2018年4月10日
この資料では、生態系の植物や高度に制御された実験室で植物微生物相互作用研究を可能にするデバイス (EcoFABs) の作製のための詳しいプロトコルについて説明します。
このプロトコルの全体的な目標は、EcoFABと呼ばれる簡略化されたモデル植物生態系を構築するための標準化されたアプローチを定義することです。これにより、制御された再現された実験室実験が可能になり、植物微生物の相互作用を調査し、現場でさらにテストすることができます。この方法は、制御された環境内での植物微生物の相互作用を研究するために使用でき、マイクロバイオームの機能に関する詳細なメカニズムの洞察を得て、持続可能な農業に活用することができます。私たちは、さまざまな利用可能な3Dプリンティング技術を採用し、気を散らさない高解像度画像と化学分析の両方を可能にする植物成長チャンバーを滅菌する、この最初のEco-FABの設計を支援しました。
今回開発したEco-FAB装置は、根の形態解析と質量分析イメージングを組み込んでいるため、植物微生物の相互作用の解析に適しています。Eco-FAB金型の構築に続いて、テキストプロトコルに従って3D印刷を使用し、使い捨ての1リットルの容器に、実験に応じて40ミリリットルのシロキサンエラストマーベースと異なる量の硬化剤を混合します。容器を真空チャンバーに少なくとも30分間置き、エラストマー混合物から気泡を取り除きます。
次に、混合物を取り出し、組み立てた3Dプリントされたプラスチック型に注ぎます。均一なPDMS層を生成するためには、気泡を慎重に除去する必要があります。混合物を金型に移した後、圧縮空気を使用して空気の残留物を吹き飛ばします。
型を85°Cの加熱ブロックに4時間置きます。型を5分間冷まします。次に、インサートを金型からそっと引き出し、万能ナイフを使用してPDMSを鋳造フレームからゆっくりと分離します。
PDMSでモールドベースを鋳造フレームから押し上げます。次に、ナイフなどの工具を使って、PDMS層をモールドベースの端からやさしく分離し、モールド表面からゆっくりと剥がします。15 ゲージの鈍い針を使用して、PDMS レイヤーに 1.6 mm の穴を開けて入口チャネルを作成します。
次に、ハサミを使用してPDMSレイヤーのエッジをトリミングします。PDMS層を顕微鏡スライドに恒久的に接着するには、メタノールを使用してPDMS層の接着面を7.6 x 5 cmの顕微鏡スライドで洗い流し、圧縮空気または超高純度窒素ガンで乾燥させます。顕微鏡スライドとPDMS層をプラズマクリーナーに置き、接着面を上にして
配置します。チャンバーとガスベントバルブを閉じます。次に、バキュームをオンにし、チャンバーを1分間ポンプダウンします。プラズマ発生器の電源をオンにし、無線周波数(RFレベル)を1分間高に切り替えます。
次に、真空ポンプとプラズマ電源の両方をオフにし、チャンバーを大気に放出します。顕微鏡スライドとPDMS層をプラズマチャンバーから取り出し、PDMS層の4つの端すべてを均等な圧力でスライドにすばやく押し付けます。ルートチャンバーである中央の楕円形の領域がスライドに触れないようにしてください。
超純水を使用して、Eco-FABデバイスをすすぎます。Eco-FAB容器にEco-FABデバイスを1つ入れ、デバイスが水没するまで70%エタノールを加えます。次に、容器の蓋を閉め、静かに振って内部のすべての表面をエタノールで濡らし、Eco-FABデバイスの根成長チャンバーがエタノールで満たされ、気泡がほとんどまたはまったくないことを確認します。
室温で30分間インキュベートした後、70%エタノールを注ぎ出し、100%エタノールと交換します。その後、デバイスを5分間インキュベートします。インキュベーション後、エタノールを排出し、滅菌したEco-FABを層流フードに16時間放置して完全に乾燥させます。
可能な場合は、フード内のUVライトを1時間オンにして、システムを滅菌します。種子の滅菌と発芽を行うには、種子を70%エタノールに2分間浸します。次に、ピペットでエタノールを取り除き、滅菌水を使用して種子を3回すすぎます。
次に、種子を10%漂白剤溶液に5分間浸します。次に、漂白剤溶液を取り除き、滅菌水を使用して種子を3回完全に洗います。洗浄後、種子に滅菌水を加え、チューブを摂氏4度で7日間インキュベートします。
0.5 Murashige and Skoog、またはMS培地に0.6%ビタゲルで種子を均等に広げます。そして、微細孔テープでプレートを密封します。次に、植物を約5ミリリットルの根の長さに成長させます。
苗木をEco-FABに移すには、滅菌シリンジまたはマイクロピペットと滅菌水を使用して、Eco-FABデバイスのルートチャンバーを3回洗い流し、次にルートチャンバーに0.5 MS培地などの目的の増殖培地を充填します。次に、Eco-FABデバイスの植物リザーバーに1本の苗を慎重に挿入します。根が折れないように、苗木をプレートからEco-FABに慎重に移すことが重要です。
Eco-FABデバイスを避けて、3ミリリットルの滅菌水を容器に加えます。これにより、湿度が上昇し、ルートチャンバーからの培地の蒸発が減少します。次に、容器を閉じ、マイクロポアテープを使用してフタを密封します。
Eco-FABを植物インキュベーターに入れるか、それぞれの植物の成長に適した制御された温度環境でEco-FAB照明システムを利用します。次に、チャンバーを摂氏24度に設定します。最後に、テキストプロトコルに従って、代謝物プロファイリングと質量分析を行います。
これらの数字は、生後7日齢のAaabidopsis thaliana、brachypodium distachyon、およびpanicum virgatumがEco-FABで成長していることを示しています。双子葉植物と単子葉植物の両方が、Eco-FABで繁殖段階に匹敵することがわかりました。これらの苗木は、水耕培地で成長する生後14日間のブラキポディウムディスタキオンのグループ、およびそれぞれ水耕培地と水を補給した砂と土壌を表しています。
薄くて固体の基質層と根の成長チャンバーにより、光を透過して根系を顕微鏡でイメージングできます。ここでは、ブラキポディウム・ディスタキオンの苗をEco-FABデバイスに移し、その根の構造をバイオラッドゲルイメージャー内のカメラで記録しました。3週間にわたる総根面積の定量化は、初期段階で緩やかな増加を示し、その後、最後まで直線的な成長傾向を示しました。
この図では、植物生長促進根圏細菌(pseudomonas simiae, WCS417)を含むEco-FABを、1株あたり10〜6細胞目で植物根系に添加した。WCS147微生物は、根の先端領域の周りに微生物が集中して、根系全体の表面にコロニーを形成しました。培地をリフレッシュし、Eco-FABから根の滲出液を収集するときは、汚染を避けるためにすべての作業を滅菌フードで処理することを覚えておくことが重要です。
Eco-FABデバイスは、3Dプリントされたクランプを使用するか、PDMSの粘度を変更することにより、可逆的な物理的シールを使用して製造することもできます。これにより、固体増殖培地の使用や直接質量分析イメージングが可能になります。Eco-FAB開発後、このシステムにより、世界中の研究者がこれらの実験室モデル生態系を利用して、システムバイオロジー技術やイメージング技術を用いて植物微生物の相互作用を研究することが可能となります。
このビデオを見れば、Eco-FABシステムの作り方と、生態系研究におけるその幅広い応用について十分に理解できるはずです。このEco-FAB設計により、他の科学者が特定の科学的目標を達成できるようになることを願っています。さらに重要なことは、他の科学者がこのEco-FABの設計に基づいて構築し、それを改善し、他の科学者と共有することで、コミュニティとしてこれらの実験室のエコシステムを構築し、植物微生物の相互作用をよりよく理解できるようになることを願っています。
微生物や鋭利物を扱う作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは常に予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。
この記事では、制御された実験室環境で植物および植物-微生物相互作用の研究を容易にするEcoFABの構築のための詳細なプロトコルについて説明します。
EcoFABs provide a standardized, reproducible platform for mechanistic studies of plant-microbe interactions under controlled laboratory conditions. This enables de-risking of target validation in agricultural biotechnology by clarifying functional roles of microbiomes in plant health and stress response. The system supports predictive confidence in lead identification for microbiome-based bioinputs through dynamic monitoring of root exudates, microbial localization, and plant growth phenotypes.
EcoFABs integrate into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, supporting iterative design-test cycles for microbiome-based agricultural solutions.