Name: ヘリコバクター ・ ピロリ感染と胃の病理のマウス ・ モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 学ぼう、Helicobacter pylori感染と胃の病理をマウスモデルで研究する方法。細菌接種、組織病理学的解析、炎症とがん発生の評価を通じて、胃腸感染症の病態理解と新規治療法開発に貢献する知見を得られます。

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著者は、さん A. ・ デ ・ パオリとさんジョージー Wray マッキャンにテクニカル サポートに感謝したいと思います。著者は、モナッシュ組織プラットフォーム、解剖学と発生生物学、モナッシュ大学の技術支援施設の利用を認めます。研究室は、RLF (APP1079930、APP1107930) に国立保健医療研究審議会 (NHMRC) からの資金によってサポートされます。RLF は NHMRC (APP1079904) から上級研究員によってサポートされます。モナッシュ大学院奨学金、KD と MC を両方ともサポートします。KD もサポートされてセンター自然免疫とハドソン研究所医学研究の感染性疾患の MC に医学部、看護、保健、モナシュ大学からの国際大学院奨学金があるとき。医学研究のハドソン研究所での研究は、ビクトリア朝の政府の運用インフラストラクチャ サポート プログラムによってサポートされます。

<ol><li>Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Helicobacter+pylori+infection+and+public+health+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Helicobacter%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications.</a> Helicobacter. 16, Suppl 1. 1-9 (2011).</li>
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<li>Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Helicobacter+felis+colonization+in+male+129%2FSv+mice+fails+to+suppress+gastritis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis.</a> Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).</li>
<li>Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbred+mice+with+long-term+Helicobacter+felis+infection+develop+both+gastric+lymphoid+tissue+and+glandular+hyperplastic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions.</a> The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).</li>
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このプロトコルでは、ヘリコバクター ・ ピロリ感染症のため生体内でマウス モデルの使用について説明します。プロシージャの重要なステップは、: 1) 実行可能なおよび運動性細菌を含むヘリコバクター ・ ピロリ接種の準備2) 胃内強制経口投与; 経由のマウスへの細菌の適切な数の配信3) コロニー カウントおよび/または pcr 法による細菌感染症の検出・ 4) の病理組織学的評価を有効にするために胃組織の処理感染の胃。トラブルシューティングおよび技術的な考慮事項変更のためのそれ以上の提案を以下に示します。
馬血液を添加した血液寒天培地ベース第 2 を使用してピロリ菌を成長させる方法は、当研究室でよく確立されています。ただし、代替寒天拠点などブルセラ寒天とコロンビア血液寒天培地に使用される22にすることができます。洗剤は無料ですだけ滅菌ガラスを使用して成長培地を準備することを確認することが重要です。さらに、最適な成長を得るためには、ピロリ菌は、残留水分...

ピロリ菌、螺旋状で、グラム陰性菌、人間胃病原体すべての人口で現在 801順と推定される開発途上国の感染率で、世界中。ほとんどピロリの感染した人はいくつかのより重篤な疾患、胃癌2消化性潰瘍に至る開発、無症候性であります。H. ピロリ菌の上皮細胞 (GECs) の悪性変化またはリンパ節外胃、胃腺癌の結果または粘膜関連リンパ組織の形成によって関連付けられている癌の特徴広くティッシュ (モルト) リンパ腫、それぞれ。H. ピロリ菌は様々 な病原性因子とその付着、成長、このニッチ市場で代謝を促進する機構が存在するため胃の過酷な生態学的ニッチ市場で生き残るために適応高。特に、ピロリ菌の病原性菌株所有 40 kb cag病原性アイランド (cagパイ) タイプ 4 分泌システム (T4SS)3,4 の生産のために必要な約 30 遺伝子をエンコードします。.cagPAI 陽性ピロリ菌は胃癌の5の重要な前駆体として関与しているホストの慢性的な炎症のより高いレベルの誘導に関連付けられています。
ホスト、ピロリ感染と病気の結果6細菌と環境要因の相対的な貢献を調査する研究者を許可することで、生体内で動物モデル、特にマウスを非常に有益されています。H. ピロリ菌を延長する以前の調査は示した感染症慢性胃炎および腺の開発における C57BL/6 遺伝的背景結果上でマウスの萎縮、ピロリ感染7の両方の特徴。さらに、似たような病理と病進行人間 MALT リンパ腫8,9に見られるようにマウスで麦芽の形成を誘導する関連猫/犬細菌種H. felis感染が示されています。H. ピロリ菌を使用頻度の高いマウス植民地研究の分離は「シドニーひずみ 1」(SS1) ひずみ10、 cagパイ+ですが、非機能的な T4SS を持つ (T4SS−)11。他の広く使用されている系統は、 h. ピロリ菌B128 7.13 (cagパイ+/T4SS+)12 X47 2AL (cagパイ-/T4SS−)13。H. felis感染症、ひずみ CS1 (「猫スパイラル 1 を」、 cagパイ-/T4SS−) 一般的に使用される14。
本明細書で提供体内感染ヘリコバクター ・ ピロリ接種、マウスの胃内強制経口投与の手順だけでなく、病理組織学的変化の研究のためのティッシュの処理の方法の準備を記述するプロトコル胃。特に、この記事細菌の植民地化を視覚化し、感染マウスの胃粘膜における麦芽の形成を含む、病理組織学的変化を評価するために使用する組織学的方法に焦点を当てます。ここで説明する方法のいくつかはs.など他の腸病原体の研究に適応させることネズミチフス菌またはC. 囓。

<table><tbody><tr><td>Bacteriological Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxoid Blood Agar Base No.2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>CM0271B</td><td>滅菌前に脱イオン水に溶解</td></tr>します <tr><td>プレミアム除細動馬の血液</td><td>Australian Ethical Biologicals</td><td>PDHB100</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Brain Heart Infusion Broth</td><td>BD Bioscience</td><td>237500</td><td>滅菌前に脱イオン水に溶解</td></tr><tr><td>CampyGen ガスパック</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>CN0035A/CN0025A</td><td></td></tr><tr><td>Histological reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン、中性緩衝液、10%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>無水アルコール、100% 変性</td><td>ChemSupply</td><td>AL048-20L-P</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール(2-プロパノール)</td><td>メルク</td><td>100995</td><td></td></tr><tr><td>キシレン(硫黄フリー)</td><td>ChemSupply</td><td>XT003-20L</td><td></td></tr><tr><td>メイヤーズヘマトキシリン</td><td>琥珀色科学</td><td>MH-1L</td><td>フィルター使用前</td></tr><tr><td>エオシン、水性ステイン</td><td>琥珀色科学</td><td>EOCA-1L</td><td>フィルター使用前</td></tr>ライト<tr><td>ギムサステイン、修正</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>WG80-2.5L</td><td>使用前に希釈してください(20%Giemsa、80%脱イオン水)</td></tr><tr><td>Histolene</td><td>Grale Scientific</td><td>11031/5</td><td></td></tr><tr><td>DPX封入剤</td><td>VWR</td><td>1.00579.0500</td><td></td></tr><tr><td>Molecular biology reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>この研究で使用した ureBプライマーのアニーリング温度は61°Cです。C</td></tr><tr><td>GoTaq Flexi DNAポリメラーゼ</td><td>Promega</td><td>M8291</td><td>キットには、10x PCRバッファーと塩化マグネシウム</td></tr><tr><td>dNTPが含まれています</td><td>バイオライン</td><td>BIO-39028</td><td>使用前に滅菌ヌクレアーゼフリー水で10 mMに希釈</td></tr><tr><td>分子グレードアガロース</td><td>バイオライン</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>炭酸水素</td>ナトリウム<td>ユニバール(Ajax Fine Chemicals)</td><td>A475-500G</td><td></td></tr><tr><td>マグネシウム硫酸塩七水和物</td><td>Chem-Supply</td><td>MA048-500G</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>バンコマイシン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V2002-1G</td><td>脱イオン水に溶解</td></tr><tr><td>ポリミキシン B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4932-5MU</td><td>脱イオン水に溶解</td></tr><tr><td>トリメトプリム (&ge;98% HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7883</td><td>100%(絶対)エタノールに溶解</td></tr><tr><td>Amphotericin</td><td>Amresco (Astral Scientific)</td><td>E437-100MG</td><td>脱イオン水に溶解</td></tr><tr><td>バシトラシン Bacillus licheniformis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0125</td><td>脱イオン水に溶解</td></tr><tr><td>ナラジクス酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8878</td><td>脱イオン水に溶解</td></tr><tr><td><ストロング>その他の試薬</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>メトキシフルラン(ペントロングス)</td><td>メディカル・デベロップメント・インターナショナル</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>パラフィンワックス</td><td>パラプラスプラス、ライカバイオシステムズ</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>機器およびプラスチック製品</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>オキソイド 嫌気性ジャー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>HP0011/HP0031</td><td></td></tr><tr><td>COPAN パスツールピペット</td><td>インターパスサービス</td><td>200CS01</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ 5810R 遠心分離</td><td></td><td></td>機 <td>2,200rpmで10分間、4°Cで遠心分離し、細菌ペレットを回収します。C</td></tr><tr><td>23 g 精密グライドニードル</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>301805</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム M</td><td>ベミス、VWR</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>ポルテックス ファインボア ポリエチレンチューブ</td><td>スミスメディカル</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック栄養カテーテル</td><td>インステック&nbsp;研究所</td><td>FTP20-30</td><td></td></tr><tr><td>1 mL ツベルクリン ルアー スリップ 使い捨て注射器</td><td>BD Bioscience</td><td>302100</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ 1.2 - 2 mL チューブ用</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>Z317314</td><td>胃の均質化に使用されるオートクレーブ可能なポリプロピレン乳棒</td></tr><tr><td>GentleMACs Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>マウス胃組織用のプリセット gentleMACS プログラムを使用します</td></tr><tr><td>M チューブ (オレンジキャップ)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>30-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>滅菌プラスチックループ</td><td>LabServ</td><td>LBSLP7202</td><td></td></tr><tr><td>Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System</td><td>Leica Biosystems</td><td>該当</td><td></td>なし</tr><tr><td>Tissue-Tek ベースモールドシステム, ベースモールド 38 x 25 x 6</td><td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td><td>4124</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek III Uni-Casette System</td><td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td><td>4170</td><td></td></tr><tr><td>Microtome, Leica RM2235</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Charged SuperFrost Plus glass slides</td><td>Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr></tbody></table>

ヘリコバクター ・ ピロリ感染と胃の病理のマウス ・ モデル

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

ピロリ菌は、世界の人口の半分に存在し人間の死亡率と罹患率の重要な原因は、胃の病原体です。胃ヘリコバクター ・ ピロリ感染症のいくつかのマウス モデルというピロリ菌の人間のホストの胃を植民地化し、病を引き起こす分子・細胞メカニズムの研究開発されています。ここに、プロトコルについて述べる: 1) 胃内強制経口投与; を介してマウスの生体内感染の細菌懸濁液を準備2) ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)、生菌数計測; マウス胃組織で細菌の植民地化のレベルを決定します。3) 組織学による病理学的変化を評価します。Helicobact小胞体に感染するのにマウス、特定病原体フリー (SPF) 動物は最初に懸濁液 (≥105コロニー形成単位、CFUs を含む) のいずれかのピロリ菌の系統のマウス-植民地化と再接種または動物から他胃のヘリコバクター属などピロリ felis 。適切な時点後感染症で胃は切除、幽門部と体の領域を構成する各 2 等しい組織片に大の解剖。他は組織学的処理に服従する中、これらのフラグメントの 1 つ、生菌数計測または DNA の抽出のいずれかの使用されます。細菌の植民地化および胃の病理組織学的変化は、胃組織切片を腺リンパ星空、ギムザまたはヘマトキシリンとエオシン (H & E) 汚れに応じて染色で日常的に評価が。免疫組織化学またはマウス胃組織切片を蛍光抗体法によって追加の免疫学的解析を実施もことがあります。下記プロトコルを人間関連のh. ピロリ菌に似た胃の病態のマウスの評価を有効にする設計疾患、炎症、腺萎縮とリンパ濾胞形成を含みます。接種材料の準備および胃内強制経口投与プロトコルもサルモネラ菌やシトロバクター属齧歯類などのマウスを植民地化他の腸溶性ひと病原体の病因を研究に適応させること。

このプロトコルでは、胃内感染ピロリまたはH. felisマウス マウス モデル (図 1) を達成するために経口技術について説明します。次の安楽死、胃が削除の重量を量った、前庭、体と胃組織 (図 2) の非腺領域で構成される 2 値の半分に分かれています。非腺領域は、すべての解析を実行する前に削除されます。
H. ピロリ菌の生菌数計測を行って動物の成功植民地化を確認して通常-胃のホモジネートを感染し、その後 HBA プレート (図 3) の個々 のコロニーを列挙します。また、 H. felis H. felisのh. ピロリ菌の ureB遺伝子 (図 4) 325 bp の領域を特定、検証されたプライマーを使用すると感染症の確認に PCR ...

マウスは、感染症や消化管微生物によって引き起こされる病気を研究する非常に貴重な生体内でモデルを表します。ここで、細菌の植民地化およびピロリ菌のマウス ・ モデルにおける病理組織学的変化を研究するために使用するメソッドを説明-関連の病気。

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

この方法は、微生物叢のメンバー、特にヘリコバクター属のメンバーが炎症および癌に及ぼす影響に関する消化器内科分野の重要な質問に答えるのに役立つ。この技術の主な利点は、ヘリコバクター感染の研究と生理学的条件下での胃への影響を可能にすることです。この技術の影響は、ヘリコバクター感染の予防または排除、または抗生物質、薬物、またはワクチンを含むその結果のための治療法の開発にまで及ぶ。これらの方法は、ヘリコバクター感染の病因に特異的な洞察を提供する。しかし、いくつかの技術は、他の胃腸病原体の研究に適応され得る。一般的に、この方法に新しい個人は、マウスに感染を確立することができる細菌接種の調製に苦労するだろう。ヘリコバクター分離株は、インビトロで広範なサブカルチャーを受けていないマウスコロニー形成株として知られていることが不可欠です。さらに、これらの株のためのインビトロサブ培養の数を記録する必要があります。15ミリリットルポリスチレンチューブに細菌懸濁液を加え、プラスチックループを使用して、各培養液滴から個々のガラス顕微鏡スライドに10〜20マイクロリットルの液滴を移します。次に、100倍の倍率で位相対視下で細菌の生存率と運動性を評価する。細菌の大部分が細菌の形状を有する場合にのみ、H.pyloriイノクラを使用してください。H.フェリスイノクラは、主にヘリカル型細菌を含むべきである。そして、イノクラを個々の使い捨て、1ミリリットルの注射器にロードします。各注射器に23ゲージの針を装備し、プラスチックパラフィンフィルムを使用して、各針に使い捨てのポリエチレンカテーテルを取り付けます。次に、6〜8週齢の特異的病原体フリーマウスとヘリコバクターフリーマウスを首と尾の擦り傷で手動で拘束し、1つのカテーテルを開いた顎の中心に挿入する。カテーテルを口蓋に向かって導き、マウスの首を伸ばして食道を通して胃にアクセスしやすくし、カテーテルのほとんどまたはすべてが見えなくなり、抵抗が感じられるまで気管から離れる。次いで、最適なコロニー形成および疾患病態を確保するために、少なくとも1回10回を第5の細菌に送達する。実験の最後に、細かい湾曲したはさみを使用して腹腔を開き、胃の切除を行います。大きな湾曲に沿って胃を切断し、任意の残留食品を除去するために、洗浄ごとに新鮮なPBSの1つの50ミリリットルチューブでオルガンを2回静かに洗います。2回目の洗浄の後、組織をタール、6センチメートル、プラスチックペトリ皿に入れ、濡れた重量を記録します。胃を平らにした後、試料を角栓、身体、および非腺前胃領域を含む2つの等しい組織断片に射手的に二分する。非腺領域を取り除き、計画下流分析のために適切な溶液に組織片を貯蔵する前に、各胃の半分を計量する。10%ホルマリンを含む15ミリリットルの円錐管に胃組織の残りの半分を加え、10秒後に組織をチューブの上面に平らにします。組織がチューブ壁に貼り付けられたら、サンプルをホルマリンに少なくとも24時間浸し直します。胃内の生存可能なH.pyloriの数を数えるために、BHIに保存された胃試料を均質化し、生じた胃均質物の重複した連続希釈を新鮮な無菌のスープで行う。乾燥した馬の血液寒天、またはHBAを3つまたは4つのセグメントに追加の抗生物質を添加したプレートを分割し、マイルとミスラ技術の適応を使用して、各寒天プレートのセグメントに各胃ホモゲネート希釈液の10〜100マイクロリットルを追加します。ホモジナイートを無菌のプラスチックループで広げ、プレートを乾燥させます。次に、水のペトリ皿とガスパックを含む嫌気性ガス瓶の逆の位置にプレートを置きます。その後、瓶を摂氏37度で4~7日間インキュベートします。コロニーが観察される場合は、10〜100個の孤立したコロニーを含むセグメントを列挙する。安楽死後、胃は動物から収穫され、体重を量る。非腺領域は除去され、胃はアントルムと体を含む2つの等しい半分に分けられる。正常なコロニー形成は、典型的には、HBAプレートに縞状胃均質から個々のコロニーの生存可能なカウントおよびその後の列挙を行うことによって確認される。なお、マウス胃微生物叢や多数のH.pyloriコロニーからの汚染細菌の存在は、H.pylori CFUsの列挙を複雑にする可能性があることに注意してください。あるいは、PCRを用いて、H.felisおよびH.pylori ureB遺伝子の325塩基対領域に向けられた特異的検証済みプライマーを使用して感染を検証することができる。この代表的な実験では、野生型C57 Black-6マウスは、H.フェリスへの感染後6ヶ月間の過形成および腺萎縮、ならびに粘膜下膜の細胞浸潤を含む中程度の炎症徴候を示した。ノックアウトマウスでは同時に重篤な炎症が認められ、リンパ系卵胞が細胞浸潤に近接して観察される。H.フェリス菌は、感染したマウスの胃組織のギームサ染色切片でも可視化することができる。この手順に従って、定量PCR、免疫体化学、または免疫蛍光などの他の方法を実行して、ヘリコバクター感染中に誘発される宿主応答の種類に関する追加の質問に答えることができる。その開発後、この技術は、微生物学と消化器内科の分野の研究者がヒトの胃疾患におけるヘリコバクター・ピロリの原因的役割を探求する道を開いた。このビデオを見た後、ヘリコバクター種のマウスに再現的に感染する方法と、感染に関連する病理を研究する方法をよく理解する必要があります。このプロトコルで使用されるヘリコバクター株は感染性であるため、これらの細菌を使用している間は常に標準的な生体安全手順に従う必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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学ぼう、Helicobacter pylori感染と胃の病理をマウスモデルで研究する方法。細菌接種、組織病理学的解析、炎症とがん発生の評価を通じて、胃腸感染症の病態理解と新規治療法開発に貢献する知見を得られます。

ヘリコバクター・ピロリ感染と胃の病理のマウス・モデル

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