Name: がんバイオ マーカーを評価するサンプル貯蔵のための便利なツールとして血液や血清スポットを乾燥 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 学ぶ 血液や血清スポットを乾燥させて室温で2週間以上保存する方法。がんや感染症などのバイオマーカー評価に適用でき、開発国での研究にも有用です。

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我々 は編集者の支援のため Gráinne ティアニーを感謝したいです。

末梢血および血清が収集および健康なドナーと研究に参加する書面による同意を得た患者から保存します。研究プロトコルは 1964 のヘルシンキ宣言に敷設された倫理基準に従ってローカル倫理委員会で承認されました。
1 DBS 血液貯蔵
<ol><li>
血液検体の採取
	<ol>
<li>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 5.4 mg 3 mL 管末梢血サンプル 3 mL を収集します。 注: は、DBS、できるだけ早くとして、8 時間以内に末梢血を保存します。</li>
		<li>節約カードの右下隅の患者番号を記述します。</li>
		<li>5 mL ピペットで血を慎重に再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DBS のスポッティング血
	<ol>
<li>ピペットし、50-200 μ L チップ セーバー カード (材料表) に血液 (50 μ L) の 1 つのスポットを転送します。</li>
		<li>1.2.1 手順を繰り返します。3-5 血点の合計を持っています。古いチップを破棄し、分注各血の新しい 1 つを取る。</li>
		<li>直射日光を避け、開いての非吸収表面上水平位置に室温で一晩乾燥して DBS を残します。節約カードのカバーを空けて血液の乾燥を容易にします。 注: この乾燥のステップの間にほこりや空気のすべての粒子は、下流のアプリケーションには影響しません。</li>
		<li>ビニール袋に乾燥剤を使用するまで室温でカードを格納します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DNA 抽出 DNA 抽出キット データシート (乾燥血液スポットのセクション) によると DBS から始まって
<ol><li>
サンプル準備
	<ol>
<li>カードからの 3 つの乾燥血液スポットを使用します。各カードから乾燥血液スポットをカット、ピンセットでカードからそれらを区切ります。小さな断片 (直径約 1 mm) に区切られた乾燥血液スポットをカットします。</li>
		<li>1.5 mL 遠心チューブに小さな断片を配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
サンプル消化
	<ol>
<li>換散バッファー チューブ キット (材料表) で提供される 1 の 180 μ L を追加します。プロテイナーゼ K の 20 μ L を追加します。プロティナーゼ k のカードを発見血で 1.5 mL チューブに分注する前に 1 の換散バッファーを混在させないでください。ボルテックスでミックスします。</li>
		<li>Thermoincubator でチューブを置き、56 ° C, 60 分インキュベートします。Thermoincubator のシェーカー、渦、サンプルが搭載されていないかどうかは、少なくとも 10 の 10-15 分毎 s、サンプルの温度が低下しないように世話します。簡単に遠心分離機管の蓋から滴を削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
洗浄ステップ
	<ol>
<li>200 μ L の換散バッファー 2 (材料表) と 10 の渦を追加 s。</li>
		<li>Thermomixer または温水軌道インキュベーターにチューブを置き、70 の ° C で 10 分間インキュベートします。シェーカー、thermoincubator が付いていない場合渦、少なくとも 10 回のサンプル s、サンプルの温度が低下しないように世話します。</li>
		<li>2.3.1 手順を繰り返します。ライセートの 400 μ L を 1.5 mL チューブから溶出の列 (テーブルの材料) に移転します。1 分間 6,000 x g で列を遠心します。</li>
		<li>新しい 2 mL のコレクションの管に溶出列を置き、古い 1 つを破棄します。</li>
		<li>1 分間 6,000 x g で 500 μ L の洗浄バッファー 1 (材料表) と遠心分離機を追加します。</li>
		<li>新しい 2 mL のコレクションの管に列を置き、古い 1 つを破棄します。</li>
		<li>1 分間 6,000 x g で 500 μ L の洗浄バッファー 2 (材料表) と遠心分離機を追加します。</li>
		<li>新しい 2 mL のコレクションの管に列を置き、古い 1 つを破棄します。</li>
		<li>膜を乾燥する 3 分 20,000 × g で遠心分離機します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
溶出のステップ
	<ol>
<li>新しい 1.5 mL 遠心チューブに列を置き、コレクション チューブを破棄します。</li>
		<li>膜の中央に蒸留水の場所 50 μ L。室温で 10 分間インキュベートします。</li>
		<li>20,000 × gで 1 分間収集管溶出液を遠心し、膜の中央に配置し直します。</li>
		<li>1 分の 20,000 × gで遠心分離機は、膜を破棄します。</li>
		<li>分光光度計を用いた DNA 濃度を測定します。</li>
		<li>使用するまで-20 ° C で DNA の店。 メモ: DB から抽出した DNA は SNP 評価などいくつかの解析を実行するリアルタイム PCR や DNA サンガーのシーケンスで使用できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 血清用の DSS
<ol><li>
血液検体の採取
	<ol>
<li>EDTA なし 7 mL チューブで末梢血サンプル 7 mL を収集します。室温で 30 分間凝固血液サンプルを残します。</li>
		<li>節約カードの右下隅の患者番号を記述します。</li>
		<li>室温で 15 分間 980 x gで血液サンプルを遠心します。 注: は、DSS、できるだけ早くとして、8 時間以内に血清を保存します。</li>
		<li>慎重にチューブから上澄みを除去し、新しい 15 mL チューブにそれを転送します。5 mL ピペットで血を慎重に再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DSS のスポッティング血清
	<ol>
<li>ピペットし、セーバー カードに血清 (50 μ L) の 1 つのスポットを転送します。この手順では、3-5 血点の合計を持っています。 注: は、各スポットに正確に 50 μ L の血清をピペットに非常に注意します。血清はカードの破線からを超えてはなりません。</li>
		<li>室温で一晩乾燥に DSS を残します。節約カードのカバーを空けて血液の乾燥を容易にします。</li>
		<li>ビニール袋に乾燥剤を使用するまで室温でカードを格納します。ストレージが 14 日以上の場合は、-20 ° C でカードを格納します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ELISA アッセイ DSS から始まって
<ol><li>
DSS からタンパク質を溶出します。
	<ol>
<li>必要な場合は、各サンプルの DSS を解凍します。小さな断片 (直径約 1 mm) に DSS をカットします。作品を 400 μ L の PBS を 1.5 mL チューブに入れます。</li>
		<li>4 ° C で一晩サンプルを振る 注: は、低強度でそれらを振る。PBS は、加振時管のカバーを濡れていないする必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>適切な希釈後血清サンプルとして ELISA キットの指示に従って分泌タンパク質/成長因子分析のための蛋白質の溶出液を使用します。 注: この手順は、DBP 検出9に適しています。他の ELISA の試金、最適化の手順を必要ことがあります。</li>
</ol>

<ol><li>Bertagnolio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+drug+resistance+surveillance+using+dried+whole+blood+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir+Ther%22%5BJournal%5D)">HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots.</a> Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).</li>
<li>Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+filter+paper+for+the+collection+and+analysis+of+human+whole+blood+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens.</a> J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).</li>
<li>Garrido, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype+variability%2C+virological+response+and+drug+resistance+assessed+on+dried+blood+spots+collected+from+HIV+patients+on+antiretroviral+therapy+in+Angola%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemoth%22%5BJournal%5D)">Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola.</a> J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).</li>
<li>Steegen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+detecting+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+in+DNA+extracted+from+whole+blood+or+dried+blood+spots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots.</a> J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).</li>
<li>Costenaro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+load+detection+using+dried+blood+spots+in+a+cohort+of+HIV-1-infected+children+in+Uganda%3A+correlations+with+clinical+and+immunological+criteria+for+treatment+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure.</a> J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).</li>
<li>Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+glutathione+and+glutathione+disulfide+in+the+blood+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase-deficient+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns.</a> BMC Pediatr. 20 (17), 172(2017).</li>
<li>Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practice+in+the+measurement+and+interpretation+of+lysosomal+acid+lipase+in+dried+blood+spots+using+the+inhibitor+Lalistat+2%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2.</a> Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).</li>
<li>Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+25+inflammatory+markers+and+neurotrophins+in+neonatal+dried+blood+spots+by+immunoassay+with+xMAP+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology.</a> Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).</li>
<li>Amadori, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D+receptor+polymorphisms+or+serum+levels+as+key+drivers+of+breast+cancer+development%3F+The+question+of+the+vitamin+D+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway.</a> Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).</li>
<li>Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+hepatitis+B+virus+from+dried+blood+spots+by+polymerase+chain+reaction+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification.</a> J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).</li>
<li>Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+commercial+ELISA+for+the+detection+of+measles-specific+immunoglobulin+G+%28IgG%29+in+dried+blood+spots+collected+from+children+living+in+low-resource+settings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings.</a> J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).</li>
<li>Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA-based+assay+for+IP-10+detection+from+filter+paper+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples.</a> Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).</li>
<li>St Julien, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+quality+genome-wide+genotyping+from+archived+dried+blood+spots+without+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification.</a> PLoS One. 8 (5), e64710(2013).</li>
<li>Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+fentanyl+analogs+in+dried+blood+spots+by+flow-through+desorption+coupled+to+online+solid+phase+extraction+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry.</a> Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).</li>
</ol>

著者はある利益相反を開示します。

このプロトコルは、ラボ スタッフや血液サンプルの適切な処理に必要なインフラストラクチャを持たないときろ紙上血液及び血清を保存するための可能性を追究します。特に、このメソッドを使用して、全血または血清標準管または指刺すによって収集を格納できるし、採血後すぐに-20 ° C または-80 ° C でサンプルを凍結する必要はありません。DBS/DSS は、血液/血清整合性の変更なしに 14 日間室温で保持できます。ストレージの重要な問題温度以上の生物材料の特性に影響を与える水分の存在であります。この問題は、乾燥剤をプラスチック袋を使用して回避することができます。カードがビニール袋の中に水分が貯蔵の間に問題になります。一晩培養10の間に、空気/水滴/ほこりや水分の粒子によって生じた問題は認められなかった。次に、ろ紙を使用以前イタリアとアフリカのコホート11における生物学的マーカーの研究で血液及び血清を格納します。DB からの DNA 抽出を最適化を行い、両方のケース シリーズの Snp の数。我々 がタンパク質レベルの評価に興味を持っても、ELISA...

がんバイオ マーカーを研究の主な目的は、診断、予後予測、および患者が特定の治療に応答するかどうかを決定するために使用できる新しい生物学的パラメーターの id です。本研究領域は、革新的ながん治療法の発見のための基礎で合わせた治療で重要な役割を果たしています。
バイオ マーカーの同定と検証の各段階を実施は、信頼性と再現性のある必要があります。トランスレーショナル ・ リサーチの成功の礎は、血液や血清などの生体サンプルの適切なストレージです。これは、分子生物学実験や蛋白質の試金の実行するために使用できる高品質の生物材料の取得への第一歩です。
多施設共同研究が堅牢なデータを取得する十分な患者を募集する必要多くの場合です。すべての機関は-80 ° c のサンプルを格納するまたはドライアイスの他の国際センターにサンプルを送信することができます。採血用ろ紙を血液や血清を保存する簡単な方法し、サンプル1,2の即時凍結を必要としません。血液や血清のドロップは、一晩乾燥して左右の部屋の温度1,2では、14 日間保存されます紙の上に発見できます。これは研究者に他の研究室にサンプルを送信する時間を与えます。乾燥血液の使用スポット (DBS) と乾燥血清スポット (DSS) したがって先進国と発展途上国の機関間のコラボレーションを単純化します。
その使いやすさを考えると、DBS サンプリングを試金のいくつかの種類の血清学的または遺伝的下流解析の使用広く。たとえば、過去には、DBS 頻繁 HIV 発展途上国1,2,3,4、5のスクリーニングの使用されました。このストレージ メソッドのもう一つの利点は指呵責、新生児スクリーニング テスト6,7,8での使用ができ採取血液サンプルすることができます。簡単な検体の取扱い、輸送、さらにリモート サイトに収集されたサンプルのために特に DBS の利点実験装置がないです。前の文書で白人とアフリカの患者9一連のビタミン D とビタミン D 結合タンパク質 (DBP) をテストする DBS と DSS を使いました。アフリカの仲間たちは、ドライアイスを取得することができませんでした。ビタミン D 経路の 2 つの民族集団の間の違いを理解する生物学的マーカーを比較して一致したサンプルを標準的な条件の下で、フィルター紙の上を格納を使用してプロシージャをさらにアップ。DBS/DSS 手順を最適化した後 DBP と両方のコホートで患者血清中のビタミン D 分析することができました。また白人の全血およびアフリカ人9DB からの DNA の抽出後単一のヌクレオチドの多形 (SNPs) の数を調べた。この議定書は、ELISA の試金に分子生物学に至る下流解析の種類に影響を与えることがなく室温で保存する高品質な血液サンプルを許可します。通常の保管状態の施設を持っていないセンター、多施設共同研究で生体を管理するために使用をお勧めします。次のプロトコルの最適化手順の集大成を表します。

<table><tbody><tr><td>Whatman プロテインセーバーカード 903 プロテインセーバーカード、100/pk&lrm;</td><td>シグマ</td><td>Z761575</td><td>下流の分析のために室温でサンプルを保存するのに便利</td></tr><tr><td>Falcon Serological Pipettes, 5 mL</td><td>Stem cell</td><td>#38003</td><td></td></tr><tr><td>50-200 &micro;L tips</td><td>Star-Lab</td><td>S1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 遠心分離管</td><td>Eppendorf</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA microkit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>少量のDNAを分離するために設計されたDNA抽出キットです。&nbsp;</td></tr><tr><td>Buffer ATL (QIAamp DNA microkitに含まれています)</td><td>Qiagen</td><td></td> これは、テキストBuffer AL (QIAamp DNA microkitに含まれています)では<td>Lysis Buffer 1として報告</td></tr>されています<tr><td>。</td><td>Qiagen</td><td></td><td>これは、テキスト</td></tr><tr><td>QIAamp mini elute column</td><td>Qiagen</td><td></td><td>これは、テキスト</td></tr><tr><td>AW1&nbspの列として報告されています。(QIAamp DNAマイクロキットに含まれています)</td><td>Qiagen</td><td></td> これは、テキストAW2&nbsp<td>でWash Buffer 1として報告されています</td></tr><tr><td>。(QIAamp DNAマイクロキットに含まれています)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>これは、本文の</td></tr><tr><td>Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit</td> R& で Wash Buffer 2 として報告されています<td>。Dシステム</td><td>DVDBP0</td><td></td></tr></tbody></table>

がんバイオ マーカーを評価するサンプル貯蔵のための便利なツールとして血液や血清スポットを乾燥

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

血液サンプルの品質は、リアルタイム PCR や ELISA など正確な下流解析のために重要です。生物学的材料の適切な保管は、再現性と信頼性の高い結果を達成するための開始点です。すべてのサンプルは、ストレージに採血から同じ方法で扱われるべき。によって実行される解析、全血、血清使用まで-80 ° C または-20 ° C で保存される必要があります。血液/血清サンプルは、複数の凍結を避けるために検体もあります。もう一つの重要な問題は 1 つの研究所からの出荷時にサンプル条件です。ドライアイスは出荷が数日以上かかる場合、代替的なアプローチが必要です。1 つのオプションは、採血用ろ紙を使用することです。ここでの血のための手法を提案、血清サンプル コレクションを利用した乾燥血液スポット (DBS) 血清スポット (DSS) を乾燥します。リアルタイム PCR によるいくつかの単一のヌクレオチドの多形 (SNPs) の下流の評価のための DBS から DNA を抽出するプロシージャを開発しました。我々 は、DSS から溶出蛋白質から ELISA アッセイも最適化。このメソッドは、他の ELISA アッセイまたは蛋白質の評価の手順で使用できます。

我々 は生物材料の品質に影響を与えずに血液と室温で血清を保存する DBS と DSS のプロシージャの利点を取った。図 1は、蛋白質カード セーバー血液なしと採血後の例を示します。ろ紙上のストレージと血を溶出する手順をサンプルの質に干渉しないことを確認するために、標準のストレージ メソッドで比較を行った。プロトコル セクションで報告された、我々 は全血 2 mL チューブに収集または DBS、として保存される 3 一致するサンプルから DNA を抽出しました。5 つの Snp は、リアルタイム PCR によって分析されました。一致した試料について得られたデータ 100% 一致であった。
ELISA 解析に関して我々 保存血清 2 mL 管の収集の 8 サンプル (およびすぐに-80 ° C で保存) と DSS (常温 1 週間し、-20 ° C で保存されている)。我々 はプロトコル セクシ...

このプロトコルでは、末梢血および単一ヌクレオチド多型 (SNP) の評価や ELISA アッセイなどの下流解析の血清/血漿を格納する簡単で便利な方法について説明します。

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

この方法は、発展途上国の患者のバイオマーカーを研究する機会など、トランスレーショナルリサーチにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、血液や血清サンプルを凍結せずに少なくとも2週間保存でき、qPCRやELISAなどのダウンストリーム分析に高品質の材料を提供できることです。この技術の意味は、がんや感染症などの疾患の診断にまで及びます。この方法は、出生前疾患の研究やHIVなどの感染症の解析など、診断や研究分野にも適用できます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、凍結サンプルが利用できない白人とアフリカのケースシリーズ間でバイオマーカーの比較を開始したときです。この方法は、血液スポッティングの手順を学ぶのが難しいため、視覚的にデモンストレーションすることが重要です。この手順では、3ミリリットルの血液サンプルを5.4ミリグラムのEDTAを含む3ミリリットルのチューブに収集します。セーバーカードの右下隅に患者コード番号を記入します。5ミリリットルのピペットで血液を慎重に再懸濁します。次に、ピペットで1つの血液スポットをセーバーカードに移します。血液アリコートごとに新しいチップを使用して、スポッティングを繰り返して、合計3〜5個の血液スポットを取得します。乾燥した血液スポット(DBS)を室温で一晩乾燥させ、セーバーカードのカバーを開いた非吸収性の表面で水平にし、直射日光を避けます。翌日は、使用時までカードを乾燥剤入りのビニール袋に入れて室温で保管してください。DNAは、セーバーカードから3つの乾燥血液スポットから抽出されます。まず、各DBSをカードから切り取り、カードから分離します。分離したDBSを直径約1mmの小片に切ります。1つのDBSから小片を1.5ミリリットルの遠心分離管に入れます。サンプルを消化するには、市販のDNA抽出キットから180マイクロリットルの溶解バッファーをチューブに加え、次にボルテックスにより20マイクロリットルのプロテイナーゼK.Mixを加えます。チューブをサーモインキュベーターに入れ、摂氏56度で60分間振とうしながらインキュベートします。インキュベーションの終わりに、チューブを短時間遠心分離して蓋から滴を取り除きます。200マイクロリットルの溶解バッファー2を加え、10秒間ボルテックスして洗浄を開始します。チューブをサーモミキサーに入れ、摂氏70度で10分間インキュベートします。とらえどころのないカラムを新しい2ミリリットルのコレクションチューブに入れ、古いものを廃棄します。500マイクロリットルの洗浄バッファーを加え、重力6000倍で1分間遠心分離します。カラムを新しい2ミリリットルの収集チューブに入れ、古いものを廃棄します。500マイクロリットルの洗浄バッファー2を加え、重力6000倍で1分間遠心分離します。カラムを新しい2ミリリットルの収集チューブに入れ、古いものを廃棄します。20, 000倍の重力で3分間遠心分離し、膜を乾燥させます。DNAを溶出するには、カラムを新しい1.5ミリリットルの遠心分離チューブに入れ、コレクションチューブを廃棄します。50マイクロリットルの蒸留水をメンブレンの中央に置き、室温で10分間インキュベートします。チューブを重力の 20 、 000 倍で 1 分間遠心分離します。溶出物を採取し、メンブレンの中央に再度置きます。チューブを再び重力の 20 、 000 倍で 1 分間遠心分離します。メンブレンを廃棄します。分光光度計でDNA濃度を測定した後、使用するまでマイナス20°Cで保存してください。この手順では、最初に 7 ミリリットルの末梢血サンプルを EDTA なしの 7 ミリリットルのチューブに収集します。血液サンプルを室温で30分間凝固させます。セーバーカードの右下隅に患者コード番号を記入します。血液サンプルを室温で重力1100倍で15分間遠心分離します。チューブから上清を取り除き、新しい15ミリリットルのチューブに移します。5ミリリットルのピペットで血液を慎重に再懸濁します。ピペットでセラムを1スポット分貯め、セーバーカードに移します。スポッティングを繰り返して、合計3〜5つの血の斑点を作ります。乾燥したセロスポットを、セーバーカードのカバーを開けたまま室温で一晩乾燥させます。翌日は、使用時までカードを乾燥剤入りのビニール袋に入れて室温で保管してください。保管期間が14日を超える場合は、マイナス20°Cで保管してください。必要に応じて、各サンプルのDSSを解凍して、ELISAアッセイの準備をします。DSSからタンパク質を溶出するには、1つのDSSを直径約1mmの小片に切り取り、1.5ミリリットルのチューブに入れます。次に、4マイクロリットルのPBSを追加します。サンプルを摂氏4度の低速で一晩振とうします。翌日、市販のキットを使用して、分泌タンパク質または成長因子分析用の血清サンプルとして、タンパク質溶出液の適切な希釈液を使用してください。このプロトコルでは、血液と血清のサンプルを乾燥スポットとして濾紙に室温で保存しました。代表的なタンパク質節約カードは、採血の前後に示されています。濾紙での保存や血液を溶出する手順が検体の品質に支障をきたさないことを確認するため、2ミリリットルのチューブに採取した血清8検体をマイナス80°Cで保存するか、または乾燥血清スポットとして採取した血清D結合タンパク質(DBP値)のELISAアッセイを行いました。一致したサンプル間の変動係数(CV)は2%から24%の範囲であり、平均CVは9.6%でした一度習得すると、この手法は適切に実行されれば10分、15分で実行できます。この手順に従って、分子生物学またはタンパク質分析の下流法を実行することができます。この技術の開発後、トランスレーショナルリサーチやバイオマーカー解析の分野の研究は、生物学的サンプルを標準条件で保存するための実験装置を持たない世界中の研究機関と協力することを可能にします。このビデオを見れば、乾燥した血液や血清のスポットに血液サンプルを正しく保存する方法を十分に理解できるはずです。血液や化学試薬の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、手袋や白衣の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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Cancer Research

がん研究

バイオマーカーは、病気や健康の直接測定された生体指標である。人口や社会科学では、バイオマーカーは、交通機関を得ることが容易であり、分析する必要があります。乾燥した血液スポット（DBS）コレクションは、この必要性を満たし、高い応答率を持つフィールドで収集し、バイオマーカーの様々な分析することができる。...

集団研究への参加を最大化するために健康バイオマーカーの血液スポットコレクション乾燥させ

ここでは、簡単な手動タンパク質沈殿ステップとオンラインカラム抽出を使用して、乾燥血液スポット中の免疫抑制剤タクロリムスを定量するための高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(HPLC-MS/MS)アッセイについて説明します。...

LC-MS / MSを用いて乾燥血液スポット上で免疫抑制タクロリムスの定量化

準備し、彼らの最終的な分析のための乾燥血液スポット (DBS) の処理まだよくほとんどの診断アプリケーションの標準化されています。この欠点を克服するために包括的なステップバイ...

乾燥血液スポット - 準備とイムノアッセイや分子技術の使用のための処理

皮膚腫瘍は、しばしば、モース顕微鏡手術後に捨てられる。臨床支援スタッフが、臨床操作を妨害することなく、下流の実験室用途のための皮膚腫瘍（ 例えば、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、および黒色腫）試料を効果的に処理および保存することを可能にするプロトコールがここに記載される。...

クリニックベースのバイオリポジトリの設立

ここでは、患者の生体液(生体流体)に存在する循環DNAにおける腫瘍体細胞変異を検出するプロトコルを提示する。当社の液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)ベースの方法は、腫瘍変異アレーリン周波数(MAF)の定量化を可能にし、腫瘍応答の診断および時間的モニタリングに最小限に侵襲的な補体を促進する。...

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

バイオバンクは生物医学研究にとって重要なリソースであり、欧州腫瘍学研究所のトランスレーショナルおよびデジタルメディシンユニットのバイオバンクはこの分野のモデルです。ここでは、さまざまな種類のヒト生体サンプルを管理するためのバイオバンクの標準操作手順について詳しく説明します。...

トランスレーショナルメディシンのためのバイオバンク:最適なサンプル管理のための標準操作手順

リキッドバイオプシーは、腫瘍学のトランスレーショナル研究へのアプローチに革命をもたらし、サンプルの収集、品質、および保管は、臨床応用を成功させるための重要なステップです。ここでは、ほとんどのトランスレーショナルリサーチラボで適用できる、下流の循環のないDNAアプリケーションのための標準化され検証されたプロトコルについて説明します。...

下流循環フリーDNAアプリケーションのための標準化されたリキッドバイオプシー前分析プロトコル

本稿では、全血から無細胞DNAや循環腫瘍細胞などの物質を簡便かつ効率的に分離・回収するための自動化装置の適用について述べる。...

臨床検体からのがん関連物質の自動分離・回収

バイオマーカープロガストリン放出ペプチド(ProGRP)で例示された乾燥血清サンプルからの低存在量のバイオマーカーを決定するためのプロトコルが提示されます。抗体コーティングされた磁気ビーズは、プロテオタイプProGRPペプチドの選択的クリーンアップと濃縮に使用されます。捕捉されたペプチドは、続いて液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析によって分析される。...

低存在量タンパク質の標的質量分析ベースのタンパク質分析におけるマイクロサンプリング(英語)

このプロトコルは、根治的前立腺全摘除術標本からのサンプルの収集を容易にする方法を説明しています。目標は、バイオバンクに保存する前に、解剖病理学的基準に基づいて標本から組織サンプルをマッピング、特性評価、およびミクロマクロで解剖することです。...

改善されたサンプリング技術と組織学的特性評価による前立腺腫瘍バイオバンキングの信頼性の向上

このプロトコルは、ナノ粒子上のパーソナライズされたタンパク質コロナプロファイリングのためのSDS-PAGE解析を標準化し、がん特異的シグネチャーの再現可能で拡張可能かつ低コストの検出を可能にします。膵管腺癌の早期診断を目的としており、研究および臨床の両面で複雑なプロテオム手法に代わる実用的でREASSUREDに準拠した代替手段を提供します。...

早期がん検出におけるパーソナライズされたタンパク質コロナプロファイリングのための標準化されたSDS-PAGEワークフロー

学ぶ 血液や血清スポットを乾燥させて室温で2週間以上保存する方法。がんや感染症などのバイオマーカー評価に適用でき、開発国での研究にも有用です。

がんバイオマーカーを評価するサンプル貯蔵のための便利なツールとして血液や血清スポットを乾燥

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