潜入/トンネル用キイロショウジョウバエ幼虫における低酸素の検出

このアッセイの全体的な目標は、正常な酸素レベルにあるにもかかわらず、組織の低酸素症に苦しんでいるショウジョウバエの幼虫を特定することです。ショウジョウバエでは、幼虫の成長が遅く、貧弱で、幼虫の鈍さを引き起こす多くの突然変異があります。このアッセイは、そのクラスの幼虫の中で、組織低酸素症に苦しんでいる幼虫を特定します。

最終的に、このアッセイは、さまざまな生理学的プロセスを通じて組織に酸素欠乏を引き起こすより多くの突然変異を特定するのに役立ちます。このアッセイのアイデアは、気道や気管が損傷した幼虫が2つの奇妙な行動を示すという観察結果から生まれました。これらの異常な行動は、幼虫の初期の生涯で食物に穴を掘る失敗と、さまよう段階でより柔らかい基層にトンネルを掘ることの失敗です。

テキストプロトコルに記載されているように、卵産卵皿に対照および実験的遺伝的交配を設定します。時限卵の収集を開始する前に、少なくとも2日間はハエを暗闇に置いてください。時限的な卵の収集のために、その日の早い時間に酵母ペーストの新鮮な塗抹標本で飾られた新しいブドウ寒天プレートに成虫を移し、成虫がプレートに卵を産むのを4時間待ちます。

4時間後、成虫を新鮮なブドウ寒天プレートに移します。次に、4時間の収集プレートを摂氏25度で一晩インキュベートします。次の日の午後までに、ほとんどの幼虫が孵化します。

実験グループごとに少なくとも 50 個用意することを計画します。アッセイの 1 回の実行では、実験グループごとに少なくとも 5 つのアッセイプレートを調製します。16グラムのフライ寒天と700ミリリットルの脱イオン水を加熱して加えます。

95%エタノールで17.5ミリリットルのニパジェンを準備します。寒天溶液がほぼ完全に溶解するまで加熱します。次に、寒天溶液にニパジェン溶液を加え、寒天が完全に溶解するまで加熱します。

寒天溶液を短時間冷却してから、10センチメートルプレートに15ミリリットルの寒天溶液をロードします。寒天がゲル化したら、プレートに蓋をして、室温で数時間または一晩乾燥させます。硬化した寒天は、手触りがしっかりしていて、破片を切り出すときに崩れにくくなければなりません。

寒天が硬化したら、1.5cmのコルクボードを使用して、各プレートの寒天ゲルに中央に穴を開けます。次に、新鮮なイーストペーストで穴をきれいに埋めます。幼虫をアッセイプレートに移すには、簡単なツールを作成します。

プラスチック製のマイクロスパチュラの先端にカーブを曲げ、先端をイーストペーストに浸して幼虫に接着させます。次に、最初の幼虫を個別に拾い上げ、フードマウンドの近くの寒天皿に置きます。実験グループごとに、それぞれ10匹の幼虫が入った少なくとも5枚のプレートを準備します。

アッセイの複製間の再現性を確保するためには、各アッセイプレートに10匹の幼虫のみを配置することが重要です。アッセイプレートを注意深くチェックして、マイクロスパチュラチップで幼虫を送達するたびに1匹の幼虫のみが移送されることを確認してください。プレートをセットしたら、ラベルを貼って蓋をし、蓋をして室温で暗闇に置きます。

すべての幼虫が死ぬか蛹になるまで、毎日各プレートを調べます。以下は、アッセイの2日目から8日目までの野生型株のプレートの例です。2日目には、幼虫は餌に埋もれ、トンネルは発生しません。

トンネリングは3日目に始まり、幼虫がトンネル内でさまようのをやめて蛹になるため、5日目から8日目の間に最大に達します。曲がったからかい針で蛹をブドウ皿に慎重に移し、必要に応じて、囲む蛹の数を数えます。蛹の形成に注意し、蛹の異常を評価します。

アッセイプレート内のトンネルをイメージングするには、まず、各プレートの中央ウェルからすべての酵母食品を慎重に取り除き、廃棄します。次に、各プレートに水道水をそっと浸し、柔らかい絵筆を使用して、寒天表面に追跡された破片を慎重にこすり落とします。寒天の一部は、トンネル掘削が最も激しい場所で崩れる可能性があります。

これは後で修正できます。水を数回交換し続け、プレートが完全にきれいになるまで破片をそっと払い落とします。次に、プレートを脱イオン水で最後にすすぎ、蓋をして、室温で一晩乾燥させます。

寒天ゲルの一部が壊れたり損傷したりしないように、穏やかな水の流れと穏やかなブラシストロークを使用して寒天プレートを清掃することが重要です。翌日、トンネルを明るい白い線として示すために、黒い背景を使用してプレートのtiffファイル画像を準備します。ゲルドキュメンテーションシステムは、このステップに適しています。

次に、OvalツールでImage Jを使用して画像内のトンネリングを定量し、ペトリプレートのプラスチックエッジまで(ただし、ペトリプレートのプラスチックエッジを含まない)の寒天ゲルを定義します。次に、自動しきい値を適用してプレートの逆画像を生成し、トンネルが黒い線で表示されるようにします。トンネルが含まれていない暗い領域を修正するには、カラーピッカーツールとペイントブラシツールを使用して、それらの領域を白く塗りつぶします。

次に、[分析]プルダウン メニューで[スケールの設定]を選択し、クリックしてスケールを削除します。次に、[分析]の下の[測定の設定]ウィンドウに移動し、[面積]と[しきい値に制限]をオンにします。次に、ControlキーとMキーを押して、トンネル領域を表すピクセル単位で画像内の黒い領域を測定します。

中央の穴の周りの寒天侵食によって失われたトンネルを定量化するには、[Limit to threshold] をオフにします。ワンドツールを使用して中央の穴を定義し、ControlキーとMキーを押してその値をピクセル単位で測定します。この値から、直径 1.5 センチメートルの穴のピクセル値を減算します。

以前に取得したピクセル値に差を加算して、トンネリング ピクセルの合計値を求めます。欠落している寒天がトンネリングの中央リングを超えて広がっているプレートの場合、定量が中央領域の外側の領域を含むのを防ぐために、追加のステップが必要です。カラーピッカーツールとペイントブラシツールを使用して、図のように黒いバーを追加し、定量化される領域を制限します。

記載されたアッセイは、気管内で膨らませられない遺伝子の機能障害を持つ幼虫の潜在的な低酸素症を調査するために使用された。この遺伝子は、Gal4 UASを介してRNAiを抑制しました。Gal4ラインを2本使用しました。

気管系全体での全ての開発を通じて発現するブレスレスGal4。または、幼虫の生涯中に小さな気管切片で強く発現するcut(ue)Gal4。対照幼虫にはGal4系統の1つが含まれていましたが、膨らませないRNAiは含まれていませんでした。

cut(ue)Gal4が非膨張性RNAiを駆動する幼虫は、成長と行動の両方の点で、発生全体を通じて対照と区別がつきませんでした。しかし、blt-Gal4を用いて気管全体で非膨張性RNAiを強力に抑制した結果、摂食期に穴を掘ることができず、高い死亡率を生み出しました。これらの幼虫はまた、放浪段階でトンネルがまったくないことを示しました。

さらに、息を切らしたGal4実験幼虫は、対照群よりも小さく、薄く、動きが鈍く、他のすべてのグループが蛹になった後も長く幼虫のままでした。このビデオを見た後、ショウジョウバエの幼虫が食物の塚に潜り込む程度や柔らかい基層にトンネルを掘る程度を監視することにより、組織の低酸素症についてスキャンする方法を十分に理解しているはずです。トンネリングが全くないことは、組織の低酸素症の強力な指標です。