アクチンおよび誘導放出の枯渇 (STED) 顕微鏡を用いた B 細胞免疫シナプスにおける微小管細胞骨格の可視化

このプロトコルの全体的な目標は、B細胞免疫シナプスでアクチンおよび微小管の細胞骨格を染色して放出枯渇を誘導すること、またはSTED顕微鏡法、およびそれらの構造、空間的関係における組織をイメージングすることです。この方法は、免疫シナプス形成中のアクチンおよび微小管細胞骨格の再編成など、B細胞活性化中の細胞骨格組織に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。マルチカラーSTED顕微鏡法の主な利点は、アクチン細胞骨格、微小管ネットワーク、および主要な細胞骨格関連タンパク質をナノメートルスケールの分解能で同時にイメージングできることです。

この方法は、B細胞の活性化に関する洞察を得ることができますが、ナチュラルキラーやT細胞などの他の免疫細胞タイプの免疫シナプス形成にも適用できます。一般に、この方法に不慣れな人は、STEDを使用した同時イメージングと複数の蛍光色素の顕微鏡設定を最適化するには、ある程度の練習が必要であることに気付くでしょう。ジアとマディソンと一緒にこの手順を実演するのは、ケイト・チョイとケイトリン・プリチャードです。

まず、トランスフェクションごとにA20 Bリンパ腫細胞を10〜6分の2.5倍遠心分離し、目的の血漿DNAを1〜2.5マイクログラムを補充したトランスフェクション試薬100マイクロリットルに細胞を再懸濁します。溶液を穏やかに混合し、細胞の各アリコートを6ウェルプレートの個々のウェルに移します。各ウェルの容量を摂氏37度の完全な培地で2ミリリットルに調整し、細胞を摂氏37度のインキュベーターに18時間置きます。

翌朝、1.5 18ミリメートルの丸いガラスカバーガラスを100%メタノールに浸し、カバーガラスを約10分間完全に乾かします。乾燥させたカバースリップを12ウェル組織培養プレートの個々のウェルに置き、各カバースリップの中央に400マイクロリットルのヤギ抗マウス免疫グロブリンG抗体を加えると、中央に気泡が形成され、ウェルに滴り落ちることなく端まで広がります。カバースリップを室温で30分間インキュベートします。

次に、カバーガラスをウェルあたり1ミリリットルの滅菌PBSで3回すすぎ、結合していない抗体を取り除きます。最後の洗浄後、各カバースリップを1ミリリットルの新鮮で滅菌したPBSに細胞播種するまで保管します。トランスフェクションした細胞の準備ができたら、遠心分離により15ミリリットルの円錐管に細胞を回収し、FBSを添加した1ミリリットルの改変HEPES緩衝生理食塩水にペレットを再懸濁します。

カウント後、細胞をミリリットルあたり5番目の細胞濃度に2×10で希釈し、改変HEPES緩衝生理食塩水とFBSを添加し、鉗子を使用して各カバースリップをパラフィンフィルムに転写します。各カバーガラスに250マイクロリットルの細胞を添加し、カバーガラスを37°Cで暗所で15分間インキュベートして、細胞が抗免疫グロブリンGコーティング表面全体に広がるようにします。インキュベーションの最後に、各スライドから余分な生理食塩水を取り除き、表面全体が覆われるように注意しながら、各カバーガラスを350マイクロリットルの固定剤でコーティングします。

室温で暗所で10分間過ごした後、マイクロピペットを使用して各カバースリップの端から固定液を慎重に吸引し、500マイクロリットルの透過処理およびブロッキングバッファーでカバースリップを洗浄します。次に、250マイクロリットルの新鮮な透過処理およびブロッキングバッファーで細胞を透過処理し、暗所で室温で10分間ブロッキングします。次に、余分なバッファーを除去し、目的の一次抗体50マイクロリットルで細胞を標識し、室温の暗所で30分間

インキュベーションの終了時に、1回の洗浄につき500マイクロリットルの染色緩衝液でカバーガラスを3回洗浄し、各カバーガラスに50マイクロリットルの適切な二次抗体を室温で30分間加えます。二次抗体を洗浄した後、顕微鏡スライドに10マイクロリットルのマウント試薬を加え、カバースリップを細胞側を下にして個々の顕微鏡スライドにマウントします。次に、スライドを暗闇で一晩乾燥させて、翌日のイメージングに備えます。

STED顕微鏡で細胞をイメージングするには、まずSTED顕微鏡の電源を入れます。落射蛍光照明ランプのレーザーを作動させ、顕微鏡ソフトウェアを開きます。STED空乏レーザーのパラメータを設定し、最初のサンプルを顕微鏡にロードします。

接眼レンズを使用して、サンプルに手動で焦点を合わせ、中程度のGFP発現を持つ細胞を選択します。選択したセルを拡大し、画像化する対象領域を選択します。カバースリップに最も近いセルのXY平面にピントが合うようにフォーカスを調整します。

次に、ソフトウェアの[取得]タブで、[シーケンシャルスキャン]パネルの[フレーム間]オプションをチェックして、画像取得をシーケンシャルフレーム取得に設定します。各蛍光色素のSTEDレーザー出力を設定し、スライドバーを使用して、実験で使用した蛍光色素に合わせてレーザー出力を調整します。解像度を上げてバックグラウンド信号を減らすには、アクイジション設定を開き、ドロップダウンメニューを使用して1より大きい値を選択し、ラインやフレームの平均化を増やします。

各蛍光色素のゲインオプションとタイムゲインの特定の値を確認して、タイムゲートSTEDの適切な蛍光シグナルを取得し、STEDレーザー出力を上げて分解能を向上させます。蛍光シグナルをあまり失うことなく分解能を向上させるためには、顕微鏡サンプルと使用する蛍光色素の獲得時間を最適化することが重要です。次に、再現性を確保するために複数の画像を手動で取得し、製造元の指示に従ってデコンボリューションソフトウェアパッケージを使用して画像をデコンボリューションします。

A20 Bリンパ腫細胞の場合は、固定化NT免疫グロブリン抗体に広げます。STED顕微鏡をデコンボリューションソフトウェアと組み合わせて使用すると、共焦点顕微鏡のみの場合よりも高解像度の細胞骨格構造の画像が得られます。共焦点画像のデコンボリューションは画像の解像度の大幅な改善をもたらしますが、デコンボリューションされたSTED画像は、デコンボリューションされた共焦点画像よりも詳細な構造情報を提供します。

また、単色STEDは、B細胞細胞骨格ネットワーク全体の3次元超解像画像を取得するためにも使用できます。これらのマルチカラーSTED画像では、樹状突起アクチンの周辺リングの染色が微小管染色と併せて観察できます。蛍光融合タンパク質をトランスフェクトした細胞を使用する場合、最適な発現レベルを達成し、過剰発現によるアーティファクトを回避することが重要な考慮事項であり、蛍光融合タンパク質の発現が低すぎると、画像の品質も低下します。

また、関心領域全体を含むように、慎重に焦点を合わせることも不可欠です。例えば、この画像では、微小管ネットワークの一部のみがカバーガラスに最も近い焦点面内に存在していたため、サンプルの完全な分析が妨げられていました。一度習得すれば、このテクニックは2日で完了することができます。

サンプルの調製と染色に1日、STEDイメージングに1日。細胞のトランスフェクションに使用する血漿の量を滴定して、イメージング中に検出する蛍光タンパク質の十分な発現を得ると同時に、過剰発現によるアーティファクトを回避することを忘れないでください。この手順に続いて、異なる蛍光融合タンパク質の発現を誘導して、細胞骨格のダイナミクスと組織化を調節する他のタンパク質の局在を促進したり、他の細胞プロセスに関与するタンパク質の細胞内分布を視覚化したりできます。

このビデオを見れば、免疫シナプス形成に関与する細胞骨格構造やタンパク質のイメージングにSTED顕微鏡を使用する方法について十分に理解できるはずです。グルタルアルデヒドなどの固定剤の取り扱いは非常に危険であり、この種の試薬を使用する際には、化学ドラフトでの作業などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。