腫瘍組織に高スループット チップ シーケンスを用いたクロマチン状態のゲノム マッピングの統合プラットフォーム

このプロトコルの全体的な目標は、腫瘍組織およびがん細胞株における組み合わせクロマチン状態パターンを偏りなく同定することです。この方法は、不毛なヒストン修飾状態が腫瘍の発生にどのように寄与するかなど、がんエピジェネティクス分野の重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。この技術の主な利点は、複数のヒストン修飾と複数のサンプルを同時に、かつ効率的に処理できることです。

まず、50ミリグラムのメラノーマ組織を手動で解離し、2ミリリットルのハンク平衡塩溶液またはHBSSを滅菌カミソリの刃を使用して解離します。無菌組織培養皿で組織を3mmまたは4mmに約5分間ミンクします。組織溶液を解離チューブに移し、さらに8ミリリットルのHBSSを追加します。

さらに、解離器を用いて、均質化されるまで組織を解離する。次に、組織を架橋し、HBSSの3ミリリットルあたり200マイクロリットルの16%ホルムアルデヒドを追加します。ミキサーを使用して、混合物を10rpmで摂氏37度で正確に10分間振とうします。

インキュベーターからサンプルを取り出した後、サンプル3ミリリットルあたり200マイクロリットルの腫瘍グリシンを追加し、混合物を摂氏37度で10rpmで5分間振とうします。ベンチトップ遠心分離機を使用して、サンプルを934倍gで摂氏4度で5分間回転させます。終了したら、上清を取り除き、5ミリリットルの氷冷PBSを追加します。

その後、サンプルを再び934 gで遠心分離し、上清を除去します。組織50ミリグラムあたり300マイクロリットルのChIPハーベストバッファーとプロテアーゼ阻害剤を加え、サンプルを氷上で30分間溶解します。細胞が溶解している間に、ウォーターバスディスラプターと関連する冷却システムをオンにし、温度が摂氏4度に達するまで待ちます。

超音波処理管を水浴破壊器に入れ、黒色腫組織を30秒オンと30秒オフで60サイクル超音波処理して、200〜600塩基対のクロマチン断片を取得します。8ミリグラムの黒色腫組織の場合、チューブリボルバーを使用して、各ヒストン抗体3マイクログラムを20マイクロリットルのプロテインg磁気ビーズおよび100マイクロリットルの結合ブロッキングバッファーと4°C回転させて2時間インキュベートします。超音波処理後、ChIP希釈バッファーを使用してサンプルを5倍希釈し、SDS濃度を0.1%に下げます抗体とタンパク質g磁気ビーズのインキュベーションが完了した後、ChIP希釈バッファーを取り外し、ビーズを240マイクロリットルの新鮮なバッファーに再懸濁します。

次に、ビーズの20マイクロリットルアリコートを12本の別々のチューブに入れ、それぞれが別々の組織サンプルに使用されます。超音波処理された材料を特異的抗体を含むタンパク質gビーズに均等に分注し、チューブリボルバーを使用してチューブを摂氏4度で一晩回転させます。逆架橋の翌朝、抗体タンパク質溶液を96ウェルプレートに移し、磁気スタンドに置きます。

ビーズを30秒以上付着させた後、上清液を取り除きます。マルチチャンネルピペットを使用して、150マイクロリットルの氷冷RIPA洗浄バッファーでビーズを5回洗浄します。洗浄ごとに磁石を30秒間連続して動かしてから、上清を取り除きます。

洗浄ステップの後、チップあたり44マイクロリットルの直接溶出バッファー、1マイクロリットルのRnase、および5マイクロリットルのプロテナーゼkを含む溶出バッファーマスターミックスを追加し、逆架橋のためにサンプルをインプットします。PCRサーマルサイクラーを使用して、摂氏37度で4時間、摂氏50度で4時間、摂氏65度で8〜16時間サンプルをインキュベートします。翌朝、サンプルを磁石に戻し、上清をアミノ沈殿DNAを含む新しい96ウェルPCRプレートに移します。

溶液に2.3×常磁性ビーズを加え、マルチチャンネルピペットを使用して25回慎重にピペットを上下させます。その後、室温で4分間インキュベートします。次に、サンプルを磁石に戻し、室温でさらに4分間インキュベートします。

上清を捨てた後、サンプルに150マイクロリットルの70%エタノールを加え、ビーズを乱さずに室温で30秒間インキュベートします。ビーズを乾燥させた後、磁石からサンプルを取り出し、30マイクロリットルの10ミリモルトレーサールを追加します。ピペッティングで25回混合します。

サンプルを室温でインキュベートした後、磁石に戻し、室温でさらに4分間インキュベートします。各サンプルの20マイクロリットルを新しい96ウェルプレートに移し、ライブラリ調製を行います。PCR増幅後、サンプルを取り出し、核を含まない水を使用して総容量を100マイクロリットルにします。

まず、各サンプルに55マイクロリットルのビーズを加え、ピペットで25回混合することにより、両面常磁性サイズ選択を行います。その後、室温で4分間インキュベートします。サンプルを磁石に戻し、室温でさらに4分間インキュベートすると、シーケンシングに適さないビーズ上の大きな断片が得られます。

インキュベーション後、上清を新しい96ウェルPCRプレートに移します。さらに25マイクロリットルの常磁性ビーズを加え、ピペッティングで25回混合し、磁石から室温で4分間インキュベートします。室温でインキュベートした後、サンプルを磁石に戻し、室温で4分間インキュベー

次に、上清を捨てます。サンプルを磁石に残したまま、150マイクロリットルの70%エタノールを加え、ビーズを乱さずに室温で30秒間インキュベートします。エタノールを取り除き、洗浄を繰り返します。

ビーズを乾燥させた後、磁石からサンプルを取り出し、10ミリモルトレーサルpH8.0の25マイクロリットルを追加します。ピペッティングで25回混合し、室温で磁石から4分間インキュベートします。室温でインキュベートした後、サンプルを磁石に戻し、室温で4分間インキュベー

次に、マルチプレックス化する前に高感度DNAエレクトロフェログラム装置を使用してライブラリを定量し、サイズがシーケンシングに適していることを確認します。このプロトコルにより、凍結腫瘍組織および細胞株の免疫沈降が可能になり、ハイスループット法を使用して数十のサンプルに対して並行して実行できます。クロマチンフラグメントは、最適な免疫沈降のために200〜1000塩基対の範囲である必要があります。

精製されたChIP DNAは、ライブラリー調製に進む前に定量する必要があります。マルチプレックスおよび次世代シーケンシングに適した完成したライブラリは、200〜600塩基対の範囲であり、プライマーダイマーを含まない必要があります。ポストシーケンシングでは、パイプラインの次のステップに進む前に満たすべき多くの品質管理指標(macs peak callingやchromHmm解析など

ChIPサンプルはインプットDNA上で濃縮し、各ヒストン修飾はエピジェネティックなランドスケープの特定の成分を表す明確なプロファイルを示す必要があります。クロムHMMアルゴリズムは、多変量隠れマルコフモデルを使用して、研究されたヒストン修飾に基づいて、最も顕著な反復する組み合わせおよび空間クロマチンパターンを特定します。これらの6つの修飾を用いて、chrome HMMは、ポリコーム抑制、ヘテロクロマティック抑制、活性転写、活性エンハンサーなど、抑制ドメインと活性ドメインの両方を表す機能的に異なるクロマチン状態を同定します。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、3〜4日で完了します。この手順を試行する際には、ライブラリ調製とデータ解析に進む前に、抗体の最適な超音波処理条件と仕様を決定することが重要です。この手順を学習するために、RRSシーケンシングや染色体確認キャプチャなどの他の方法を実行して、クロマチン状態部分と遺伝子発現および高クロマチン構造の連合を決定することができます。

実験後、この技術は、がんエピジェネティクス分野の研究者が患者の腫瘍サンプルのクロマチン状態パターンを調査する道を開きました。このビデオを見れば、腫瘍組織の処理と解離の方法、クロマチン免疫沈降の実施方法、nextgenシークエンスのためのライブラリーの準備方法、ポストシーケンシングデータの処理方法、ダウンストリーム解析の初期ステップに関する洞察を得る方法について十分に理解できるはずです。ホルムアルデヒドを扱う場合、非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、適切なドラフトなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。