がんバイオ マーカーを評価するサンプル貯蔵のための便利なツールとして血液や血清スポットを乾燥

この方法は、発展途上国の患者のバイオマーカーを研究する機会など、トランスレーショナルリサーチにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、血液や血清サンプルを凍結せずに少なくとも2週間保存でき、qPCRやELISAなどのダウンストリーム分析に高品質の材料を提供できることです。この技術の意味は、がんや感染症などの疾患の診断にまで及びます。

この方法は、出生前疾患の研究やHIVなどの感染症の解析など、診断や研究分野にも適用できます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、凍結サンプルが利用できない白人とアフリカのケースシリーズ間でバイオマーカーの比較を開始したときです。この方法は、血液スポッティングの手順を学ぶのが難しいため、視覚的にデモンストレーションすることが重要です。

この手順では、3ミリリットルの血液サンプルを5.4ミリグラムのEDTAを含む3ミリリットルのチューブに収集します。セーバーカードの右下隅に患者コード番号を記入します。5ミリリットルのピペットで血液を慎重に再懸濁します。

次に、ピペットで1つの血液スポットをセーバーカードに移します。血液アリコートごとに新しいチップを使用して、スポッティングを繰り返して、合計3〜5個の血液スポットを取得します。乾燥した血液スポット(DBS)を室温で一晩乾燥させ、セーバーカードのカバーを開いた非吸収性の表面で水平にし、直射日光を避けます。

翌日は、使用時までカードを乾燥剤入りのビニール袋に入れて室温で保管してください。DNAは、セーバーカードから3つの乾燥血液スポットから抽出されます。まず、各DBSをカードから切り取り、カードから分離します。

分離したDBSを直径約1mmの小片に切ります。1つのDBSから小片を1.5ミリリットルの遠心分離管に入れます。サンプルを消化するには、市販のDNA抽出キットから180マイクロリットルの溶解バッファーをチューブに加え、次にボルテックスにより20マイクロリットルのプロテイナーゼK.Mixを加えます。

チューブをサーモインキュベーターに入れ、摂氏56度で60分間振とうしながらインキュベートします。インキュベーションの終わりに、チューブを短時間遠心分離して蓋から滴を取り除きます。200マイクロリットルの溶解バッファー2を加え、10秒間ボルテックスして洗浄を開始します。

チューブをサーモミキサーに入れ、摂氏70度で10分間インキュベートします。とらえどころのないカラムを新しい2ミリリットルのコレクションチューブに入れ、古いものを廃棄します。500マイクロリットルの洗浄バッファーを加え、重力6000倍で1分間遠心分離します。

カラムを新しい2ミリリットルの収集チューブに入れ、古いものを廃棄します。500マイクロリットルの洗浄バッファー2を加え、重力6000倍で1分間遠心分離します。カラムを新しい2ミリリットルの収集チューブに入れ、古いものを廃棄します。

20, 000倍の重力で3分間遠心分離し、膜を乾燥させます。DNAを溶出するには、カラムを新しい1.5ミリリットルの遠心分離チューブに入れ、コレクションチューブを廃棄します。50マイクロリットルの蒸留水をメンブレンの中央に置き、室温で10分間インキュベートします。

チューブを重力の 20 、 000 倍で 1 分間遠心分離します。溶出物を採取し、メンブレンの中央に再度置きます。チューブを再び重力の 20 、 000 倍で 1 分間遠心分離します。

メンブレンを廃棄します。分光光度計でDNA濃度を測定した後、使用するまでマイナス20°Cで保存してください。この手順では、最初に 7 ミリリットルの末梢血サンプルを EDTA なしの 7 ミリリットルのチューブに収集します。

血液サンプルを室温で30分間凝固させます。セーバーカードの右下隅に患者コード番号を記入します。血液サンプルを室温で重力1100倍で15分間遠心分離します。

チューブから上清を取り除き、新しい15ミリリットルのチューブに移します。5ミリリットルのピペットで血液を慎重に再懸濁します。ピペットでセラムを1スポット分貯め、セーバーカードに移します。

スポッティングを繰り返して、合計3〜5つの血の斑点を作ります。乾燥したセロスポットを、セーバーカードのカバーを開けたまま室温で一晩乾燥させます。翌日は、使用時までカードを乾燥剤入りのビニール袋に入れて室温で保管してください。

保管期間が14日を超える場合は、マイナス20°Cで保管してください。必要に応じて、各サンプルのDSSを解凍して、ELISAアッセイの準備をします。DSSからタンパク質を溶出するには、1つのDSSを直径約1mmの小片に切り取り、1.5ミリリットルのチューブに入れます。

次に、4マイクロリットルのPBSを追加します。サンプルを摂氏4度の低速で一晩振とうします。翌日、市販のキットを使用して、分泌タンパク質または成長因子分析用の血清サンプルとして、タンパク質溶出液の適切な希釈液を使用してください。

このプロトコルでは、血液と血清のサンプルを乾燥スポットとして濾紙に室温で保存しました。代表的なタンパク質節約カードは、採血の前後に示されています。濾紙での保存や血液を溶出する手順が検体の品質に支障をきたさないことを確認するため、2ミリリットルのチューブに採取した血清8検体をマイナス80°Cで保存するか、または乾燥血清スポットとして採取した血清D結合タンパク質(DBP値)のELISAアッセイを行いました。

一致したサンプル間の変動係数(CV)は2%から24%の範囲であり、平均CVは9.6%でした一度習得すると、この手法は適切に実行されれば10分、15分で実行できます。この手順に従って、分子生物学またはタンパク質分析の下流法を実行することができます。この技術の開発後、トランスレーショナルリサーチやバイオマーカー解析の分野の研究は、生物学的サンプルを標準条件で保存するための実験装置を持たない世界中の研究機関と協力することを可能にします。

このビデオを見れば、乾燥した血液や血清のスポットに血液サンプルを正しく保存する方法を十分に理解できるはずです。血液や化学試薬の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、手袋や白衣の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。