生産およびバキュロ ウイルスの遺伝子治療応用のための浄化

このプロトコルの全体的な目標は、昆虫細胞培養でバキュロウイルスを産生し、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーで精製し、超遠心分離で濃縮することです。最終製品は、in vivo遺伝子導入またはワクチンとして使用できます。この方法は、精製および濃縮されたバキュロウイルスを遺伝子治療アプリケーションに使用したい研究者に役立ちます。

バキュロウイルス粒子には、Sf9培養物由来の細胞残骸やタンパク質が含まれている可能性があり、ヒトに使用すると炎症や免疫応答を誘発する可能性があります。毒性を避けるために、バキュロウイルスは精製され、汚染粒子から分離されます。手順の一部は、私の研究室の研究助手であるMarilou Narcisoによって実演されます。

懸濁培養をセットアップするには、昆虫培養培地中の50ミリリットルのSf9細胞を250ミリリットルのポリカーボネート三角フラスコに播種します。そして、フラスコをオービタルシェーカーインキュベーターに入れます。細胞に2ミリリットルのP2バキュロウイルスストックを加え、摂氏28度の一定温度を維持しながら135rpmで振とうします。

感染の4日後、Sf9細胞集団全体が細胞変性効果を示します。これは、高力価のバキュロウイルス産生の指標です。その後の感染ごとに細胞培養の量を10〜50倍に増やすことにより、所望の量が得られるまでバキュロウイルスを順次増幅します。最終バキュロウイルス上清を1000g、摂氏4度で30分間遠心分離し、経過した細胞残渣を分離した後、上清をきれいな容器に移し、ヌクレアーゼで50単位/ミリリットルで摂氏37度で2時間処理し、ゲノムDNAとRNAを消化します。

最後に、0.45ミクロンのろ過ユニットでウイルス上清をろ過します。インレットポート A1 の洗浄バッファーラインを、少なくとも 500 mL の洗浄バッファーが入ったボトルに入れて、クロマトグラフィーシステムをセットアップします。A2バッファーインレットポートを使用して、溶出バッファーをロードします。

フラクションコレクターに50ミリリットルの円錐管を数本挿入し、カラムパススルーバキュロウイルス上清、洗浄バッファー、および逃れたバキュロウイルスを回収します。ヘパリンカラムを 7.9 ミリリットルのカラム容量の 5 つの洗浄バッファーと、毎分 7 ミリリットルの直線流速で平衡化します。250ミリリットルのバキュロウイルス上清を、インレットサンプルポートのサンプルポンプを使用して、毎分2ミリリットルの直線流量でヘパリンカラムにロードします。

次に、10カラム容量の洗浄バッファーをヘパリンカラムに通し、毎分 2 mL の直線流速で、紫外線吸光度曲線がベースラインに戻り安定するまで分析します。5カラム容量の溶出バッファーを用いて、毎分4ミリリットルの直線流速でヘパリンカラムからバキュロウイルス粒子を溶出させます。クロマトグラムでは、バキュロウイルス粒子がヘパリンカラムから解離するときのタンパク質の急激な溶出ピークを観察します。

溶出後、逃れたバキュロウイルス上清を20ミリメートルリン酸ナトリウム緩衝液を使用して直ちに10倍に希釈し、その後の遠心分離中に浸透圧ショックによるバキュロウイルス粒子の活性化を防ぎます。濃縮手順を開始するには、同量のバキュロウイルス上清をオートクレーブから超遠心チューブに加えます。チューブの重量を天びんで測定し、滅菌PBSで超遠心チューブの内容物の重量を調整します。

各超遠心チューブをSW 32 Tiローターの対向バケットに入れ、超遠心分離機を80, 000gで摂氏4度で90分間運転します。遠心分離後、組織培養フード内の超遠心チューブを開き、バキュロウイルスペレットを除去せずに液体を無菌吸引します。0.5%BSAを含むPBSを200マイクロリットル加え、ピペッティングで激しく上下させて各ペレットを再懸濁します。

最後に、濃縮バキュロウイルスの50〜100マイクロリットルアリコートをクライオバイアルに移し、摂氏マイナス80度で保存します。バキュロウイルス力価は、HT1080細胞の感染によって推定されました。ひし形で結ばれた線は、各画分におけるバキュロウイルスの総感染単位を示しています。

バキュロウイルス粒子はヘパリンカラムに強く結合するため、カラム洗浄バッファーでは大量のウイルスは検出されません。溶出中にタンパク質の鋭いピークが観察され、これはバキュロウイルス画分に対応します。このプロトコルで使用されるパラメータは、感染性バキュロウイルス粒子の収量を最大化し、不活化を最小限に抑えます。

このプロトコルは、ヘパリンに対して親和性を有する他のウイルスおよびタンパク質の精製に使用することができます。