration of hypothesis-driven research and risk-adjusted progression of candidate targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid production of high-chimerism mouse models for functional genomics studies.
- Improves biological de-risking by increasing the likelihood of germline transmission in engineered lines.
- Supports robust target validation through efficient generation of genetically modified cohorts.
- Facilitates portfolio triage by reducing bottlenecks in in vivo model availability.
Screening & Assay Development
- Provides validated chimeric animals for downstream phenotypic screening and assay development.
- Standardizes embryo injection procedures, enhancing reproducibility across projects.
- Delivers quantitative outputs (chimerism rates) to benchmark protocol performance.
- Enables scalable model production for compound evaluation workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational research by supporting continuity from genetic modification to preclinical model validation.
- Reduces risk of late-stage biological failure by improving model generation efficiency.
- Supports biomarker discovery and validation in genetically engineered systems.
Pipeline & Workflow Integration
The TICM injection protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, streamlining the transition from genetic engineering to in vivo validation.
- Discovery Biology: Increases predictive confidence in target function studies by enabling higher chimerism rates.
- Screening: Standardizes embryo injection for reproducible model generation and downstream screening readiness.
- Analytics: Provides quantitative chimerism data to inform protocol optimization and cross-study comparisons.
- Translational Research: Enhances continuity from genetic modification to preclinical efficacy and safety studies.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adoptable protocol for core facilities and project teams without additional capital investment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genetically engineered models.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability in chimera production workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by accelerating model availability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in embryo handling and microinjection.
- Depends on precise microscope and manipulator setup for reproducibility.
- Necessitates cross-team standardization of embryo orientation and injection technique.
- Adaptable across inbred and hybrid mouse strains as demonstrated in the study.
- Embryo handling proficiency is critical to minimize loss and maximize yield.
