精製マウス肝類洞内皮細胞と肝細胞の灌流
February 12th, 2018
このプロトコルの目的は、肝臓から高生存率および肝細胞と類洞内皮細胞の高収率を取得することです。これは、灌肝門脈、肝細胞と類洞内皮細胞を取得する差動遠心分離の続くタイプ IV コラゲナーゼの解決で。
この手順の全体的な目標は、マウス肝灌流を成功させて、目的の特定の肝細胞集団の精製を促進することです。この方法は、in vitroまたはin vivoアッセイ内で特定の肝細胞集団の機能をどのように支援するかについて、肝臓学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、各肝臓から得られる正弦波内皮細胞の肝細胞の量が多いことです。
細胞の生存率を維持するためには、最適に消化された肝臓の色と形状を確認することが不可欠であるため、この方法を視覚的に示すことは非常に重要です。門脈カテーテルを配置するには、まず鉗子の背面を使用して腸をマウス腹腔の右側に移動し、門脈を露出させ、湾曲した鉗子を使用して、肝臓と上膵十二指腸静脈の間の門脈の下に20センチメートルのポリエステル縫い糸をスライドさせます。鉗子を使用して、糸を動物の反対側に慎重に引っ張り、門脈の中央にくるようにします。
そして、門脈の周りに緩い頭上の結び目を結びます。湾曲した鉗子を静脈の下に置き、すべての組織材料を尾に向かってゆっくりと引っ張って静脈をまっすぐにします。次に、カテーテル針の斜角を門脈の下部と平行に上に向けて鉗子の近くに置き、針で静脈を優しく穿刺します。
ベベルが静脈の内腔にあるときは、バネ仕掛けの針を引っ込め、ベベルが金星の分岐領域に近づくまで、パーマーカテーテルを静脈に押し続けます。カテーテルの周りの結び目を固定したら、すぐに蠕動ポンプを毎分4ミリメートルに設定し、チューブのオス端をカテーテルのメス端に接続すると、肝臓の枝が見え始めるはずです。ドレナージのために腹部大動脈を切開します。
マスキングテープを使用して、チューブをアンダーパッドに固定します。はさみを使用して腹部の皮膚を垂直に切り、血液と灌流液の排出を可能にします。次に、まっすぐな鉗子で廃液血管を数回絞って肝臓を膨らませ、すべての血液が排出されたことを確認し、肝臓組織が白くなるまで肝臓にPBSを灌流します。
肝細胞を採取するには、まず、流出チューブをPBSの1リットルフラスコから、コラゲナーゼ-4を添加した緩衝液2を含む125ミリリットルフラスコに交換します。コラゲナーゼが肝臓に到達したら、廃液血管を短時間、しかししっかりと絞って圧力を高め、消化バッファーが肝臓のすべての葉を満たすようにします。緩衝液が肝臓の周囲の結合組織を破裂する前に、血管を解放します。
そして、全容積が組織を流れるまで、バッファーが肝臓を灌流するのを待ちます。次に、10ミリリットルの緩衝液が入った結晶化皿をマウスの隣に置き、まっすぐな鉗子とはさみを使って肝臓を皿に移します。皿を無菌組織培養フードに移し、無菌技術を使用して肝臓をつかみ、カプセルをはがします。
肝臓組織から細胞を静かに振とうし、得られた細胞溶液を100ミクロンのフィルターを通して50ミリリットルの円錐管に注ぎます。次に、フィルターから肝臓の残り物をさらにバッファー1ですすいでください。肝臓に細胞がないように見える場合は、引っ張った濾液を40ミクロンのフィルターで濾して2番目の50ミリリットルのチューブに入れ、遠心分離によって細胞を回収します。
非実質細胞と死んだ肝細胞を含む上清を氷上の新しい50ミリリットルチューブに一気に注ぎ、ペレットを保存し、次の遠心分離のためにペレットを40ミリリットルの新鮮な緩衝液に再懸濁します。正弦波内皮細胞を単離するには、非実質細胞を含む上清を遠心分離します。細胞懸濁液を1本の新しい50ミリリットルの円錐管に引き込み、総容量を最大35ミリリットルにします。
遠心分離によって引っ張られた細胞を採取し、25ミリリットルのピペットを使用して、上清を含む非実質細胞の上部25ミリリットルを氷上の新しい50ミリリットルの円錐管に慎重に移します。25ミリリットルの新鮮な培地をチューブに加え、ペレットを再懸濁して2回目の遠心分離と上清の除去を行います。次に、上清を遠心分離し、新しい50ミリリットルのチューブに15ミリリットルの50%Percoll溶液を加えます。
最も低い排出速度に設定されたピペッターを使用して、20ミリリットルの25%Percollを50%Percoll溶液に重ね、非実質細胞を摂氏4度の培地10ミリリットルに再懸濁します。細胞をPercoll溶液に慎重に重ねます。そして、密度勾配遠心分離によって細胞を分離します。
次に、溶液の最初の30ミリリットルを吸引し、プラスチック製の5ミリリットルのトランスファーピペットを使用して、密度25〜50%の勾配溶液間期に位置する正弦波内皮細胞とクッパー細胞を新しい50ミリリットルの円錐管に収集します。細胞を50ミリリットルの培地で洗浄し、チューブ底部の側面を12ミリリットルの温かい培地ですすいでながら、ペレットを再懸濁します。正弦波内皮細胞をKupffer細胞から分離するには、細胞懸濁液を加湿組織培養インキュベーター内のポリスチレンペトリ皿に8分間移します。
インキュベーションの終わりに、25ミリリットルのピペットを使用して上清を吸引し、上清を使用して、残りの正弦波内皮細胞を収集するために最低速度に設定されたピペットで皿をすすぎます。次に、正弦波内皮細胞を新しい50ミリリットルのチューブに移します。次に、細胞を遠心分離して再懸濁し、コラーゲンでコーティングされた細胞培養皿にプレーティングして細胞を回収します。
PBS固定灌流後のマウス肝臓の走査型電子顕微鏡検査を、今示したのと同様の方法で行うと、肝臓の微小解剖学的構造と肝細胞間の微絨毛の明確なビューが明らかになります。手順の初期の低速スピン中に採取された肝細胞は、ウシ血清アルブミン含有バッファーで4回洗浄した後、高い純度を示します。コラーゲン被覆ポリスチレンペトリ皿上に選択的に接着して正弦波内皮細胞を分離すると、コラゲナーゼ消化の全体的な有効性に大きく依存する83〜90%の純度が得られます。
先ほど示したように、代表的な分離手順からの光学顕微鏡を使用した定量測定により、ほぼ100%純粋な肝細胞集団の典型的な分離結果が明らかになります。そして、純度89%強の正弦波内皮細胞集団。このビデオを見れば、マウスの門脈をカテーテルする方法と、マウスの肝臓から肝細胞と正弦波内皮細胞の両方を精製する方法を十分に理解できるはずです。
この手順は、異なる密度勾配および遠心分離速度を使用して、肝細胞単離後に非実質画分からサテライト細胞を精製するためにも使用できます。
概要
このプロトコルは、肝細胞および洞状内皮細胞を高い収率で単離するためのマウス肝臓灌流の方法を概説しています。この技術は、コラーゲナーゼ溶液で肝臓を灌流し、差動遠心分離を用いて特定の肝細胞集団を精製することを含みます。
主要な研究要素
科学分野
- 肝臓学
- 細胞生物学
- イン・ビトロアッセイ
背景
- 肝細胞機能の理解は肝臓研究にとって重要です。
- 特定の肝細胞の単離は、様々なアッセイにおけるそれらの役割の研究を助けます。
- 細胞の高い生存率と収率は実験の成功に不可欠です。
- 肝臓消化の視覚的評価は細胞の完全性を維持するために重要です。
研究目的
- 肝細胞および洞状内皮細胞を単離するための信頼性の高い方法を開発すること。
- 研究における肝細胞機能の理解を深めること。
- 分野の研究者向けの詳細なプロトコルを提供すること。
使用方法
- 門脈を通じてコラーゲナーゼ溶液で肝臓を灌流すること。
- 細胞集団を分離するための差動遠心分離。
- 洞状内皮細胞のさらなる精製のための密度勾配遠心分離。
- 細胞の生存率を確保するための視覚的検査と慎重な取り扱い。
主な結果
- 肝細胞および洞状内皮細胞の成功した単離。
- 記述された方法で高い細胞生存率と収率を達成。
- 走査型電子顕微鏡による肝臓の微細解剖学の明確な視覚化。
- プロトコルは将来の肝臓学研究の枠組みを提供します。
結論
- このプロトコルは肝細胞集団を単離するのに効果的です。
- 細胞の高い収率と生存率は研究での使用をサポートします。
- この方法は肝臓生物学の理解を進めるのに役立ちます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables reliable isolation of primary hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver, providing a physiologically relevant system for studying liver-specific drug metabolism and toxicity. The method supports early discovery by delivering high-yield, viable cells for in vitro assays that inform target validation and lead optimization. By minimizing ischemia-reperfusion injury through portal vein catheterization, it enhances data reproducibility across discovery and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for interrogating hepatic target engagement and pathway modulation in vitro.
- Operational Value: Delivers consistent hepatocyte yields for functional assays that de-risk mechanistic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Enables preparation of purified sinusoidal endothelial cells for co-culture models that improve assay predictability.
- Operational Value: Supports standardized cell isolation for scalable screening platforms assessing compound effects on liver sinusoidal signaling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers a translational biomarker-aligned system for studying liver-specific drug responses prior to in vivo testing.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical evaluation by supplying well-characterized primary liver cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting early biology through lead identification by supplying validated primary hepatocytes for ADME/Tox screening and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of liver targets using primary cells that retain in vivo-like functionality.
- Screening: Delivers reproducible hepatocyte and SEC preparations for quantitative compound screening in metabolic and inflammatory pathways.
- Analytics: Generates viable cell lysates and cultured cells for biochemical readouts such as enzyme activity, cytokine release, and barrier integrity.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by providing cells that reflect murine liver biology for target validation studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation workflow for generating consistent liver cell preparations across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in liver-related target validation through use of primary, physiologically relevant cells.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via a well-defined perfusion and centrifugation protocol.
- Strategic Value: Reduces late-stage attrition by improving early detection of liver-mediated liabilities.
- Portfolio Impact: Enables risk-informed prioritization of compounds based on hepatic cell-based assay outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse surgery and vascular catheterization for successful portal vein access.
- Depends on perfusion pumps, centrifuges, and sterile tissue culture facilities for cell processing.
- Necessitates standardization of collagenase digestion times and buffer conditions across operators.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different mouse strains or ages.
- Limited by the technical challenge of portal vein catheterization in smaller mice (18–25 g), which may affect throughput.
