非正規のアミノ酸の選択圧による 'ゴールデン' 蛍光と質量分析法と蛍光タンパク質解析工学

この実験の目標は、選択圧力を組み込んで新しい金蛍光タンパク質を生成することにより、組換えタンパク質産生のための標準アミノ酸を非標準アミノ酸に置き換えることです。選択的圧力導入法は、新規な化学的特徴を有するタンパク質を作製することを目的としています。これは、タンパク質の機能を理解したり、操作したりしようとする場合に特に役立ちます。

この技術の主な利点は、一般的な組換えタンパク質生産に似ているため、実施が比較的簡単であることです。時間相関と波長相関のある蛍光は、修飾タンパク質の励起状態ダイナミクスを調べるのに役立ち、その結果、発色団に導入された非標準アミノ酸が光学特性に与える影響を理解しやすくなります。SPIは、原則として、補助栄養株および化学的に定義された培地が利用可能な任意のタンパク質生産環境に適用できます。

これには、他の細菌株や哺乳類の細胞培養も含まれます。非修飾野生型タンパク質の産生を抑制することが必須であるため、発現条件のタイミングとセットアップは非常に重要です。そのため、温度、誘導時間、培養培地の組成などの特定のパラメータを最適化する必要があります。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、セレノメチオニンなどのメチル含有アミノ酸を含むタンパク質抽出物の初期研究の後でした。その手順を実演するのは、私の研究室の学生であるAlmut Pelzerです。この手順を開始するには、トリプトファン補助栄養性大腸菌細胞をECFPの発現プラスミドで形質転換します。

単一のコロニーを使用して、アンピシリンを添加した5ミリリットルのLB培地を培養チューブに前培養液で接種します。摂氏37度、200rpmで一晩インキュベートします。翌日、1リットルの三角フラスコに一晩培養した1ミリリットルのNMM19培地を使用して、補充したNMM19培地100ミリリットルを接種します。

次に、培養物を200rpmおよび摂氏30度のオービタルシェーカーで一晩インキュベートします。翌日、30分ごとに600ナノメートルの光学密度を測定し、30分間で値の変化が0.05未満になるまで測定します。次に、5, 000倍のgと摂氏4度で培養物を10分間遠心分離して、細菌細胞を回収します。

デカンテーションして上清を捨てます。アンピシリンを添加したNMM19培地に細胞を総容量100ミリリットルまで再懸濁します。このサスペンションを同じ三角フラスコに戻します。

4-アミノインドールを最終濃度1ミリモルまで加えます。オービタルシェーカーで摂氏30度、回転数200rpmで30分間インキュベートします。30分後、IPTGを最終濃度0.5ミリモルまで培養物に添加し、標的遺伝子発現を誘導します。

オービタルシェーカーで摂氏30度、200rpmで一晩インキュベートします。翌日、5, 000倍のgと摂氏4度で10分間遠心分離することにより、細菌細胞を収穫します。デカンテーションして上清を捨てます。

細胞ペレットをマイナス20°Cまたはマイナス80°Cで凍結し、標的タンパク質の精製を行う準備が整うまで凍結します。まず、テキストプロトコルに概説されているように、細菌細胞溶解物を調製します。製造元の指示に従ってクロマトグラフィーカラムを調製した後、結合バッファーを使用して固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーカラムを平衡化します。

完了するまでライセートをカラムにロードします。クロマトグラフィー樹脂に結合した金色のタンパク質に注目してください。カラムを結合バッファーで洗浄します。

次に、溶出バッファーを使用して標的タンパク質を溶出します。目に見える金色で識別できる金蛍光タンパク質を含む溶出画分を収集してプールします。この後、製造元の指示に従って、分子量カットオフが5, 000〜10, 000の透析膜を準備します。

1ミリリットルのサンプルを少なくとも100ミリリットルの緩衝液に対して最低2時間透析します。まず、MSバッファーを使用して、タンパク質サンプルを0.1ミリグラム/ミリリットルに希釈し、最終容量が80マイクロリットルになるようにします。ピペットで丁寧に混ぜます。

溶液をガラスインサート付きのMSオートサンプラーバイアルに移し、キャップで閉じます。バイアルをフリックして気泡を取り除きます。次に、2 番目のバイアルに MS バッファーを含むブランクを調製します。

両方のバイアルをHPLCオートサンプラーに入れます。この後、製造元の指示に従ってMS機器を準備および校正します。エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析法と組み合わせた高速液体クロマトグラフィーでは、オートサンプラーの注入量を5マイクロリットルに設定します。

空白の実行の作業リストを作成し、その後に GdFP サンプル実行の作業リストを作成します。注入量、対応するオートサンプラーバイアルの位置を割り当て、ワークリストを実行します。まず、テキストプロトコルで概説されているように、時間と波長に相関した単一光子計数用の金蛍光タンパク質溶液と検出器を準備します。

単一光子計数ソフトウェアを使用して、約10, 000カウントが蛍光減衰曲線の最大取得に蓄積されるまで、毎秒約200, 000光子のカウントレートで蛍光発光を取得します。この後、サンプルキュベットをPBSバッファー中のコロイダルシリカで満たされた1センチメートルの石英キュベットと交換します。レーザーフィルターを取り出し、検出器の中央チャネルで470ナノメートルの光子を取得するためのグレーティングを調整します。

次に、放出最大値で約10, 000カウントが蓄積されるまで、機器応答関数を取得します。テキストプロトコルで概説されているように、結果のデータを変換、適合、およびプロットして、蛍光減衰時間の発光波長への依存性を表す崩壊関連スペクトルを取得します。本研究では、質量分析を用いて、スペクトル的に赤方偏移した緑色蛍光タンパク質型蛍光色素変異体(金蛍光タンパク質)が成功裏に産生されたことを確認しました。

野生型ECFPは、発色団成熟後に計算されたタンパク質質量が28, 283.9ダルトンであるのに対し、金蛍光タンパク質の対応する質量は28, 313.9ダルトンである。金蛍光タンパク質のデコンボリューションされたESI-MSスペクトルは、約28,314.1ダルトンのメイン質量ピークを示し、理論値から10ppm未満逸脱しています。これは、選択的圧力の取り込みによる非標準アミノ酸の取り込みを確認するものです。

ECFPの吸収スペクトルは、434ナノメートルと452ナノメートルの2つの特徴的な最大値を持っています。対照的に、金蛍光タンパク質は、最大で466ナノメートルの1つの広い赤方偏移吸収バンドによって特徴付けられます。EGFPの吸収最大化はさらに488ナノメートルに赤方偏移しますが、金蛍光タンパク質の蛍光発光スペクトルとそれに対応するGdFPのストークスシフトは、Aequorea victoria緑色蛍光タンパク質のすべての誘導体の中で最も赤方偏移していることを意味します。

ここには、単一光子計数法によってモニターされた時間分解蛍光発光が示されています。崩壊曲線は、550ナノメートルよりも600ナノメートルでわずかに速い蛍光減衰を示します。金蛍光タンパク質の蛍光発光は、多くの緑色蛍光タンパク質変異体に典型的であるように、pHに強く依存します。

ここに見られるように、スペクトル特性は一定のままですが、pHが低いと蛍光が明らかに減少します。この手法を習得すると、形質転換細菌細胞のコロニーまたは凍結グリセロールストックから開始すると、3日で完了します。この手順を試みる際には、標的アミノ酸が枯渇していることを確認することが重要です。

ncAAは、細胞に取り込まれ、生体適合性があり、選択された補助栄養株によってタンパク質に取り込まれる必要があります。この手順に従うと、エンジニアリング目的で多種多様なタンパク質を生成することができます。タンパク質安定性分析装置、酵素活性アッセイ、蛍光分光法、タンパク質結晶化などの標的タンパク質法に応じて、非標準アミノ酸が機能的および構造的特性に及ぼす影響を説明するために使用できます。

開発後、この技術は合成生物学の分野で非常に有用であることが証明され、新しい天然のタンパク質とプロテオームを提供しました。これにより、タンパク質工学の化学的能力が拡大します。このビデオを見れば、選択的圧力取り込みによる非標準アミノ酸の組換えタンパク質への組み込み方法、質量分析による人工アミノ酸の導入の検証方法、時間分解蛍光による蛍光タンパク質の分析方法について、十分に理解できるはずです。