Name: 腫瘍組織に高スループット チップ シーケンスを用いたクロマチン状態のゲノム マッピングの統合プラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 学ぶ高スループットChIPシーケンスを用いた腫瘍組織のクロマチン状態解析法。複数のヒストン修飾を同時に効率的に処理し、がんエピジェネティクス研究における治療標的探索への貴重なツールを提供します。

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マーカス ・ コイル、カーティス ・ ガムス SMF コア MDACC シーケンスのサポートに感謝いたします。この資料で説明する作業は、SMF のコアに NIH グラント (CA016672) からの助成金によって支えられた、NCI は、k. r. に (1K99CA160578 および R00CA160578) に賞を受賞

<ol><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li>
<li>Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulated+Neighborhoods%3A+Structural+and+Functional+Units+of+Mammalian+Gene+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control.</a> Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).</li>
<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li>
<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMARCB1-mediated+SWI%2FSNF+complex+function+is+essential+for+enhancer+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation.</a> Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).</li>
<li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li>
<li>Jäger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+Hi-C+identifies+the+chromatin+interactome+of+colorectal+cancer+risk+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci.</a> Nat Commun. 6, 6178(2015).</li>
<li>Krijger, P. H., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).</li>
<li>Mansour, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+regulation.+An+oncogenic+super-enhancer+formed+through+somatic+mutation+of+a+noncoding+intergenic+element%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element.</a> Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).</li>
<li>Weischenfeldt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-cancer+analysis+of+somatic+copy-number+alterations+implicates+IRS4+and+IGF2+in+enhancer+hijacking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking.</a> Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).</li>
<li>Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/molecular-cell/abstract/S1097-2765(14)00205-6">Enhancer malfunction in cancer.</a> Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17320507">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+67+histone+marks+and+histone+lysine+crotonylation+as+a+new+type+of+histone+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification.</a> Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).</li>
<li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li>
<li>Consortium, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Rivera, C. M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(13)01148-3">Mapping human epigenomes.</a> Cell. 155 (1), 39-55 (2013).</li>
<li>Stergachis, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+fate+and+cellular+maturity+encoded+in+human+regulatory+DNA+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes.</a> Cell. 154 (4), 888-903 (2013).</li>
<li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomic+analysis+of+multilineage+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells.</a> Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+diversity+during+lineage+commitment+of+human+blood+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors.</a> Science. 345 (6204), 1251033(2014).</li>
<li>Saeed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+programming+of+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+trained+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity.</a> Science. 345 (6204), 1251086(2014).</li>
<li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NIH+Roadmap+Epigenomics+Mapping+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium.</a> Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).</li>
<li>Roadmap Epigenomics, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Ernst, J., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChromHMM%3A+automating+chromatin-state+discovery+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization.</a> Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).</li>
<li>Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+ChIP-seq+enrichment+using+MACS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Identifying ChIP-seq enrichment using MACS.</a> Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18798982">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+characterization+of+the+early+embryo+with+a+chromatin+immunoprecipitation+protocol+applicable+to+small+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations.</a> Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).</li>
<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q2ChIP%2C+a+quick+and+quantitative+chromatin+immunoprecipitation+assay%2C+unravels+epigenetic+dynamics+of+developmentally+regulated+genes+in+human+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells.</a> Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+reprogramming+of+the+histone+modification+H3K4me3+in+early+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development.</a> Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).</li>
<li>Dahl, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+histone+H3K4me3+domains+in+mouse+oocytes+modulate+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition.</a> Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).</li>
<li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4me3+epigenomic+landscape+derived+from+ChIP-Seq+of+1%2C000+mouse+early+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells.</a> Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).</li>
<li>Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate-based+chromatin+immunoprecipitation+method%2C+Matrix+ChIP%3A+a+platform+to+study+signaling+of+complex+genomic+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events.</a> Nucleic Acids Res. 36 (3), e17(2008).</li>
<li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16397291">Fast chromatin immunoprecipitation assay.</a> Nucleic Acids Res. 34 (1), e2(2006).</li>
<li>Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interactive+environment+for+agile+analysis+and+visualization+of+ChIP-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data.</a> Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).</li>
<li>Blecher-Gonen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).</li>
<li>Tang, M. <a target="_blank" href="https://zenodo.org/record/819971#.WilfHUtrxZ0">pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline.</a> Zenodo. , (2017).</li>
<li>Koster, J., Rahmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snakemake--a+scalable+bioinformatics+workflow+engine%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine.</a> Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).</li>
<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).</li>
<li>Bailey, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+guidelines+for+the+comprehensive+analysis+of+ChIP-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data.</a> PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326(2013).</li>
<li>Fiziev, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Epigenomic+Analysis+Reveals+Chromatin+States+Associated+with+Melanoma+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression.</a> Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+chromosomal+domains+of+histone+modification+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans.</a> Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Rai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Roles+of+RNF2+in+Melanoma+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression.</a> Cancer Discov. , (2015).</li>
<li>Cotney, J. L., Noonan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+with+fixed+animal+tissues+and+preparation+for+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing.</a> Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).</li>
<li>Cejas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+from+fixed+clinical+tissues+reveals+tumor-specific+enhancer+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles.</a> Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).</li>
</ol>

著者は競合を宣言しません。

このプロトコルでは、ひと腫瘍組織および培養細胞におけるクロマチン状態のゲノム マッピングの完全かつ包括的な高スループット チップ seq モジュールについて説明します。最も重要な手順の 1 つは、任意のチップ seq プロトコル抗体特異性です。ここでは、このメソッドにより、チップ グレード、以前私たちと他研究所42,44,45で検証されてきたすべての記述の 6 ヒストン修飾の免疫沈降条件.同じ抗体濃度は、他の腫瘍タイプに正常に適用されている、利息27の異なる要因を勉強して場合、抗体の特異性を決めることが大事です。
成功した実験を別の重要な側面には、超音波処理条件の最適化が含まれています。超音波処理時間は、それに応じて調整するサンプルと組織型との間の両方を変えることができます。適切な最適化、試運転は超音波処理時間を段階的に増加し、フラグメントのサイズを...

哺乳類のゲノム (98-99%) の大半は非コード シーケンスから成るとこれらの nocoding 地域制御遺伝子の発現とクロマチン組織1,2に参加する知られている規制要素を。正常な細胞に最適化されたクロマチン構造にゲノム DNA の特定のアセンブリは空間的な組織、規制、様々 な DNA 関連プロセス3,4、5の精密なタイミングにとって重要です。癌細胞のしかし、クロマチン修飾におけるエピジェネティックな異常のメカニズムによってにつながる規制要素、染色体のループ システム、および遺伝子発現パターン6へのアクセスを含む、クロマチン構造の不適切な組織 7,8,9,10。
最近の進歩にもかかわらず、我々 は腫瘍の進行や治療の応答に関連付けられているエピジェネティックな変化の理解を限られています。エピゲノムは、ヒストンと DNA メチル化遺伝子発現ネットワークとその他のプロセスを維持するための重要な時に入射する (クロマチンの状態と呼ばれる) 動的状態を総称して形成を含む変更の配列で構成されています携帯電話の id です。最近、エンハンサーの変化は、H3K27Ac プロファイル11を研究することによって複数の悪性腫瘍で示されています。このような研究は、分離のエピゲノムの相関性への洞察力を提供する、以上 100 エピジェネティック修飾はその生物学的役割を明確に理解することがなく識別された12,13をされていると相互依存関係。さらに、これらのヒストンと DNA の変更の組合せパターンのさらに大きな数があるし、それはこれら組み合わせパターンの個々 の変更 - エピジェネティックな状態14を指示します。したがって、癌の進行や治療.への応答時にこれらのクロマチンの状態の変化を識別するために途方もない必要性があります。技術 (臨床材料/単一セルの少量から大規模なデータ生成など) の一部に遅れている癌のエピゲノム変化の包括的な知識と分析 (例えばアルゴリズムを定義するには組合せ状態) の課題。したがって、容易にする組合せのパターンを予測する臨床材料と簡単に実装できる計算のアプローチからヒストン修正マークの数が多いをプロファイリングのための堅牢な高スループット方法の重要な必要性があります。腫瘍と治療抵抗性のさまざまな段階に関連付けられているエピジェネティクスの状態の決定。さらに、データ最近エピゲノム プロファイリング研究15,16,17,18,19,20,21から利用できます。 22,23の正常組織および細胞は腫瘍の腫瘍生物学へのエピゲノム貢献のさらなる洞察のクロマチン プロファイルに統合できます。
クロマチンのプロファイリングを様々 なクロマチン変更15,24の大域結合パターンを識別するための強力なツールとなりました。近年、チップ seq を地球規模25,26,27DNA 蛋白質の相互作用を研究するための「ゴールド スタンダード」となりました。任意のチップ seq 実験のためティッシュの処理および脱退を含め、最適な超音波処理条件、沈殿物、ライブラリの準備のための最適な抗体濃度を決定を決定、その成功のために必要な重要なステップがあります。ポスト シーケンス データの処理、および下流の分析。これらの各手順キーの品質管理のチェックポイントが含まれて、一緒に撮影するとき正しく機能検証のための潜在的なターゲットを識別するために重要です。次の手順でイノベーションにより、いくつかの先行研究が組織28,29,30,31,32 の少量からチップやチップ Seq を実行する手法を開発しました。.さらに、いくつかの研究は、PCR によって続いた高スループット チップ実験用プロトコルによる定量33,34を示唆しています。最後に、チップ Seq データのいくつかの公に利用可能な解析プラットフォームは、Easeq35銀河36などできます。ただし、クロマチン状態分析と同様に、ひとつのマークを実行する計算パイプラインとの組み合わせで高スループット方法でチップ Seq を実行するための統合プラットフォームを欠いてきた。
このプロトコルと腫瘍組織および培養細胞におけるクロマチン状態のゲノム マッピングのための完全かつ包括的なチップ seq ワークフローを成功した実験のために必要な手順のすべてを包み込むガイドラインに従う簡単な記述します。Blecher ゴネンらに記載された高スループット方法を採用することにより37, このプロトコル並列でサンプルの数十に実行でき、癌細胞、悪性黒色腫、大腸、前立腺、膠芽腫多形性など人間の腫瘍に正常に適用されています。ひと悪性黒色腫細胞と腫瘍サンプルのエピジェネティックな規制環境の主要なコンポーネントを表す六つのコアのヒストンの修正の方法を示す.これらの変更は、H3K27ac (エンハンサー)、H3K4me1 (アクティブと態勢を整えてエンハンサー) H3K4me3 (プロモーター) H3K79me2 (転写領域)、H3K27me3 (ポリコーム抑制) と H3K9me3 (多色抑圧)。これらのマークは、抑圧的なアクティブなドメインを表す機能的に異なるクロマチンの状態を識別するために単独でまたは組み合わせて使用できます。

<table><tbody><tr><td>ChIPグレードH3K4me1抗体</td><td>Abcam</td><td>ab8895</td><td></td></tr><tr><td>ChIPグレードH3K27ac抗体</td><td></td><td>Abcam ab4729</td><td></td></tr><tr><td>ChIPグレードH3K4me3抗体</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td></td></tr><tr><td>ChIPグレードH3K79me2抗体</td><td>Abcam</td><td>ab3594</td><td></td></tr><tr><td>ChIPグレードH3K27me3抗体</td><td>Abcam</td><td>ab6002</td><td></td></tr><tr><td>ChIPグレードH3K9me3抗体</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris HCl, pH 8.0</td><td>Teknova</td><td>T1080</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma - Life科学</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74255</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746460</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1% TWEEN-20</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA - IgG-free</td><td>Sigma - Life科学</td><td>A2058-5G</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibo</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C チューブ</td><td>GentleMACS</td><td>120-008-466</td><td>解離チューブ</td></tr><tr><td>16% ホルムアルデヒド</td><td>Peierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>ミニプロテアーゼ阻害剤&nbsp;</td><td>ロシュ・ダイアグノスティック</td>ス<td>11836153001</td><td>プロテアーゼ阻害剤錠</td></tr><tr><td>「Dynabeads Protein G&nbsp」</td><td>Invitrogen</td><td>10009D</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor NGS tubes 0.65 mL</td><td>Diagenode</td><td>C30010011</td><td>超音波処理チューブ</td></tr><tr><td>DynaMag - 96 Side Skirted</td><td>Invitrogen</td><td>120.27</td><td>96-well magnetic stand</td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>Promega</td><td>V6231</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>100005393</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP ビーズ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63882</td><td>常磁性ビーズ</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Qubit ds DNA 高感度アッセイキット</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>高感度 DNA 試薬</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td><td>DNA Library Prep Kit</td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>アンビオン</td><td>AM9932</td><td></td></tr>高<tr><td>感度D1000スクリーンテープ</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td>高<td>感度DNA試薬</td></tr><tr><td>高感度D1000試薬</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td>高<td>感度DNA試薬</td></tr><tr><td>マルチプレックスオリゴ(インデックスプライマー-セット1)</td><td>ニューイングランドバイオラボE7335L</td><td></td><td>マルチプレックスオリゴ&nbsp;</td></tr><tr><td>マルチプレックスオリゴ(インデックスプライマーセット2)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7500L</td><td>マルチプレックスオリゴ&nbsp;</td></tr><tr><td>TapeStation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td>高感度DNAエレクトロフェログラム装置</td></tr><tr><td>Bioruptor Pico超音波処理装置&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>B01060001</td><td>ウォーターバスディスルーター</td></tr><tr><td>ミキサー</td><td>ニューテーター</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad C1000 タッチサーマルサイクラー</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>PCR サーマルサイクラー</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>2322</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット</td><td>デンビル</td><td>1003123</td><td></td></tr><tr><td>チューブ リボルバー</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td></td>88881001</tr><tr><td>96ウェルスカートプレート</td><td>エッペンドルフ</td><td>47744-110</td><td></td></tr><tr><td>アレグラ X-12R 遠心分離機&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A99464</td><td>卓上型遠心分離</td></tr>機 <tr><td>遠心分離機 5424</td><td>エッペンドルフ</td><td>22620461</td><td>卓上型遠心分離機</td></tr><tr><td>光学チューブストリップ (8x ストリップ)</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>光学チューブストリップキャップ (8x ストリップ)</td><td>Agilent Technologies</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>ローディングチップ、10 個入り</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5599</td><td></td></tr><tr><td>IKA MS3 ボルテック</td>ス <td>IKA</td><td>3617000</td><td>ボルテックス</td></tr></tbody></table>

腫瘍組織に高スループット チップ シーケンスを用いたクロマチン状態のゲノム マッピングの統合プラットフォーム

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

ヒストン修飾は、エピゲノムの主要なコンポーネントを構成して、関連する遺伝子の転写のステータスを決定する上で重要な規制の役割を果たします。さらに、特定の変更の有無は位置とエンハンサーなどの id 以外のコーディング機能要素を決定するために使用されています。近年、次世代シーケンシング (チップ seq) 続いてクロマチン免疫沈降個々 のヒストンの修正のゲノム全体のプロファイルを決定する上で強力なツールとなっています。ただし、クロマチン状態と呼ばれる、クロマチン修飾の組み合わせパターンが id と関連付けられた genomic 位置の性質を決定することがますます明らかになった。したがって、ヒストン修飾としてできる計算解析パイプラインの数をプロファイリングのしっかりした高スループット (HT) 方法論から成るワークフロー処理チップ Seq の無数のデータセットをプロファイリングのために必要な多くのサンプル数でエピゲノム状態の包括的な決定は。ここに提示、HT チップ Seq ワークフローは 2 つのモジュールで構成されています: 1) 少量の腫瘍のサンプルや 96 ウェル フォーマットで細胞からいくつかのヒストンの修正をプロファイリングのための実験プロトコル・ 2) 個々 のマークの占有と組合せクロマチン状態パターンの両方を計算するための既存のツールを組み合わせた計算データ解析パイプライン。一緒に、これら 2 つのモジュールは、簡単チップ Seq サンプルの何百もの高速かつ効率的に処理を促進します。ここに示すワークフローを使用して、黒色腫の細胞株 6 ヒストン マークのプロファイルからクロマチン状態パターンを派生します。全体的にみて、人間の腫瘍のサンプルと様々 な悪性腫瘍におけるエピゲノム異常を決定するがん細胞の数十に適用できる包括的なチップ seq ワークフローを提案します。

このプロトコルでは、冷凍腫瘍組織および高スループット方法(図 1 a)を使用して並列にサンプルの数十に実行できる培養細胞から免疫沈降をことができます。最適な免疫沈降の 200 〜 1000 bps の間クロマチン フラグメントの範囲。我々 は、異なる組織や細胞の種類の異なる同じ剪断長さを達成するために必要な時間を指摘しています。組織量が少ないからチップの成功は、特に超音波処理中にすべての回でライセートの寒さを維持するのに依存します。浄化チップ DN Ashould は、ライブラリの準備 (図 2 a) に進む前に定量化します。完成したライブラリ多重 NGS に適してする必要があります 〜 200-600 bp 間の範囲し、任意プライマー二量体の欠けている(図 2 b).後のシーケンスには、MAC など、パイプラインのこれ以降の手...

ここでは、最適化された高スループット チップ シーケンス プロトコルと冷凍腫瘍組織や細胞からゲノム クロマチン状態パターンの定量計算解析パイプラインについて述べる。

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

このプロトコルの全体的な目標は、腫瘍組織およびがん細胞株における組み合わせクロマチン状態パターンを偏りなく同定することです。この方法は、不毛なヒストン修飾状態が腫瘍の発生にどのように寄与するかなど、がんエピジェネティクス分野の重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。この技術の主な利点は、複数のヒストン修飾と複数のサンプルを同時に、かつ効率的に処理できることです。まず、50ミリグラムのメラノーマ組織を手動で解離し、2ミリリットルのハンク平衡塩溶液またはHBSSを滅菌カミソリの刃を使用して解離します。無菌組織培養皿で組織を3mmまたは4mmに約5分間ミンクします。組織溶液を解離チューブに移し、さらに8ミリリットルのHBSSを追加します。さらに、解離器を用いて、均質化されるまで組織を解離する。次に、組織を架橋し、HBSSの3ミリリットルあたり200マイクロリットルの16%ホルムアルデヒドを追加します。ミキサーを使用して、混合物を10rpmで摂氏37度で正確に10分間振とうします。インキュベーターからサンプルを取り出した後、サンプル3ミリリットルあたり200マイクロリットルの腫瘍グリシンを追加し、混合物を摂氏37度で10rpmで5分間振とうします。ベンチトップ遠心分離機を使用して、サンプルを934倍gで摂氏4度で5分間回転させます。終了したら、上清を取り除き、5ミリリットルの氷冷PBSを追加します。その後、サンプルを再び934 gで遠心分離し、上清を除去します。組織50ミリグラムあたり300マイクロリットルのChIPハーベストバッファーとプロテアーゼ阻害剤を加え、サンプルを氷上で30分間溶解します。細胞が溶解している間に、ウォーターバスディスラプターと関連する冷却システムをオンにし、温度が摂氏4度に達するまで待ちます。超音波処理管を水浴破壊器に入れ、黒色腫組織を30秒オンと30秒オフで60サイクル超音波処理して、200〜600塩基対のクロマチン断片を取得します。8ミリグラムの黒色腫組織の場合、チューブリボルバーを使用して、各ヒストン抗体3マイクログラムを20マイクロリットルのプロテインg磁気ビーズおよび100マイクロリットルの結合ブロッキングバッファーと4°C回転させて2時間インキュベートします。超音波処理後、ChIP希釈バッファーを使用してサンプルを5倍希釈し、SDS濃度を0.1%に下げます抗体とタンパク質g磁気ビーズのインキュベーションが完了した後、ChIP希釈バッファーを取り外し、ビーズを240マイクロリットルの新鮮なバッファーに再懸濁します。次に、ビーズの20マイクロリットルアリコートを12本の別々のチューブに入れ、それぞれが別々の組織サンプルに使用されます。超音波処理された材料を特異的抗体を含むタンパク質gビーズに均等に分注し、チューブリボルバーを使用してチューブを摂氏4度で一晩回転させます。逆架橋の翌朝、抗体タンパク質溶液を96ウェルプレートに移し、磁気スタンドに置きます。ビーズを30秒以上付着させた後、上清液を取り除きます。マルチチャンネルピペットを使用して、150マイクロリットルの氷冷RIPA洗浄バッファーでビーズを5回洗浄します。洗浄ごとに磁石を30秒間連続して動かしてから、上清を取り除きます。洗浄ステップの後、チップあたり44マイクロリットルの直接溶出バッファー、1マイクロリットルのRnase、および5マイクロリットルのプロテナーゼkを含む溶出バッファーマスターミックスを追加し、逆架橋のためにサンプルをインプットします。PCRサーマルサイクラーを使用して、摂氏37度で4時間、摂氏50度で4時間、摂氏65度で8〜16時間サンプルをインキュベートします。翌朝、サンプルを磁石に戻し、上清をアミノ沈殿DNAを含む新しい96ウェルPCRプレートに移します。溶液に2.3×常磁性ビーズを加え、マルチチャンネルピペットを使用して25回慎重にピペットを上下させます。その後、室温で4分間インキュベートします。次に、サンプルを磁石に戻し、室温でさらに4分間インキュベートします。上清を捨てた後、サンプルに150マイクロリットルの70%エタノールを加え、ビーズを乱さずに室温で30秒間インキュベートします。ビーズを乾燥させた後、磁石からサンプルを取り出し、30マイクロリットルの10ミリモルトレーサールを追加します。ピペッティングで25回混合します。サンプルを室温でインキュベートした後、磁石に戻し、室温でさらに4分間インキュベートします。各サンプルの20マイクロリットルを新しい96ウェルプレートに移し、ライブラリ調製を行います。PCR増幅後、サンプルを取り出し、核を含まない水を使用して総容量を100マイクロリットルにします。まず、各サンプルに55マイクロリットルのビーズを加え、ピペットで25回混合することにより、両面常磁性サイズ選択を行います。その後、室温で4分間インキュベートします。サンプルを磁石に戻し、室温でさらに4分間インキュベートすると、シーケンシングに適さないビーズ上の大きな断片が得られます。インキュベーション後、上清を新しい96ウェルPCRプレートに移します。さらに25マイクロリットルの常磁性ビーズを加え、ピペッティングで25回混合し、磁石から室温で4分間インキュベートします。室温でインキュベートした後、サンプルを磁石に戻し、室温で4分間インキュベートします。次に、上清を捨てます。サンプルを磁石に残したまま、150マイクロリットルの70%エタノールを加え、ビーズを乱さずに室温で30秒間インキュベートします。エタノールを取り除き、洗浄を繰り返します。ビーズを乾燥させた後、磁石からサンプルを取り出し、10ミリモルトレーサルpH8.0の25マイクロリットルを追加します。ピペッティングで25回混合し、室温で磁石から4分間インキュベートします。室温でインキュベートした後、サンプルを磁石に戻し、室温で4分間インキュベートします。次に、マルチプレックス化する前に高感度DNAエレクトロフェログラム装置を使用してライブラリを定量し、サイズがシーケンシングに適していることを確認します。このプロトコルにより、凍結腫瘍組織および細胞株の免疫沈降が可能になり、ハイスループット法を使用して数十のサンプルに対して並行して実行できます。クロマチンフラグメントは、最適な免疫沈降のために200〜1000塩基対の範囲である必要があります。精製されたChIP DNAは、ライブラリー調製に進む前に定量する必要があります。マルチプレックスおよび次世代シーケンシングに適した完成したライブラリは、200〜600塩基対の範囲であり、プライマーダイマーを含まない必要があります。ポストシーケンシングでは、パイプラインの次のステップに進む前に満たすべき多くの品質管理指標(macs peak callingやchromHmm解析など)があります。ChIPサンプルはインプットDNA上で濃縮し、各ヒストン修飾はエピジェネティックなランドスケープの特定の成分を表す明確なプロファイルを示す必要があります。クロムHMMアルゴリズムは、多変量隠れマルコフモデルを使用して、研究されたヒストン修飾に基づいて、最も顕著な反復する組み合わせおよび空間クロマチンパターンを特定します。これらの6つの修飾を用いて、chrome HMMは、ポリコーム抑制、ヘテロクロマティック抑制、活性転写、活性エンハンサーなど、抑制ドメインと活性ドメインの両方を表す機能的に異なるクロマチン状態を同定します。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、3〜4日で完了します。この手順を試行する際には、ライブラリ調製とデータ解析に進む前に、抗体の最適な超音波処理条件と仕様を決定することが重要です。この手順を学習するために、RRSシーケンシングや染色体確認キャプチャなどの他の方法を実行して、クロマチン状態部分と遺伝子発現および高クロマチン構造の連合を決定することができます。実験後、この技術は、がんエピジェネティクス分野の研究者が患者の腫瘍サンプルのクロマチン状態パターンを調査する道を開きました。このビデオを見れば、腫瘍組織の処理と解離の方法、クロマチン免疫沈降の実施方法、nextgenシークエンスのためのライブラリーの準備方法、ポストシーケンシングデータの処理方法、ダウンストリーム解析の初期ステップに関する洞察を得る方法について十分に理解できるはずです。ホルムアルデヒドを扱う場合、非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、適切なドラフトなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

ペアエンドタグシーケンシング（CHIA-PET）によるクロマチンの相互作用分析のための方法です。...

クロマチンの相互作用のマッピングと転写調節を理解するためのペアエンドタグシーケンシング（CHIA-PET）によるクロマチンの相互作用の解析

クロマチン免疫沈降法と超高スループットシーケンシング（チップ-SEQ）の組み合わせは、所定の組織または細胞株におけるタンパク質-DNA相互作用を特定し、マッピングすることができます。概説としては、例えば、転写因子TCF7L2の経験を使用して、その後の配列決定のための高品質のChIPテンプレートを生成する方法である。...

ハイスループットシーケンシングのための高品質クロマチン免疫沈降DNAテンプレート（チップ-SEQ）の生成

ここでは前例のないスループットDNA損傷のコメットアッセイの検出を可能にするプラットフォームについて説明します。デバイスパターンマイクロアレイへの哺乳動物細胞および96サンプルの並列処理を可能にします。アプローチは、基本レベルのDNA損傷、曝露によって誘導されるDNA損傷とDNA修復の動態の解析を容易にする。...

CometChip：マイクロアレイヒト細胞におけるDNA損傷を測定するためのハイスループット96ウェルプラットフォーム

ネイティブ組み合わせると高解像度質量分析とクロマチン免疫沈降を架橋することにより、ChroPアプローチはヒストン修飾、変異体及び機能的に異なるクロマチンドメインで相乗非histonicタンパク質の複合プロテオミクスアーキテクチャを分析することができます。...

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

腫瘍学検体の標的次世代シーケンシングのための統合システムが説明されています。このクロスプラットフォームシステムは、低品質および少量の腫瘍生検に最適化されており、低DNAインプットに対応し、十分に特徴付けられた多変量コントロールを含み、定量的な分析前品質管理手段によって通知される新しいバリアントコーラーを備えています。...

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

本論文では、ChIP液体ハンドラプラットフォームを用いた特定のヒストン修飾(H3K27ac)に関連するDNA領域の半自動マイクロスケールのChIP-Seqプロトコルについて説明し、続いてタグメンテーションを用いたライブラリ調製について述べている。この手順には、品質と量の目的に対する制御評価が含まれており、他のヒストン修飾または転写因子に採用することができます。...

大規模エピジェネティック研究のための半自動化されたChIP-Seq法

ATAC-seqは、多動変異トランスポザーゼTn5を使用して、転写因子によって媒介されるクロマチンアクセシビリティの変化をマッピングするDNAシーケンシング法です。ATAC-seqは、がん細胞の表現型変化の根底にある分子メカニズムの発見を可能にします。このプロトコルは、がん細胞を含む上皮細胞タイプにおけるATAC-seqの最適化手順の概要を示しています。...

がんエピジェネティクス研究のためのATAC-Seq最適化

遺伝子発現は、遺伝子プロモーターと遠位調節要素との相互作用によって調節される。ここでは、低入力のCapture...

希少細胞集団におけるプロモーター中心の時空間ゲノム構造を研究するための統合ワークフロー

マイクロ流体ベースのハイスループット循環腫瘍細胞選別およびシングルセルシーケンシング技術

ヌクレアーゼを用いた最適化された標的下切断および放出法と、次世代シーケンシング(CUT&amp;RUN-seq)プロトコルが、神経内分泌小細胞肺がん細胞株に対して記述されています。この技術は、SCLCの病理生物学におけるエピジェネティックおよび転写脱調の研究を可能にするため、さまざまなヒストン修飾および転写因子(例:E2F7)結合部位のゲノムワイドマッピングを可能にします。...

CUT&amp;RUNを用いた神経内分泌小細胞肺がん細胞株におけるヒストン修飾および転写因子結合部位のゲノムワイドマッピング

学ぶ高スループットChIPシーケンスを用いた腫瘍組織のクロマチン状態解析法。複数のヒストン修飾を同時に効率的に処理し、がんエピジェネティクス研究における治療標的探索への貴重なツールを提供します。

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