Name: 植物と微生物の相互作用を調査するように設計研究所生態系の建設のため生態系製造 (EcoFAB) のプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 学ぶEcoFABの構築プロトコルにより、植物と微生物の相互作用を制御された環境で研究できます。3Dプリンティング技術を活用し、根の形態や代謝物プロファイリングを詳細に分析する方法です。

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この仕事は契約号の下で米国エネルギー省の科学のオフィスでサポートされているローレンス ・ バークレー国立研究所の研究室監督研究と開発 (LDRD) プログラムによってサポートされて・ デ ・ AC02 05CH11231、カリフォルニア大学バークレー校に米国のエネルギー オフィス科から賞・ デ ・ SC0014079。分子鋳物工場で作業はエネルギー契約号の米国部の下でサポートされていたデ-AC02-05CH11231。我々 はまた彼らの助けのスザンヌ ・ m ・ Kosina、キャサリン ルイ、ベンジャミン ・ p. ボーウェン、ローレンス ・ バークレー国立研究所のベンジャミン ・ J ・ コールをありがちましょう。

<ol><li>Morrissey, J. P., Dow, J. M., Mark, G. L., O'Gara, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+microbes+at+the+root+of+a+solution+to+world+food+production%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Are microbes at the root of a solution to world food production.</a> EMBO Rep. 5 (10), 922-926 (2004).</li>
<li>Farrar, K., Bryant, D., Cope-Selby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+and+engineering+beneficial+plant-microbe+interactions%3A+plant+growth+promotion+in+energy+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Understanding and engineering beneficial plant-microbe interactions: plant growth promotion in energy crops.</a> Plant Biotechnol J. 12 (9), 1193-1206 (2014).</li>
<li>Singh, J. S., Abhilash, P. C., Gupta, V. K. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(16)30084-1">Agriculturally Important Microbes in Sustainable Food Production.</a> Trends Biotechnol. 34 (10), 773-775 (2016).</li>
<li>Dubey, R. K., Tripathi, V., Dubey, P. K., Singh, H. B., Abhilash, P. C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959652615019022">Exploring rhizospheric interactions for agricultural sustainability: the need of integrative research on multi-trophic interactions.</a> J Clean Prod. 115, 362-365 (2016).</li>
<li>Hunter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+microbiomes+and+sustainable+agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Plant microbiomes and sustainable agriculture.</a> EMBO Rep. 17 (12), 1696-1699 (2016).</li>
<li>van der Heijden, M. G. A., Hartmann, M. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.1002378">Networking in the Plant Microbiome.</a> PLoS Biol. 14 (2), e1002378(2016).</li>
<li>Vessey, J. K. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1026037216893">Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers.</a> Plant Soil. 255 (2), 571-586 (2003).</li>
<li>Yang, J., Kloepper, J. W., Ryu, C. -M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19056309">Rhizosphere bacteria help plants tolerate abiotic stress.</a> Trends Plant Sci. 14 (1), 1-4 (2009).</li>
<li>Reynolds, H. L., Packer, A., Bever, J. D., Clay, K. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1890/02-0298/abstract">GRASSROOTS ECOLOGY: PLANT-MICROBE-SOIL INTERACTIONS AS DRIVERS OF PLANT COMMUNITY STRUCTURE AND DYNAMICS.</a> Ecology. 84 (9), 2281-2291 (2003).</li>
<li>Finkel, O. M., Castrillo, G., Herrera Paredes, S., Salas González, I., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369526617300158">Understanding and exploiting plant beneficial microbes.</a> Curr Opin Plant Biol. 38, 155-163 (2017).</li>
<li>Northen, T. R., Zhang, Z., Gao, J., Swenson, T., Yoshikuni, Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK447357/">Advancing Our Understanding of the Chemistry of Soil Microbiomes.</a> National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. 2017. The Chemistry of Microbiomes: Proceedings of a Seminar Series. , The National Academies Press. Washington, DC. (2017).</li>
<li>Busby, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+priorities+for+harnessing+plant+microbiomes+in+sustainable+agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture.</a> PLOS Biology. 15 (3), e2001793(2017).</li>
<li>Sanati Nezhad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+platforms+for+plant+cells+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic platforms for plant cells studies.</a> Lab Chip. 14 (17), 3262-3274 (2014).</li>
<li>Oburger, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0098847212002328">Evaluation of a novel tool for sampling root exudates from soil-grown plants compared to conventional techniques.</a> Environ Exp Bot. 87, 235-247 (2013).</li>
<li>Van Der Krift, T. A. J., Berendse, F. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2435.2002.00611.x/full">Root life spans of four grass species from habitats differing in nutrient availability.</a> Funct Ecol. 16 (2), 198-203 (2002).</li>
<li>Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+root-bacteria+interactions+in+a+microfluidics+setup%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup.</a> P Natl. Acad. Sci. USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).</li>
<li>Sanati Nezhad, A., Naghavi, M., Packirisamy, M., Bhat, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cellular+penetrative+forces+using+lab-on-a-chip+technology+and+finite+element+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Quantification of cellular penetrative forces using lab-on-a-chip technology and finite element modeling.</a> P Natl. Acad. Sci. USA. 110 (20), 8093-8098 (2013).</li>
<li>Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+chip+for+high-throughput+phenotyping+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis.</a> Lab Chip. 14 (7), 1281-1293 (2014).</li>
<li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.3604788">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98 (26), 263703(2011).</li>
<li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high-throughput+live+imaging+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression.</a> Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).</li>
<li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RootChip%3A+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).</li>
<li>Aufrecht, J. A., Ryan, J. M., Hasim, S., Allison, D. P., Nebenführ, A., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+Root+Hair+Morphology+of+Arabidopsis+Seedlings+in+a+Two-layer+Microfluidic+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform.</a> J. Vis. Exp. (126), (2017).</li>
<li>Garvin, D. F., et al. <a target="_blank" href="https://dl.sciencesocieties.org/publications/cs/abstracts/48/Supplement_1/S-69">Development of Genetic and Genomic Research Resources for Brachypodium distachyon, a New Model System for Grass Crop Research.</a> Crop Sci. 48 (Supplement_1), S69-S84 (2008).</li>
<li>Lisensky, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed076p537">Replication and Compression of Surface Structures with Polydimethylsiloxane Elastomer.</a> J. Chem. Educ. 76 (4), 537(1999).</li>
<li>Friend, J., Yeo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microfluidic+devices+using+polydimethylsiloxane%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane.</a> Biomicrofluidics. 4 (2), 026502(2010).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Metabolomics+Datasets+with+High-Performance+Computing+and+Metabolite+Atlases%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Analysis of Metabolomics Datasets with High-Performance Computing and Metabolite Atlases.</a> Metabolites. 5 (3), 431-442 (2015).</li>
<li>Sumner, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+minimum+reporting+standards+for+chemical+analysis+Chemical+Analysis+Working+Group+%28CAWG%29+Metabolomics+Standards+Initiative+%28MSI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Proposed minimum reporting standards for chemical analysis Chemical Analysis Working Group (CAWG) Metabolomics Standards Initiative (MSI).</a> Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).</li>
<li>Gao, J., de Raad, M., Bowen, B. P., Zuckermann, R. N., Northen, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Black+Silicon+for+Nanostructure-Initiator+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Application of Black Silicon for Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 88 (3), 1625-1630 (2016).</li>
<li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology-Driven+Control+of+Metabolite+Selectivity+Using+Nanostructure-Initiator+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Morphology-Driven Control of Metabolite Selectivity Using Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 89 (12), 6521-6526 (2017).</li>
<li>Woo, H. -K., Northen, T. R., Yanes, O., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructure-initiator+mass+spectrometry%3A+a+protocol+for+preparing+and+applying+NIMS+surfaces+for+high-sensitivity+mass+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nanostructure-initiator mass spectrometry: a protocol for preparing and applying NIMS surfaces for high-sensitivity mass analysis.</a> Nat. Protoc. 3 (8), 1341-1349 (2008).</li>
<li>Rübel, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenMSI%3A+A+High-Performance+Web-Based+Platform+for+Mass+Spectrometry+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">OpenMSI: A High-Performance Web-Based Platform for Mass Spectrometry Imaging.</a> Anal. Chem. 85 (21), 10354-10361 (2013).</li>
<li>López-Bucio, J., Cruz-Ramı́rez, A., Herrera-Estrella, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+nutrient+availability+in+regulating+root+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of nutrient availability in regulating root architecture.</a> Curr Opin Plant Biol. 6 (3), 280-287 (2003).</li>
<li>Lynch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steep%2C+cheap+and+deep%3A+an+ideotype+to+optimize+water+and+N+acquisition+by+maize+root+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Bot%22%5BJournal%5D)">Steep, cheap and deep: an ideotype to optimize water and N acquisition by maize root systems.</a> Ann. Bot. 112 (2), 347-357 (2013).</li>
<li>Rellán-Álvarez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLO-Roots%3A+an+imaging+platform+enabling+multidimensional+characterization+of+soil-grown+root+systems%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">GLO-Roots: an imaging platform enabling multidimensional characterization of soil-grown root systems.</a> eLife. 4, e07597(2015).</li>
<li>Kamilova, F., Validov, S., Azarova, T., Mulders, I., Lugtenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+for+enhanced+competitive+plant+root+tip+colonizers+selects+for+a+new+class+of+biocontrol+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enrichment for enhanced competitive plant root tip colonizers selects for a new class of biocontrol bacteria.</a> Environ. Microbiol. 7 (11), 1809-1817 (2005).</li>
<li>Klitgaard, A., Nielsen, J. B., Frandsen, R. J. N., Andersen, M. R., Nielsen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Stable+Isotope+Labeling+and+Molecular+Networking+for+Biosynthetic+Pathway+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Combining Stable Isotope Labeling and Molecular Networking for Biosynthetic Pathway Characterization.</a> Anal. Chem. 87 (13), 6520-6526 (2015).</li>
</ol>

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プロトコルは生態系の作製を使用して作成するここで報告 EcoFABs は、高度に制御された実験室で生物学体系的な植物のコミュニティ リソースを提供します。3 D 印刷の進歩は、広くアクセス可能な技術を構築し、EcoFAB のデザインを繰り返し微調整を提供します。紹介ルート室はイメージングと不妊、植物と微生物の相互作用を調査するため微生物の制御に加えを有効に維持することに適していることがわかった。EcoFAB プラットフォームは、様々 な植物種と互換性が。追加実験は自然環境で育つ植物に調査結果を一般化する必要がありますその狭いルート チャンバ内で生育中の生理学的な効果を認識することが重要です。
LED の成長ライト、滅菌チェンバーの使用する波長、強度、期間、植物の成長と並行して関連する生理学的パラメーターなど、さまざまな光の条件の影響を検討できます。可逆的接合ルート室は、空間的生化学的および遺伝的分析のための試料を収集にも固体基板の使用を許可します。土、砂、水晶ビーズなどの固体基板上のアプリケーションより生態学的関連研究所生態系を構築する EcoFABs を使用しての可能性を提供しています。ただし、さらにほとんど土壌の正確な反射である飽和液 (水耕文化) が重要になる使用を紹介すべてのシステムは彼らをよりよく表すような土の内で空気のポケットを維持するためにこれらのデザインを絞り込む自然な土壌。
簡単なカメラや顕微鏡の使用は、携帯電話のレベルに両方のバルクでイメージ根系形態の開発に記載されます。監視の根の形態のイメージングと定量この適性は植物成長の条件に遺伝子型 adaptions によって発生する植物生理・分子シグナルの調節機構を理解するために役立つでしょう。しかし、生理学的な根の発育を研究するため制限は、EcoFAB デバイスの現在の水平方向の配置です。自然環境で根の重力反応は根系の主に垂直方向の開発に します。したがって、自然環境からいくつかの要因で異なる可能性がここに示す水平システムとルート室の垂直方向の配置による EcoFAB システムの作製は将来の EcoFAB バージョンのための望ましい目標です。現在の EcoFAB デバイスが水平に置かれているルート形態パラメーター、微生物に応答したり、さまざまな条件での分析が可能です。高分解能イメージングは、単一の菌株や植物についての部分は各種栄養十分なおよび欠乏条件下で植民地化した情報を提供するコミュニティのルート植民地化ダイナミクスをキャプチャに適用できます。このような研究がどのように工場内細菌叢解析を組み立てているし、これらのダイナ ミックスが時間とともにどのように変化に重要な新しい洞察を提供することが予想される、例えば根として開発。
マイクロ流体デバイスは、非常に若い植物のイメージングを有効にして、通常収集された代謝物の量は LCMS 分析のために十分ではありません。化学発光構造 (グロ ルート) や NMR 手法33,34どちらか植物が変換されると、rhizotrons など、土壌ベースのシステムから歯根形態のイメージングが可能します。これらのシステムからの代謝物抽出が大量のサンプルのため時間がかかるです。EcoFABs は、両方の組み合わせ: 製作、マイクロ流体デバイスに似ています。EcoFABs がシンプルで安価な再現するために設計されていますが、彼らの生殖段階まで、規模の大小の根系を持つ植物を育てるための部屋のサイズを調整できます。根の形態変化とルート滲出物の同時観測が可能です。システムは無菌、特定微生物の制御に加えを有効にすることです。
EcoFABs は、制御の導入、微生物と代謝物のサンプリングを有効にするのに設計されています。具体的には、ルート成長室から採取した試料は質量分光学的代謝物プロファイリングのための十分なことが判明します。質量分析イメージングの統合 (e.g。、NIMS テクニック) 代謝物根系の空間分布の非破壊的なアプローチを提供します。この手法は有用な将来の安定同位体トレース実験および特定の代謝物36マッピング微生物ローカリゼーションでしょう。このプロトコルは、単一の菌株に集中している、確かには同じ設計はより複雑なコミュニティのため使用できます。サンプル ボリュームと、EcoFABs 内のバイオマスは、DNA シーケンシング技術とそれ以上の統合のために十分以上、特性と微生物群集構造と遺伝子発現を監視することが重要されます可能性があります。
結論としては、このプロトコルの詳細を簡単に実装および周りの研究者によって拡張できるシンプルでアクセス方法に重点を置いて、植物と微生物の相互作用の調査のために設計された実験生態系の作製、世界。現在の取り組みは、各 EcoFAB が個別に制御光と温度などの温度制御システムの統合と研究所の再現性をデモンストレーションを目指しています。自動サンプリングの統合、EcoFABs 内にある関連工場内細菌叢解析を確立するための再現可能なプロトコルの開発、EcoFAB ルート チェンバーの補充システムのさらなる進化にあります。

農業植物有益な微生物の応用は、持続可能な食糧と成長人口1,2,3、4を提供するバイオ燃料の生産を向上させる大きな可能性を提供しています。かなりの作業量は、植物栄養摂取、ストレス、耐性と病気5,6,7,8への抵抗の工場内細菌叢解析の重要性をサポートします。しかし、それは複雑さと関連付けられている irreproducibility とマイクロバイ組成と遺伝学を正確に制御することができないのためのフィールド生態系における植物微生物相互作用のこれらのメカニズムを調査することは困難 (e.gを使用して。微生物突然変異体)4,9,10。
1 つの戦略は有効にする簡易モデル生態系を構築する制御、レプリケートされた実験フィールド10、11、さらにテストすることができます洞察力を生成する植物微生物相互作用の調査 12。この概念は、土入りのポット栽培植物を使用して従来のアプローチまたは温室やインキュベーター13内で寒天平板をビルドします。これらは、おそらくまま最も広く使用されるアプローチが、彼らは正確に監視および植物成長環境を操作する能力を欠いています。これらの端に地下プロセス14,15を勉強する能力の主要な改善を表す rhizoboxes と rhizotrons と、根圏土壌16代謝産物の分析のプロトコルは、最初が掲載されました。最近では、高スループットの解析を有効にするには、高度なマイクロ デバイス13,17工場チップ18,19、RootArray20、RootChip21などをされています。液体の流れの中で小さなモデル植物シロイヌナズナの初期成長段階を監視するマイクロ メートル スケールの空間分解能で植物を表現型解析のための効率的なツールとして開発されました。最近では、2 層のイメージング プラットフォームは、マイクロ流体プラットフォーム22幼苗期におけるシロイヌナズナ根毛イメージングを可能にする記述されていた。
ここでは、詳しいプロトコル制御研究所デバイス (EcoFABs) を構築するため、植物微生物相互作用やショーの多様な研究に使用できる植物シロイヌナズナ、コムギを含む提供distachyon23, 生態学的重要な野生エンバクエンバク barbataとバイオ エネルギー作物キビ virgatum (グラス)。EcoFAB は 2 つの主要なコンポーネントを含む無菌植物成長プラットフォーム: EcoFAB デバイスと滅菌工場サイズの透明容器。3 D 印刷プラスチック金型からレイヤーをデバイス製造プロセス鋳造 PDMS を含むポリジメチルシロキサン (PDMS) から作られています EcoFAB と24,25 報告以前メソッドを使用して顕微鏡スライド上に PDMS レイヤーを結合.EcoFAB ワークフロー、デバイス作製、殺菌、種子の発芽、苗移植、微生物接種/cocultivation、試料の調製、分析などの詳細な手順は、このプロトコル (図 1) のとおりです。基本的なワークフローのさらなる変更は、説明、コンピューターのインストールを含む可能 LED ライトを育てる、固体基板の使用率。イメージング技術の根の形態を調査するための利用、根の微生物植民地化および根分泌物の質量分光イメージングを説明しました。標準化研究所植物マイクロバイ研究紹介、詳細なプロトコルと同様に、すぐに利用できる材料に基づく単純な安価な設計コミュニティ リソースに EcoFAB プラットフォームになることと見込んでください。

<table><tbody><tr><td>3Dプリントされたカスタムモールド</td><td>LBNLSTLL</td><td></td><td>ファイルは、こちらから入手 www.eco-fab.org。ここに記載されているEcoFABsの金型は、FATHOMによって印刷されました: http://studiofathom.com</td></tr><tr><td>ダウシルガード184シリコーンエラストマークリアキット</td><td>エルスワース接着剤</td><td>184 SIL ELASTキット0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>エアダスター</td><td>スプレーVWR</td><td>75780-350</td><td>任意の圧縮ガスダスターは、</td></tr><tr><td>15ゲージの鈍い針</td><td>VWR</td><td>89166-240</td><td></td></tr><tr><td>5mLシリンジとLuer-Lokチップ</td><td>VWR</td><td>BD309646</td><td></td></tr><tr><td>3インチx2インチ顕微鏡スライドガラス</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>1.75インチ x 2.56インチ x 3.56インチ EcoFABボックス</td><td>アマゾン</td><td>B005GAQ25Q</td><td></td></tr><tr><td>4インチ x 3 &frac14;&rdquo;顕微鏡スライドガラス</td><td>テッド・ペラ</td><td>260231</td><td></td></tr><tr><td>4.87インチ x 4.87インチ x 5.50インチ EcoFABボックス</td><td>アマゾン</td><td>B00P9QVOS2</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>ハリックプラズマ</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>3Dプリント カスタムクランプ</td><td>LBNL</td><td></td><td>STLファイル トレント・ノーセンの研究室から入手可能</td></tr><tr><td>滅菌フード</td><td>エアクリーンシステム</td><td>AC600シリーズPCRワークステーション</td><td></td></tr><tr><td>PTFEシリンジ</td>チューブ <td>Sigma-Aldrich</td><td>Z117315-1EA</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td></td></tr><tr><td>漂白剤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>村重とスクーグ (MS) 主要栄養素塩基</td><td>ファイトテクノロジー研究所</td><td>M502</td><td></td></tr><tr><td>村重とスクーグ (MS) 微量栄養素塩基</td><td>植物工学研究所</td><td>M554</td><td></td></tr><tr><td>土壌</td><td>ハマート インターナショナル</td><td>プロミックス PGX</td><td></td></tr><tr><td>フィタゲル</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>71010-52-1</td><td></td></tr><tr><td>シロイヌナズナ タリアナ</td><td>レーレ 種子</td><td>WT-24 Col-4 コロンビア 野生型</td><td></td></tr><tr><td>Brachypodium distachyon</td><td>LBNL</td><td>スタンダード Bd-21 ライン</td><td>ジョン・ヴォーゲルの研究室から入手可能</td></tr><tr><td>Panicum virgatum</td><td>サミュエル・ロバーツ・ノーブル財団</td><td>Alamoスイッチグラス</td><td></td></tr><tr><td>Microporeテープ</td><td>VWR</td><td>56222-182</td><td></td></tr><tr><td>LC-MSの等級のメタノール</td><td>VWR</td><td>JT9830-3</td><td></td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td>LABCONCO</td><td>FreeZone 2.5 Plus</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVACのコンセント</td><td>レーターThermo Scientific</td><td>Savant&trade;SPD111 SpeedVac</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC GV 遠心フィルター-0.22 & マイクロ;m</td><td>ミリポア</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>液体クロモトグラフィーシステム</td><td>Agilent Agilent</td><td>1290 LC システム</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive 質量分析計</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive&trade;ハイブリッド四重極-Orbitrap MS</td><td></td></tr><tr><td>NIMSチップとカスタムMALDIプレート</td><td>LBNL</td><td></td><td>詳細なプロトコルについては、doi:10.1038/nprot.2008.110</td></tr><tr><td>MALDI質量分析計</td><td>AB Sciex</td><td>TOF/TOF 5800 MALDI MS</td><td></td></tr><tr><td>ナノコーティングLEDグローライトストリップ</td><td>LEDワールドライティング</td><td>HH-SRB60F010-2835</td><td></td></tr><tr><td>電源</td><td>LED ワールドライティング</td><td>MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J</td><td></td></tr><tr><td>TC420コントローラー</td><td>Amazon</td><td>B0197U7R8Q</td><td></td></tr><tr><td>シリコン LEDクリップ</td><td>Amazon</td><td>B00N9X1GI0</td><td></td></tr><tr><td>ホットグルーガン</td><td>Amazon</td><td>B006IY359K</td><td></td></tr><tr><td>メス - ベア LEDコネクタケーブル</td><td>LEDワールド照明</td><td>HH-F05</td><td></td></tr><tr><td>メス - オス LEDコネクタ延長ケーブル</td><td>LEDワールド照明</td><td>HH-MF1</td><td></td></tr><tr><td>20AWG 2線式ケーブル</td><td>LEDワールド照明</td><td>6102051TFT4</td><td></td></tr><tr><td>WAGO 221-415スプライシングコネクタ</td><td>LEDワールド照明</td><td>221-415</td><td></td></tr></tbody></table>

植物と微生物の相互作用を調査するように設計研究所生態系の建設のため生態系製造 (ecofab) のプロトコル

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

有益な植物・微生物相互作用は、低入食品とバイオ エネルギー生産を後押しする可能性と持続可能な生物学的ソリューションを提供しています。これらの複雑な植物と微生物の相互作用のより機械論的理解は同様に実行する基本的な生態学的研究調査植物土壌微生物相互作用として工場の生産を改善することが重要になります。ここでは、生態系作製の詳細な説明が表示されが、広く利用可能な 3 D 印刷技術を使用して、環境固有の植物・微生物相互作用の解明のため制御室生息地 (EcoFABs) を作成するには条件。EcoFABs の 2 つのサイズは、シロイヌナズナ、コムギ distachyon、キビ virgatumなど様々 な植物と微生物の相互作用の調査に適しているとおりです。これらの流れによってデバイスは、制御操作とルート内細菌叢解析、ルート化学のサンプリングし同様根の形態および微生物のローカリゼーションのイメージングします。このプロトコルには、EcoFABs 内の無菌状態を維持してマウント EcoFABs に独立した LED ライト システムの詳細が含まれています。砂の土壌を含むメディアの種類を追加するための詳細な手順、およびイメージングを使ったこれらのシステムの評価と結合した液体の成長媒体メタボロミクスは、説明。一緒に、これらのシステムは植物の植物微生物コンソーシア マイクロバイ組成 (含む変異体)、植物の生育、根の形態、滲出液組成の監視操作を含む動的かつ詳細な調査を有効にして制御環境下における微生物のローカライズ。これらの詳細なプロトコルは、理想的には植物と微生物の相互作用を調査するための標準化された実験装置の作成を支援、他の研究者の重要な出発点となることを期待しています。

各 EcoFAB システムには EcoFAB デバイスが含まれています、植物サイズの透明なプラスチック容器。1 つの EcoFAB デバイスは工場の貯水池、ルート成長室、1.6 mm 流入口および標準 EcoFAB デバイス (2 D 図・図 3 H) の 1.6 mm コンセントまたはワイド コンセント EcoFAB デバイス (図 2 階・図 3 i の 10 mm コンセント).工場貯留層は 6 mm トップを開くと 3 mm 下部開口部を持つ台形形状で設計されています、このデザイン液体注入時リークのチャンスを軽減し、植物の成長に十分なスペースができます。ルート成長室は、図 2とEに示すように多くのモデル植物の根系に合わせて深さ 2 mm の楕円形を採用しています。培養液は EcoFAB コンテナーを開くことがなくルート成長室に流れることができるので、標準 EcoFAB デバイスの入口と出口の両方のチャンネルを PTFE チューブで接続できます。ワイド コンセント EcoFAB デバイス大幅にコンセントの流れの抵抗を削減し、複雑な根系が植物から派生した後定期的に収集根分泌物や厚いルート システムと植物を育てるときはできれば使用されます。
EcoFAB デバイスの PDMS 層を製造するため、金型、設計ソフトウェアで作成され、3 D 印刷の硬質不透明なマイクロホロ グラム生産、図 2と図 3に示すように。EcoFABs 中の植物は、無菌環境 (図 8 a、補助ファイル 1) の成長を確保する長い作業距離を使用して顕微鏡で直接観測することができます。植物と EcoFAB デバイスは、(図 8 bの補足ファイル 2) 植物微生物相互作用の高分解能イメージングを可能にする高解像度顕微鏡ステージ上にも合うことができます。不妊はこの環境に保持されません、高分解能イメージングのみエンドポイント測定用に適しています。
EcoFABs は、彼らの異なる生育段階でのライフ サイクルにわたって形態、代謝、微生物などの植物の分類学的研究を有効にするのに設計されています。ここでは、さまざまな植物の種を研究する一般的なプラットフォームとして EcoFABs を調べた。図 8-Eを示し、7 日間の古いシロイヌナズナ、コムギ distachyon、キビ virgatum EcoFABs で成長しています。すべての 3 つの植物は、一ヶ月以上、EcoFAB でよく育つと見つけられました。両方、双子葉植物、シロイヌナズナ単子葉、コムギの distachyonが、EcoFABs での再生の段階に見つかりました。
シーリング システム リバーシブル固体基板の使用が可能 (e.g。、土壌) 内 EcoFABs (ステップ 2.2)。この可逆的なアプローチをシール ルート成長室へ固体基板の読み込みを有効と根の根圏の特定の地域からのサンプルのコレクションができます。図 8 階-Hは、14 日間の古いコムギ distachyonは、養液栽培培地と同様に砂と養液栽培培地 (砂) と水 (土壌) を添加した土壌での成長のグループを表示します。ルート成長室で薄い固体基質の層は、根系の顕微鏡イメージング用貫通して光をことができます。
根の形態、植物の根系の分布と空間構成として定義され、栄養や水の可用性32,33など、多様な生育環境に不可欠な生理応答として成立しています。 34。EcoFABs は、時間の経過や栄養条件下で植物の形態を勉強の便利な方法を提供します。図 9 A-Fは、最初の 3 週間でdistachyon コムギの根の形態を追跡する EcoFABs を使用しての例を示します。コムギ distachyon苗 EcoFAB デバイスに転送され、そのルート構造がバイオ ・ ラッドのゲル撮像素子内にカメラによって記録されました。画像 J、python、matlab などの画像処理プログラムは、時間の経過やさまざまなメディア環境で根の形態の変化を定量化するさらに適用できます。3 週間にわたって総根領域の定量化が初期の段階で徐々 に増加を示した (&lt; 1 週間)図 9で示すように、3 週間の終わりに線形成長傾向が続きます。
EcoFAB を構築するための主な動機は、植物と微生物の相互作用を調査することです。5.4 の手順で説明するよう、微生物は入口チャネルを介して EcoFAB デバイスのルート成長室に転送されます。図 10に示す緑膿菌 simea (以前の fluorescens) WCS417 を含む、EcoFAB (WCS417) の濃度と植物根系に植物成長促進化学発光ラベル付き苗を追加しました個体当たり 10 の6セルです。ゲルのイメージャは、ルート成長室 WCS417 微生物の異なる分布を示したで WCS417 信号が検出されました。両方 MS 液体培地で砂の固体基板の有無にかかわらず、WCS417 微生物は微生物栄養ルート ヒント (図 10 の生産のためのルートの先端領域の周りに集中するいると全体のルート システムの表面を植民地化。 
代謝産物の吸収と同様、植物根分泌物の代謝物プロファイリング研究、植物と微生物の相互作用から解放ルート成長室から滲出液ソリューションは EcoFABs で植物のさまざまな成長段階にわたって収集されました。手順 6 で説明した滲出液のサンプルはその後液体クロマトグラフィー質量分析用抽出します。このメソッドを使用すると、植物によってしみ出させるし、微生物によって消費される代謝物の範囲が検出され、根分泌物細菌の植民地化との関連代謝物プロファイリングは現在調査中。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig1.jpg"> 図 1:、EcoFAB ワークフロー 。植物は皿の上に発芽、微生物を追加ことができます滅菌 EcoFAB に転送。非破壊サンプリング: 根の形態を視覚化することができ、根分泌物をサンプリングしのイメージを作成することができます。破壊的なサンプリングは、詳細で微生物、ルート、および撮影パラメーターの解析を許可します。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig2.jpg"> 図 2: 3 D のコンポーネントは EcoFAB デバイス作製のための型を印刷します。(A) 上および傾斜鋳造フレームの表示。(B) 上部と傾斜挿入のビュー。(C) 上下標準モールド ベースのビューを傾斜します。(ワイド コンセント モールド ベースの E) 上および傾斜表示。(D, F)標準・ ワイド コンセントの EcoFAB デバイスをそれぞれ加工組み立て用金型。楕円形の寸法が小型の EcoFAB 型のため 51 mm × 34 mm と 76 mm × 62 mm 大きい EcoFAB 型のためです。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig3.jpg"> 図 3: EcoFAB デバイス作製。(A) エラストマー ベースと硬化剤の混合物を金型に注ぐ。(B) 4 h (C) 金型からカバーの取り外しのための 85 ° c の混合物と金型を加熱します。(D) 鋳造のフレームから、PDMS を分離します。(E) 金型鋳造フレームから基本を押します。(F)、PDMS をエッジに沿って金型から分離するナイフを使用しています。(G) 金型ベースから離れてゆっくりと PDMS 層を剥離。(H) 標準の PDMS 層の入口と出口の両方のチャネルの穴を突き。(I) はワイド コンセント PDMS 層の入口チャネルの穴を開けます。(J)、PDMS 膜 (15:1 エラストマーの基本剤混合物を硬化する) および顕微鏡のスライドは、洗浄し、接合用クリーナー プラズマに転送。(K) 使用は、顕微鏡のスライドに (硬化剤混合物を 5:1 エラストマー ベース製) PDMS のレイヤーを保持するクランプします。(L) 顕微鏡のスライドに直接 (エージェントの混合物を硬化に 30: 1 エラストマー ベース製) PDMS 層を押します。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig4.jpg"> 図 4: カスタム クランプのデザイン。(上の A) 上および傾斜表示はクランプ プレートです。(B) 上および傾斜表示下のクランプ プレートです。(C) 上下 4 セット hex キャップネジの組み立てられたクランプ ビューを傾斜。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig5.jpg"> 図 5: LED の取り付けはライトを育てる。(A) EcoFAB コンテナーを螺旋状に 9 LED クリップの場所をマーキング。(B) LED クリップ EcoFAB コンテナーに接続されています。(C) これらのクリップを通して LED ストリップのスレッド。(D) LED ストリップを 24 v の電源と有線コント ローラーに接続します。(E) コント ローラーに配線の回路図。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig6.jpg"> 図 6: EcoFABs に苗を転送することです。コムギ distachyon植物が 0.5 MS プレート上に 2 日間の成長した (、)。(B) ルート室植物成長培地充填。(C) ピンセットを使用して工場の貯水池にルートを慎重に挿入します。(D) 容器の底に 3 mL の水を追加した後、孔テープで EcoFAB コンテナーをシールします。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig7.jpg"> 図 7: EcoFABs にルーツを植物の NIMS イメージングします。(A)コムギ distachyon滅菌 EcoFAB で成長しています。(B) 添付 NIMS チップ 20 分 (C) による銅テープ カスタム MALDI プレート上に NIMS チップを添付するために工場と PDMS 層と MALDI 質量分析計に読み込みます。(D G) 7 日の古い 1 つ 1 つ 20 日間の古いコムギ distachyonイメージング機構用 (D, E) と (F, G) は、対応する NIMS イメージ。優勢なイオンが赤、緑、および青で強調表示されます。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig8.jpg"> 図 8: EcoFABs の一般的なアプリケーションです。(A) 直接コムギ distachyon長い作業距離顕微鏡のセットアップと EcoFAB での根の生長をキャプチャします。(B) 直接高分解能顕微鏡のセットアップをルート ・微生物相互作用を観察すること。(C E) 7 日間の古いシロイヌナズナ(C)、コムギ distachyon (D)、0.5 MS 水耕培地、砂 (G) と (h) で 0.5 MS 水耕 (F) (F ・ H) 14 日の古いコムギ distachyonでキビ virgatum (E)0.5 MS 培地と水、それぞれ付属基板。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig9.jpg"> 図 9: 根の形態を研究する EcoFABs を使用しています。(A ~ F)コムギ distachyonは、EcoFABs の成長の根の開発は最初の 3 週間の間に 0.5 MS 培地でいっぱい: (A) 2 日、(B) 4 日、(C) 7 日、(D) 11 日、(E) 14 日、成長の (F) 21 日。(ImageJ ソフトウェアは G) 平均歯根表面積を推定しました。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig10.jpg"> 図 10: 根と微生物の相互作用を研究する EcoFABs を使用しています。(A、B、C)15 日間の古いコムギ distachyonをメディア MS 液体のソリューション、砂および土の基板上のさまざまな形で緑膿菌の fluorescens WCS417 と植民地化のグループ。(D、E、F)その根系の明るいフィールド画像。(G、H、私)14 日共同栽培した後これらのルート システムの対応する化学発光イメージ。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig10large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
の補足ファイル 1。根の成長をキャプチャする EcoFAB を使用しています。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video1_capture_growing_roots_(2).mp4">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
の補足ファイル 2。ルート微生物の相互作用をキャプチャする EcoFAB を使用しています。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video2_capture_root_microbes_interaction.avi">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

この資料では、生態系の植物や高度に制御された実験室で植物微生物相互作用研究を可能にするデバイス (EcoFABs) の作製のための詳しいプロトコルについて説明します。

植物と微生物の相互作用を調査するように設計研究所生態系の建設のため生態系製造 (EcoFAB) のプロトコル

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

このプロトコルの全体的な目標は、EcoFABと呼ばれる簡略化されたモデル植物生態系を構築するための標準化されたアプローチを定義することです。これにより、制御された再現された実験室実験が可能になり、植物微生物の相互作用を調査し、現場でさらにテストすることができます。この方法は、制御された環境内での植物微生物の相互作用を研究するために使用でき、マイクロバイオームの機能に関する詳細なメカニズムの洞察を得て、持続可能な農業に活用することができます。私たちは、さまざまな利用可能な3Dプリンティング技術を採用し、気を散らさない高解像度画像と化学分析の両方を可能にする植物成長チャンバーを滅菌する、この最初のEco-FABの設計を支援しました。今回開発したEco-FAB装置は、根の形態解析と質量分析イメージングを組み込んでいるため、植物微生物の相互作用の解析に適しています。Eco-FAB金型の構築に続いて、テキストプロトコルに従って3D印刷を使用し、使い捨ての1リットルの容器に、実験に応じて40ミリリットルのシロキサンエラストマーベースと異なる量の硬化剤を混合します。容器を真空チャンバーに少なくとも30分間置き、エラストマー混合物から気泡を取り除きます。次に、混合物を取り出し、組み立てた3Dプリントされたプラスチック型に注ぎます。均一なPDMS層を生成するためには、気泡を慎重に除去する必要があります。混合物を金型に移した後、圧縮空気を使用して空気の残留物を吹き飛ばします。型を85°Cの加熱ブロックに4時間置きます。型を5分間冷まします。次に、インサートを金型からそっと引き出し、万能ナイフを使用してPDMSを鋳造フレームからゆっくりと分離します。PDMSでモールドベースを鋳造フレームから押し上げます。次に、ナイフなどの工具を使って、PDMS層をモールドベースの端からやさしく分離し、モールド表面からゆっくりと剥がします。15 ゲージの鈍い針を使用して、PDMS レイヤーに 1.6 mm の穴を開けて入口チャネルを作成します。次に、ハサミを使用してPDMSレイヤーのエッジをトリミングします。PDMS層を顕微鏡スライドに恒久的に接着するには、メタノールを使用してPDMS層の接着面を7.6 x 5 cmの顕微鏡スライドで洗い流し、圧縮空気または超高純度窒素ガンで乾燥させます。顕微鏡スライドとPDMS層をプラズマクリーナーに置き、接着面を上にして配置します。チャンバーとガスベントバルブを閉じます。次に、バキュームをオンにし、チャンバーを1分間ポンプダウンします。プラズマ発生器の電源をオンにし、無線周波数(RFレベル)を1分間高に切り替えます。次に、真空ポンプとプラズマ電源の両方をオフにし、チャンバーを大気に放出します。顕微鏡スライドとPDMS層をプラズマチャンバーから取り出し、PDMS層の4つの端すべてを均等な圧力でスライドにすばやく押し付けます。ルートチャンバーである中央の楕円形の領域がスライドに触れないようにしてください。超純水を使用して、Eco-FABデバイスをすすぎます。Eco-FAB容器にEco-FABデバイスを1つ入れ、デバイスが水没するまで70%エタノールを加えます。次に、容器の蓋を閉め、静かに振って内部のすべての表面をエタノールで濡らし、Eco-FABデバイスの根成長チャンバーがエタノールで満たされ、気泡がほとんどまたはまったくないことを確認します。室温で30分間インキュベートした後、70%エタノールを注ぎ出し、100%エタノールと交換します。その後、デバイスを5分間インキュベートします。インキュベーション後、エタノールを排出し、滅菌したEco-FABを層流フードに16時間放置して完全に乾燥させます。可能な場合は、フード内のUVライトを1時間オンにして、システムを滅菌します。種子の滅菌と発芽を行うには、種子を70%エタノールに2分間浸します。次に、ピペットでエタノールを取り除き、滅菌水を使用して種子を3回すすぎます。次に、種子を10%漂白剤溶液に5分間浸します。次に、漂白剤溶液を取り除き、滅菌水を使用して種子を3回完全に洗います。洗浄後、種子に滅菌水を加え、チューブを摂氏4度で7日間インキュベートします。0.5 Murashige and Skoog、またはMS培地に0.6%ビタゲルで種子を均等に広げます。そして、微細孔テープでプレートを密封します。次に、植物を約5ミリリットルの根の長さに成長させます。苗木をEco-FABに移すには、滅菌シリンジまたはマイクロピペットと滅菌水を使用して、Eco-FABデバイスのルートチャンバーを3回洗い流し、次にルートチャンバーに0.5 MS培地などの目的の増殖培地を充填します。次に、Eco-FABデバイスの植物リザーバーに1本の苗を慎重に挿入します。根が折れないように、苗木をプレートからEco-FABに慎重に移すことが重要です。Eco-FABデバイスを避けて、3ミリリットルの滅菌水を容器に加えます。これにより、湿度が上昇し、ルートチャンバーからの培地の蒸発が減少します。次に、容器を閉じ、マイクロポアテープを使用してフタを密封します。Eco-FABを植物インキュベーターに入れるか、それぞれの植物の成長に適した制御された温度環境でEco-FAB照明システムを利用します。次に、チャンバーを摂氏24度に設定します。最後に、テキストプロトコルに従って、代謝物プロファイリングと質量分析を行います。これらの数字は、生後7日齢のAaabidopsis thaliana、brachypodium distachyon、およびpanicum virgatumがEco-FABで成長していることを示しています。双子葉植物と単子葉植物の両方が、Eco-FABで繁殖段階に匹敵することがわかりました。これらの苗木は、水耕培地で成長する生後14日間のブラキポディウムディスタキオンのグループ、およびそれぞれ水耕培地と水を補給した砂と土壌を表しています。薄くて固体の基質層と根の成長チャンバーにより、光を透過して根系を顕微鏡でイメージングできます。ここでは、ブラキポディウム・ディスタキオンの苗をEco-FABデバイスに移し、その根の構造をバイオラッドゲルイメージャー内のカメラで記録しました。3週間にわたる総根面積の定量化は、初期段階で緩やかな増加を示し、その後、最後まで直線的な成長傾向を示しました。この図では、植物生長促進根圏細菌(pseudomonas simiae, WCS417)を含むEco-FABを、1株あたり10〜6細胞目で植物根系に添加した。WCS147微生物は、根の先端領域の周りに微生物が集中して、根系全体の表面にコロニーを形成しました。培地をリフレッシュし、Eco-FABから根の滲出液を収集するときは、汚染を避けるためにすべての作業を滅菌フードで処理することを覚えておくことが重要です。Eco-FABデバイスは、3Dプリントされたクランプを使用するか、PDMSの粘度を変更することにより、可逆的な物理的シールを使用して製造することもできます。これにより、固体増殖培地の使用や直接質量分析イメージングが可能になります。Eco-FAB開発後、このシステムにより、世界中の研究者がこれらの実験室モデル生態系を利用して、システムバイオロジー技術やイメージング技術を用いて植物微生物の相互作用を研究することが可能となります。このビデオを見れば、Eco-FABシステムの作り方と、生態系研究におけるその幅広い応用について十分に理解できるはずです。このEco-FAB設計により、他の科学者が特定の科学的目標を達成できるようになることを願っています。さらに重要なことは、他の科学者がこのEco-FABの設計に基づいて構築し、それを改善し、他の科学者と共有することで、コミュニティとしてこれらの実験室のエコシステムを構築し、植物微生物の相互作用をよりよく理解できるようになることを願っています。微生物や鋭利物を扱う作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは常に予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

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マイクロ流体デバイスは、リアルタイムでかつ適切な物理的なスケールで複雑な自然のプロセスを可視化するために使用することができます。我々は地下で細菌の増殖と輸送を研究するための自​​然な多孔質媒体の主要な機能を模倣する簡単なマイクロ流体デバイスを開発しました。...

多孔質媒体中の微生物トランスポート研究のためのシンプルなマイクロ流体システム：マイクロワールドでのウィンドウ

出典: Nathoo、N.、 et al.植物/微生物の分子相互作用とシグナル伝達の同時かつ体系的な解析のための水耕共栽培システム J. Vis. 経験。 (2017)。このビデオは、無菌条件下での植物と細菌の相互作用を研究するための水耕栽培共栽培システムを示しています。植物の苗木は、...

植物宿主と相互作用する細菌の分子応答を研究するための共培養システム

微生物群集の発達は、環境構造、メンバーの豊富さ、形質および相互作用を含む複数の要因の組み合わせに依存する。このプロトコルは、ニッチサイズや閉じ込めなどの重要な要素を近似できるフェムトリットルウェルに含まれる数千のコミュニティを同時に追跡するための合成の微細加工環境を記述しています。...

マイクロウェルアレイプラットフォーム内での微生物コミュニティ開発の組み立てと追跡

記載された水耕共培養システムは、金属メッシュスクリーンを有する完全な植物を支持し、それらを細菌と共培養する。植物組織、細菌、および分泌された分子は、下流の分析のために別々に採取することができ、同時に植物宿主および相互作用する微生物または微生物の両方の分子応答を調べることができる。...

植物/微生物の分子相互作用およびシグナル伝達の同時および系統的分析のための水耕栽培共生システム

この資料は、物理と化学の高スループット操作キューが模倣した生体内で細胞微小と多重化人工細胞微小環境 (MACME) 配列を準備する詳細な方法についてを説明します単一セルのプロファイリングとひと多能性幹細胞 (hPSCs)...

多重の人工細胞の微小環境配列の作製

土壌の不透明度のために、その構成微生物間の相互作用は、細胞分解能で容易に視覚化することができない。ここでは、真菌と微生物の相互作用を調査するための新しい機会を提供する2つのマイクロ流体ツールを紹介します。これらのデバイスは汎用性と使いやすさを備えており、細胞レベルでの高時空間制御と高解像度イメージングを可能にします。...

細胞レベルで真菌 - 微生物相互作用をプロービングするためのマイクロ流体ツール

ここでは、さまざまな根圏土壌から相乗的な多種バイオフィルムコミュニティを確立するための迅速かつ標準化された手順を紹介します。これは、複雑な根圏土壌微生物叢を調査し、シミュレートするために設計された独自のプロトコルです。...

根圏土壌からの多種バイオフィルム群集構築へのアプローチ

JenaTron - 草原の生態系機能に対する植物の歴史と土壌の歴史の影響を研究するための実験的アプローチ

このプロトコルは、嫌気性条件下での複雑な糞便群集の連続フロー培養に利用されるミニバイオリアクターアレイの組み立てを詳述しています。また、さらなる分析のために、反応器の組み立て、接種、およびサンプリングの方法についても説明します。...

複雑な糞便群集の連続培養のためのバイオリアクターアセンブリ

ミニバイオリアクターアレイ(MBRA)は、複雑な微生物群集の培養を可能にするハイスループットでカスタマイズ可能な連続フロー培養システムであり、マイクロバイオームのダイナミクス、治療的相互作用、および環境要因に対する微生物の反応を研究するための並行実験をサポートします。...

ミニバイオリアクターアレイ(MBRA)の組み立てと使用のためのプロトコルの更新

学ぶEcoFABの構築プロトコルにより、植物と微生物の相互作用を制御された環境で研究できます。3Dプリンティング技術を活用し、根の形態や代謝物プロファイリングを詳細に分析する方法です。

植物と微生物の相互作用を調査するように設計研究所生態系の建設のため生態系製造 (EcoFAB) のプロトコル

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