植物と微生物の相互作用を調査するように設計研究所生態系の建設のため生態系製造 (EcoFAB) のプロトコル
2018年4月10日
この資料では、生態系の植物や高度に制御された実験室で植物微生物相互作用研究を可能にするデバイス (EcoFABs) の作製のための詳しいプロトコルについて説明します。
このプロトコルの全体的な目標は、EcoFABと呼ばれる簡略化されたモデル植物生態系を構築するための標準化されたアプローチを定義することです。これにより、制御された再現された実験室実験が可能になり、植物微生物の相互作用を調査し、現場でさらにテストすることができます。この方法は、制御された環境内での植物微生物の相互作用を研究するために使用でき、マイクロバイオームの機能に関する詳細なメカニズムの洞察を得て、持続可能な農業に活用することができます。私たちは、さまざまな利用可能な3Dプリンティング技術を採用し、気を散らさない高解像度画像と化学分析の両方を可能にする植物成長チャンバーを滅菌する、この最初のEco-FABの設計を支援しました。
今回開発したEco-FAB装置は、根の形態解析と質量分析イメージングを組み込んでいるため、植物微生物の相互作用の解析に適しています。Eco-FAB金型の構築に続いて、テキストプロトコルに従って3D印刷を使用し、使い捨ての1リットルの容器に、実験に応じて40ミリリットルのシロキサンエラストマーベースと異なる量の硬化剤を混合します。容器を真空チャンバーに少なくとも30分間置き、エラストマー混合物から気泡を取り除きます。
次に、混合物を取り出し、組み立てた3Dプリントされたプラスチック型に注ぎます。均一なPDMS層を生成するためには、気泡を慎重に除去する必要があります。混合物を金型に移した後、圧縮空気を使用して空気の残留物を吹き飛ばします。
型を85°Cの加熱ブロックに4時間置きます。型を5分間冷まします。次に、インサートを金型からそっと引き出し、万能ナイフを使用してPDMSを鋳造フレームからゆっくりと分離します。
PDMSでモールドベースを鋳造フレームから押し上げます。次に、ナイフなどの工具を使って、PDMS層をモールドベースの端からやさしく分離し、モールド表面からゆっくりと剥がします。15 ゲージの鈍い針を使用して、PDMS レイヤーに 1.6 mm の穴を開けて入口チャネルを作成します。
次に、ハサミを使用してPDMSレイヤーのエッジをトリミングします。PDMS層を顕微鏡スライドに恒久的に接着するには、メタノールを使用してPDMS層の接着面を7.6 x 5 cmの顕微鏡スライドで洗い流し、圧縮空気または超高純度窒素ガンで乾燥させます。顕微鏡スライドとPDMS層をプラズマクリーナーに置き、接着面を上にして
配置します。チャンバーとガスベントバルブを閉じます。次に、バキュームをオンにし、チャンバーを1分間ポンプダウンします。プラズマ発生器の電源をオンにし、無線周波数(RFレベル)を1分間高に切り替えます。
次に、真空ポンプとプラズマ電源の両方をオフにし、チャンバーを大気に放出します。顕微鏡スライドとPDMS層をプラズマチャンバーから取り出し、PDMS層の4つの端すべてを均等な圧力でスライドにすばやく押し付けます。ルートチャンバーである中央の楕円形の領域がスライドに触れないようにしてください。
超純水を使用して、Eco-FABデバイスをすすぎます。Eco-FAB容器にEco-FABデバイスを1つ入れ、デバイスが水没するまで70%エタノールを加えます。次に、容器の蓋を閉め、静かに振って内部のすべての表面をエタノールで濡らし、Eco-FABデバイスの根成長チャンバーがエタノールで満たされ、気泡がほとんどまたはまったくないことを確認します。
室温で30分間インキュベートした後、70%エタノールを注ぎ出し、100%エタノールと交換します。その後、デバイスを5分間インキュベートします。インキュベーション後、エタノールを排出し、滅菌したEco-FABを層流フードに16時間放置して完全に乾燥させます。
可能な場合は、フード内のUVライトを1時間オンにして、システムを滅菌します。種子の滅菌と発芽を行うには、種子を70%エタノールに2分間浸します。次に、ピペットでエタノールを取り除き、滅菌水を使用して種子を3回すすぎます。
次に、種子を10%漂白剤溶液に5分間浸します。次に、漂白剤溶液を取り除き、滅菌水を使用して種子を3回完全に洗います。洗浄後、種子に滅菌水を加え、チューブを摂氏4度で7日間インキュベートします。
0.5 Murashige and Skoog、またはMS培地に0.6%ビタゲルで種子を均等に広げます。そして、微細孔テープでプレートを密封します。次に、植物を約5ミリリットルの根の長さに成長させます。
苗木をEco-FABに移すには、滅菌シリンジまたはマイクロピペットと滅菌水を使用して、Eco-FABデバイスのルートチャンバーを3回洗い流し、次にルートチャンバーに0.5 MS培地などの目的の増殖培地を充填します。次に、Eco-FABデバイスの植物リザーバーに1本の苗を慎重に挿入します。根が折れないように、苗木をプレートからEco-FABに慎重に移すことが重要です。
Eco-FABデバイスを避けて、3ミリリットルの滅菌水を容器に加えます。これにより、湿度が上昇し、ルートチャンバーからの培地の蒸発が減少します。次に、容器を閉じ、マイクロポアテープを使用してフタを密封します。
Eco-FABを植物インキュベーターに入れるか、それぞれの植物の成長に適した制御された温度環境でEco-FAB照明システムを利用します。次に、チャンバーを摂氏24度に設定します。最後に、テキストプロトコルに従って、代謝物プロファイリングと質量分析を行います。
これらの数字は、生後7日齢のAaabidopsis thaliana、brachypodium distachyon、およびpanicum virgatumがEco-FABで成長していることを示しています。双子葉植物と単子葉植物の両方が、Eco-FABで繁殖段階に匹敵することがわかりました。これらの苗木は、水耕培地で成長する生後14日間のブラキポディウムディスタキオンのグループ、およびそれぞれ水耕培地と水を補給した砂と土壌を表しています。
薄くて固体の基質層と根の成長チャンバーにより、光を透過して根系を顕微鏡でイメージングできます。ここでは、ブラキポディウム・ディスタキオンの苗をEco-FABデバイスに移し、その根の構造をバイオラッドゲルイメージャー内のカメラで記録しました。3週間にわたる総根面積の定量化は、初期段階で緩やかな増加を示し、その後、最後まで直線的な成長傾向を示しました。
この図では、植物生長促進根圏細菌(pseudomonas simiae, WCS417)を含むEco-FABを、1株あたり10〜6細胞目で植物根系に添加した。WCS147微生物は、根の先端領域の周りに微生物が集中して、根系全体の表面にコロニーを形成しました。培地をリフレッシュし、Eco-FABから根の滲出液を収集するときは、汚染を避けるためにすべての作業を滅菌フードで処理することを覚えておくことが重要です。
Eco-FABデバイスは、3Dプリントされたクランプを使用するか、PDMSの粘度を変更することにより、可逆的な物理的シールを使用して製造することもできます。これにより、固体増殖培地の使用や直接質量分析イメージングが可能になります。Eco-FAB開発後、このシステムにより、世界中の研究者がこれらの実験室モデル生態系を利用して、システムバイオロジー技術やイメージング技術を用いて植物微生物の相互作用を研究することが可能となります。
このビデオを見れば、Eco-FABシステムの作り方と、生態系研究におけるその幅広い応用について十分に理解できるはずです。このEco-FAB設計により、他の科学者が特定の科学的目標を達成できるようになることを願っています。さらに重要なことは、他の科学者がこのEco-FABの設計に基づいて構築し、それを改善し、他の科学者と共有することで、コミュニティとしてこれらの実験室のエコシステムを構築し、植物微生物の相互作用をよりよく理解できるようになることを願っています。
微生物や鋭利物を扱う作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは常に予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。
概要
本記事では、制御された実験室環境において植物および植物・微生物相互作用の研究を容易にするEcoFABsの構築に関する詳細なプロトコルについて説明します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 植物・微生物相互作用
- 制御生態系の構築
- 実験室プロトコルの開発
背景
- EcoFABsは、実験室での実験用に設計された簡略化されたモデル生態系です。
- これにより、植物と微生物の相互作用に関する制御および再現可能な研究が可能になります。
- 本手法は、マイクロバイオーム機能に関するメカニズム的な知見を提供することを目的としています。
- 3Dプリンティング技術の活用により、これらのデバイスの設計が強化されています。
研究目的
- EcoFABs構築のための標準化されたアプローチを定義すること。
- 制御された環境下で植物と微生物の相互作用を調査すること。
- 得られた知見をフィールド条件下でさらに検証することを可能にすること。
使用した手法
- 3Dプリンティングを用いたEcoFABモールドの作製。
- 植物育成チャンバーの準備および滅菌。
- 種子の滅菌および発芽プロトコル。
- 分析のためのメタボライトプロファイリングおよび質量分析。
主な結果
- EcoFABsにおけるさまざまな植物種の良好な生育。
- 根の形態および相互作用の詳細な解析。
- 高解像度イメージングにおけるEcoFABの有用性の実証。
- 持続可能な農業におけるマイクロバイオームの役割に関する知見。
結論
- EcoFABsは、植物と微生物の相互作用を研究するための堅牢なプラットフォームを提供します。
- 確立されたプロトコルは、さまざまな植物種に適用可能です。
- 得られた知見は、持続可能な農業手法の進歩に寄与します。
よくある質問
産業界における重要性
EcoFABsは、制御された実験室条件下で植物と微生物の相互作用をメカニスティックに研究するための、標準化され再現可能なプラットフォームを提供します。これにより、植物の健康やストレス応答におけるマイクロバイオームの機能的役割が明確になり、農業バイオテクノロジーにおけるターゲット検証のリスクを低減することが可能になります。本システムは、根端滲出物、微生物の局在、および植物の成長表現型のダイナミックなモニタリングを通じて、マイクロバイオームベースのバイオインプットのためのリード同定における予測的信頼性をサポートします。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 変異株を含むマイクロバイオーム組成を操作することで、植物の表現型に対する因果関係を評価し、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用上の価値： Pseudomonas simiae WCS417などの植物成長促進根圏細菌を制御しながら添加し、定着パターンを定量化することで、機能的ターゲットの検証を支援する。
- 予測的価値： 微生物による介入を、根の形態、滲出物の組成、成長キネティクスなどの測定可能なアウトカムと結びつけることで、メカニズムの低リスク化を促進する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの準備： 幼苗の無菌的かつ再現性のある固定と、フロースルーデバイス内での制御された培地交換を可能にすることで、下流のワークフローに向けて検証済みの生物学的システムを準備します。
- 定量的出力： 時間経過に伴う総根面積、質量分析イメージングによる微生物の局在、および化合物スクリーニングのための滲出物プロファイリングを含む、標準化された指標を生成します。
- プラットフォームの再利用： 植物種（Arabidopsis、Brachypodium、Panicum）および成長培地（水耕、砂、土壌）にわたるスケーラビリティを考慮して設計されており、プロジェクトをまたいだ標準化をサポートします。
翻訳・前臨床研究
- 疾患・病害との関連性：持続可能な農業およびバイオエネルギー原料生産に関連する、植物・土壌・微生物の相互作用をモデル化します。
- トランスレーショナルな連続性：滅菌されたラボ環境から、補助培地を用いた定義済みの土壌・砂システムへの移行を可能にすることで、基礎研究から前臨床検証までの橋渡しを行います。
- リスク調整後の進展：フィールド試験に先立ち、制御されたストレスまたは栄養条件下で再現可能な表現型に基づいた、ゴー/ノーゴー（継続か中止か）の判断を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
EcoFABsは、初期探索段階の仮説検証からリード化合物の同定、さらには前臨床検証に至るまでの探索の連続体に組み込まれており、マイクロバイオームベースの農業ソリューションに向けた反復的な設計・試験サイクルを支援します。
- 探索生物学：植物の反応をモニタリングしながら、マイクロバイオーム組成や環境変数の操作を可能にすることで、仮説検証やパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：無菌的な作製、制御された加湿、および蒸発と汚染を最小限に抑える密閉培養システムにより、アッセイの準備状態と再現性を実現します。
- 分析：根の形態イメージング、メタボライトプロファイリング、および質量分析データを含む定量的な測定を提供し、実験条件を比較します。
- トランスレーショナルリサーチ：制御された変数を維持しつつ、より複雑な培地（砂、土壌）での検証をサポートすることで、前臨床段階への継続性を繋げます。
- エンタープライズ再利用：使い捨てのツールではなく、再利用可能なプラットフォームとして設計されており、モジュール式設計により、異なるラボや植物モデルへの適応が可能です。
運用および企業への影響
- 科学的価値：植物と微生物の相互作用におけるメカニズム的な曖昧さを排除することで、ターゲット検証における予測の信頼性を向上させます。
- 運用的価値：詳細な滅菌プロトコル、3Dプリント製モールド、および制御された環境条件により、標準化と再現性を確保します。
- 戦略的価値：圃場試験の前にマイクロバイオームベースのリード候補の早期リスク低減を可能にし、go/no-go判断と資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：微生物介入に関連した定量的かつ再現可能な表現型を通じて、リスク調整後の優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- デバイス作製には、無菌操作、3Dプリンティング、およびPDMSハンドリングの専門知識が必要です。
- 接合および解析のために、プラズマクリーナー、真空チャンバー、およびイメージングシステムへのアクセスが必要です。
- 種子の移殖、培地交換、および汚染制御に関するプロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 無菌状態を維持しつつ、液体、砂、または土壌ベースの成長培地を切り替える際の適応に関する検討が必要です。
- バイオフィルムの形成を防ぐため、根端分泌物のサンプリングおよび培地の更新時に無菌的なワークフローが必要であるという制約があります。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:04
Title
1:13
EcoFAB Device Fabrication: Casting PDMS Layers
3:22
EcoFAB Device Fabrication: Chemically Attached PDMS Layers onto Microscope Slides
4:50
EcoFAB Sterilization
5:59
Growing Plants in EcoFABs
8:31
Results: Plant-microbe Interactions Using Ecosystem Fabrication Protocols
10:18
Conclusion
