Name: 共有結合 DNA 付加体生成活性酵素によって発ガン性物質の in Vitro薬物と32p-ポストラベルで決意 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学ぶ シトクロムP450などの生体変換酵素を用いて環境化学物質や医薬品のDNA付加体形成能を評価する方法。がん発生の初期過程を解明し、より安全な薬剤開発に貢献する重要な技術です。

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本研究は、チェコ科学財団 (GACR、グラント 17 12816S) によって支えられました。

著者は、何を開示します。

この論文では付加体の共有結合 DNA の生成で生じる代謝の中間体に bioactivated をする化学物質の効能を研究する広くアクセス可能な方法論を示した。これは重要な問題です、付加体の環境化学物質の効力または共有結合 DNA を生成する代謝産物への酵素的活性化の薬の評価ために、がんとその治療法の開発に重要なフィールドは。腫瘍の開発の原因と考えられる発ガン性物質による DNA の変更は今発ガン性物質による発がんのセントラル ドグマとして判断されます。この提案は様々 な現象などの所見によって確認される: 様々 な発ガン性物質の発ガン性 (i) プロパティ反応求核 DNA センター代謝物にこれらの化合物の生理活性に依存(ii) DNA のレベルは頻繁に付加体多くの発癌性反応に対応(iii) およびある特定の腫瘍のサプレッサー遺伝子のプロトオンコジーンのいくつかの活性化突然変異は、発がん性のポーテンシーと化学物質とその修正によって引き起こされるかもしれない。さらに、抗がん剤によって DNA の共有結合修飾は、最も効率的な DNA 損傷の影響これらの薬がん治療での使用結果の 1 つとして実証されています。
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(環境化学物質や薬物) は化学物質の代謝は 2 つのフェーズ1で発生します。フェーズ I と II はもともと疎水性 (水溶性) 化合物をより親水性にレンダリングする目的 (水溶性)、汗や尿、糞便を介して容易に excretable のため。フェーズ I (化) 反応は、酸化、還元、およびペルオキシダーゼ (p450、アセチルトランスフェラーゼ)、シトクロム p450 などの酵素によって触媒される水酸化反応 (すなわち、シクロオキシゲナーゼ、コックス)、アルド-ケト還元酵素 (AKRs)、および肝ミクロゾーム。フラビン含有モノオキシゲナーゼ (FMOs)。様々 な還元すなわち、ミクロソーム NADPH: チトクローム P450 還元酵素 (POR) と細胞内 NAD (P) h: キノン酸化還元酵素 (NQO1)、キサンチン酸化酵素 (XO)、アルデヒド酸化酵素 (AO)1による還元反応の内容はまた相.2 番目のフェーズ (活用) 段階に付けられた官能基は極性をさらに高める小さい極性分子の共役にされます。フェーズ II は、硫酸転移酵素 (結果)、 N、O- コリンアセチルトランスフェラーゼ (Nat)、メチル基転移酵素カテコール -O-メチルトランスフェラーゼ (COMT) グルタチオンS- などの反応で参加と酵素の例トランスフェラーゼ (観光科学研究)、ウリジン二リン酸不明瞭 (UGTs)1。段階で酵素の分類 I または II は、しかし、堅くないし、いくつかの酵素は、どちらのカテゴリに恐らく間違いなくグループ化できます。
P450 酵素 (EC 1.14.14.1)、ヘム蛋白質の変換3,4を触媒多くの化学物質の生体内変換に参加する様々 な生物の存在を含んでいます。P450 酵素触媒反応を 1 つの酸素原子を分子薬物動態、導入する中の酸素 2 原子が 2 つの電子 [式 (1 を必要とする反応によってフォーム水に還元される場所の多くの基質のヒドロキシル化)]3,4:
RH + O2 + NADPH + H+ → 盧 + H2O + NADP+ (1)
P450 酵素 (ミクロゾーム P450 系) 哺乳類細胞の小胞体膜に局在 NADPH: チトクローム P450 還元酵素 (POR) とチトクロムb5がさらに含まれている酵素のモノオキシゲナーゼ系のメンバーであります。、NADH: チトクロームb5還元酵素と呼ばれる酵素の基板。一般に認められた理論の仮説、P450 に必要な 2 つの電子のドナーは、NADPH/POR システム。それにもかかわらず、チトクロームb5可能性がありますとしても電子のドナー チトクローム P450 のすなわち 2 還元の反応サイクルの P450 を削減電子のドナーとして NADH: チトクロームb5と共に機能する場所還元酵素の2,の3,4。
哺乳類利用各種 P450 酵素 (例えば家族 5、8、11、17、19、21、24、26、および 27 の酵素) ステロイド類などの貴重な内因性化合物の合成のため天然物2,3の異化作用のために使用し、.他の CYP の哺乳類酵素などヒト CYP1A2、2 9、2 19 2 6 と 3A4、代謝薬として使用される外因性の化学物質。5,6薬の代謝を触媒する最も重要な酵素は、特に CYP3A4 3A 亜科の広いです。プロ発ガン性物質などプロ-毒性、薬物動態の変換は、ヒト CYP1A1、1 a 2、1B1、2A6、2E1、3A42,5によって仲介されます。これらのアセチルトランスフェラーゼのほとんどは (CYP1A1 1B1 除く) 肝臓に存在です。それにもかかわらず、広いはいくつかの肝外臓器にも表されます。このような p450 意義は大きい、主にあるかもしれないときこれら臓器7の反応中間体を化学物質 (薬物) の生理活性代謝に彼らを参加します。各種 p450 は、これは必ずしもそうではありませんが、基板は、いくつかの化合物によって引き起こされます。
多くの P450 酵素は、毒性化学物質 (薬物) の役割を果たします。彼らは彼らの解毒代謝だけでなく、物質に変換することができますがもさらに通常彼らの毒性を引き起こす別の生物学的特性を示す内在性の高分子を変更反応性の種にそれらを有効に。DNA、脂質、タンパク質は、反応性の求電子剤と活性化学物質から生成されたラジカル調節の目標かもしれない。DNA の場合いくつかの重要な遺伝子応答とそのメカニズムを解決されている2,3,4,5。
DNA の変化は細胞成長の制御の減少につながるし、この現象が支配的な要因の発がんプロセスの開発につながると見なされます。共有結合 DNA の生成付加体の化学物質の発ガン性の初期段階で最も重要な手順の 1 つを処理する8,9,10,11発がん性を持つと判断します。それを示した付加体の DNA の形成との関係、腫瘍の発生、付加体の DNA の量の減少に対し、化学予防8,9,10,11,12,13,14. 発癌物質/薬物由来の形成 DNA 付加体の DNA の塩基に依存して DNA のこれらの塩基の配列によって影響されます。付加体の DNA の修理の場所 (上転写または非転写される DNA 鎖) と修正されたヌクレオチド シーケンス8,11,12,15の型に依存しています。 16。
この資料で述べる変更 DNA 代謝産物にアクティブにする彼らの力を調査するため化学物質 (薬物) の酵素触媒変換を利用した (生成する DNA 付加体)。DNA 結合テスト混合物をする必要があります通常個々 の薬物に応じて、酸化、または還元反応によってアクティブになります。テスト対象化学物質の酸化や還元活性化ミクロソームの細胞分画に存在する P450 依存性酵素システムを介したまたは還元還元ミクロソーム (POR、NADH: チトクロームb5の両方に存在還元酵素、P450 酵素)、細胞質細胞内分 (NQO1、XO、アオ、ペルオキシダーゼ)。反応性代謝物その後バインド DNA 付加体の DNA を形成します。酸化及び還元反応はこれらの反応種にいくつかの薬をアクティブにすることが重要なので酸化/還元酵素システムを用いた実験の手順を示します。さらに、検出し、これらの DNA を定量化できる適切なメソッドが付加体で詳しく説明します。
酵素システムによってテスト化学がアクティブかどうかを決定する 2 つの独立した手順は DNA 行きをお勧めします: 32p-ポストラベル法と利用した放射性標識化合物 (e.g、 3H または14。C)。最初はパイロット、 32p-ポストラベル試験をスクリーニングをお勧めします。ソリューションでは、正確に評価される、DNA 量の定量は、両方の方法を付ける必要があります。
32p-ポストラベル法による非放射性化学物質 (発がん性物質・医薬品) 3´-phosphodeoxynucleosides、5´-放射性リン (32P) と追加のリン酸化修飾核酸の酵素加水分解を利用してください。ああ位置、および化学 deoxynucleotide の分離通常の (非修飾) 弱まりからによる付加クロマトグラフィー17 (図 1)。ミクロコッカスヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼとして知られている混合物で化合物の化学修飾 DNA を加水分解します。(未変更の状態) 両方の法線を含む、変更デオキシリボヌクレオシド 3´ monophosphates [γ-32P] フォーム 5´ pH 9.5 でキャリア (非放射性) ATP と T4 ポリヌクレオチド キナーゼの存在下で ATP と反応し、加水分解 DNA の混合物32P ラベル 3´、5´ bisphosphates (図 1の「標準」プロシージャ)。使用されるアルカリ pH は T4 ポリヌクレオチドの位置 3´ でデオキシリボヌクレオシド 3´ monophosphates dephosphorylate キナーゼの酵素活性を最小限に抑えることが可能です。分離と32の解像度から付加体 P ラベルの化学薬品によって変更されていないラベルの弱まりはポリエチレンイミン (PEI) セルロース (図 2 多陰イオン交換薄層クロマトグラフィー (TLC) によって遂行).最初と 2 番目の溶出の手順 (D1 および D2 方向) で、短い部分に電解質の水溶液を用いた TLC PEI セルロース板の最初からラベル付き通常 (非修飾) 弱まりとして [32P] リン酸を溶出します。ガスクロマト グラフ用紙 (発がん性物質/薬物-アダクト) 疎水性特性を示すバインドされた化学物質を含む弱まりはさらに解決すべき PEI セルロース プレートのスタートで維持されるに対し、TLC プレート上に適用されます。D3 と D4 の方向 (図 2) でいくつか異なる溶媒システム。付加体の局在強化画面オートラジオグラフィー; を使用して実行されます付加体の分離された x 線フィルムの認識可能な黒ずみとして検出されます。スポットのエリアはプレートから摘出した、液体シンチレーションまたはカウント チェレンコフによって放射能を定量化する使用されます。クロマト グラム検出された付加体のイメージング法のマップし、DNA の定量化に適応されているストレージりん32p-ポストラベル試験が今も使用されます。18インスタント イメージャ マシンは頻繁にそのような検出のため、付加体の DNA の定量化。このメソッドでは、画面の技術強化オートラジオグラフィー19よりも32P を検出するための 10 倍以上の感度を提供します。
量の DNA 付加体の付加物の相対値分類 (RAL) の方程式 (2) を使用して次のように計算、定め。
インプレッション。弱まりを付加します。 RAL =---(2) 32P ATP の特定活動 (cpm で/pmol) x pmol 弱まり
RALs の値が内転の弱まりのカウント レートの比 [内転と通常 (非修飾) 弱まり] の合計カウント率弱まり20,21。ただし、この計算は平等に基づいて付加体の効率のラベリングと通常弱まり22。32p-ポストラベル法の古典的な (「標準」) プロシージャは適切様々 な DNA 付加体 (および/または非かさばるかさばる付加) しかし、その感度は満足のいく付加体の dna の少量を検出しますします。この手順を使用して、DNA (0.3 fmol 付加/μ g DNA) の 10 の7そのまま弱まりで抱合体の生成量は検出します。
この古典的な32p-ポストラベルのプロシージャの変更の様々 な技術の感度を高めるため利用されています。32で付加体の定量の 10-100 倍高感度まで P ラベルは [γ-32P] ATP (強化のプロシージャ) の制限レベルを使用して達成されています。23,24 32p-ポストラベル法の感度の増加を利用して DNA を含む消化の潜伏を提供するそれ以上のプロシージャ付加ヌクレアーゼ P1 (活性) から21 (図 1)。この酵素は、バインドされた化学物質 (内転のヌクレオチド) と弱まり、本質的にないこの酵素の基板に対し未修正デオキシリボヌクレオシド 3´-monophosphates、dephosphorylate を好みます。したがって、脱燐酸化されたデオキシリボヌクレオシド 3´ monophosphates (すなわちdeoxyribonucleosides) がない γ-32P から [32P] リン酸塩による T4 ポリヌクレオチド キナーゼによるリン酸化] ATP。しかし、いくつかの化学物質が、ヌクレオチドのバインド (内転弱まり)、デオキシグアノシン、この酵素によってすることができます bedephosphorylated の C8 で置換アリールが付加体のよう。対照的に、他のほとんどは付加体 (例えば、付加体のデオキシグアノシンのN2を代入) ヌクレアーゼ P1 でない脱燐酸化します。32p-ポストラベルのこの変更によりこのメソッドのかなり敏感、以上 3 つの一桁によってその感度を増加します。32p-ポストラベルのこのバージョンがメソッドを提供しますが、さらに DNA (5-10 μ g)、キャリア フリーの過剰量 [γ- 32P] ATP を利用することができます。
豊かにする別の方法、付加体、グプタ25によって記述されている、物理化学的性質を利用してかさばる deoxynucleotide のプロパティが付加体、 nに何を抽出することがでく-相転送エージェント テトラブチル アンモニウム存在下でブタノール[32P] リン酸ラベリング、未変更の弱まりがこの有機溶媒によって抽出される悪いに対し前に塩化 (未定) (図 1)。しかし、少ない疎水性付加で構成される残基、非芳香族扱いにくい部分や小さなアルキルと変更された弱まりの例効果的に抽出されませんn-ブタノール。したがって、彼らは32p-ポストラベル法のこの変更によって分析されるとき本質的に検出されません。
109,10通常当たり、前述の両方のバージョン32p-ポストラベル増加感度と DNA の定量化は非常に (3 桁) 最大付加体、1 つを検出できること付加物ヌクレオチド (0.3 - 3 amol/μ g DNA)。自明で DNA を効率性の化学薬品をテストのこれらの 2 つの方法が推奨され、したがって、彼らは詳細にこの作品のとおり。

<table><tbody><tr><td>トリス</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>P9541</td><td></td></tr>酢<tr><td>酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>フェノール</td><td>ロス0032.8</td><td></td><td></td></tr>フェ<tr><td>ノール/クロロホルム/イソアミルアルコール</td><td>ロス</td><td>A156.1</td><td></td></tr>エ<tr><td>タノール</td><td>ペンタ</td><td>70390-11000</td><td></td></tr><tr><td>子牛胸腺 DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4522</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>NADP+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5755</td><td></td></tr><tr><td>NADPH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7505</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース 6-リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647001</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース 6-リン酸デヒドロゲナーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6378</td><td></td></tr><tr><td>Supersomes</td><td>Corning Gentest</td><td>456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202</td><td></td></tr><tr><td>ヒト肝臓 ミクロソーム</td><td>Corning Gentest</td><td>452172</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77662</td><td></td></tr><tr><td>2-ヒドロキシピリミジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H56800</td><td></td></tr><tr><td>酢酸エチル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437549</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179272</td><td></td></tr><tr><td>黄色ブドウ球菌/em<></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>子牛の脾臓、II型</td><td>カルバイオケ</td><td>524711</td><td></td></tr><tr><td>ムからのホスホジエステラーゼヌクレアーゼP1 Penicillium citrinum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8630</td><td></td></tr><tr><td>ビシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>163791</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>スペルミジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>塩化テトラブチルアンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86870</td><td></td></tr><tr><td>n-ブタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437603</td><td></td></tr><tr><td>T4-polynucleotide kinase</td><td>USB Corp</td><td>70031Y</td><td></td></tr><tr><td>[&gamma;-32P]ATP</td><td>Hartman Analytic GmbH</td><td>FP-201</td><td></td></tr><tr><td>PEI含浸セルロース TLCプレート</td><td>Macherey-Nagel</td><td>801053</td><td></td></tr><tr><td>Packard Instant Imager A202400</td><td>Packard</td><td>G120337</td><td></td></tr><tr><td>Ellipticine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>285730</td><td></td></tr><tr><td>参考文献40</td><td></td><td></td>に示すように調製(合成)した<td>3-ニトロベンザントロン</td></tr></tbody></table>

共有結合 dna 付加体生成活性酵素によって発ガン性物質の in vitro薬物と32p-ポストラベルで決意

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

共有結合 DNA 付加体の化学物質によって形成される発がん性の薬は発がんプロセスの初期段階で最も重要な要因の一つと判断されたか。癌の原因を考えると、この結合は、今化学発がんのセントラル ドグマとして評価されます。ここでは、チトクローム P450 によって触媒反応を用いた方法を説明し、付加体の化学物質や代謝産物がこれらの DNA を形成するの活性化のための薬の効力を調査するその他の微生物による分解酵素。体内酵素シトクロム P450 に他体内の酵素、すなわちペルオキシダーゼ、NADPH: チトクローム P450 (ミクロゾーム及びサンプルを有する細胞画分の分離を記述する手順を紹介してNAD (P) h: キノン酸化還元酵素、またはキサンチン酸化酵素酸化還元酵素)。メソッドの説明また、分析化学物質の代謝活性化のための DNA の隔離のためのそれらと同様、これらの酵素によって使用できます。さらに、検出および化学/医薬品由来 DNA の定量化できる適切な方法は、すなわち、 32p-ポストラベル法のさまざまな変更を内転、放射性ラベルの雇用の化学物質を分析、詳細に表示されます。

中間体の共有結合の結果に代謝される化学物質 (発ガン性物質/薬) の効力を調査する (すなわちP450、ペルオキシダーゼ、還元酵素) の活性化酵素触媒の利用のためにはここで説明したプロトコルを使用してください。DNA に結合 (世代の DNA 付加物)、(i) (ため検討を見る、29,30,31)、抗悪性腫瘍剤エリプチシンの薬理作用の新規のメカニズムを解決することができました (ii) 2 つの病因植物 (のレビューを参照してください、32,33,34、アリストロキア酸をアルカロイド (アリストロキア酸腎とバルカン流行性腎症) による上部尿路管癌に関連付けられている neph...

環境化学物質、酵素中間体の共有結合 DNA の生成に bioactivated が付加体に薬剤の効力を評価するがんとその治療法の開発に重要な分野です。DNA 付加体、その検出と定量の技術だけでなく、フォームに化合物の活性化のための方法を説明します。

共有結合 DNA 付加体生成活性酵素によって発ガン性物質の in Vitro薬物と32p-ポストラベルで決意

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

このプロトコルの全体的な目標は、シトクロムp450および追加の生体内変換酵素によって触媒される反応を使用して、化学物質または薬物が共有結合DNA付加物を形成する代謝産物に活性化するための効力を調査する方法の説明です。この方法は、がんの発生とその治療の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、環境化学物質や薬物の効力を評価して、がんの発生の開始を表す共有結合DNA付加物を形成する方法の一種を示していることです。化学物質の発がん性を決定する技術の意味。環境効力、毒物、および薬物、およびそのような化合物によって形成される共有結合DNA付加物の形成のための比較的単純な方法も決定します。この方法は、がんの発生とその治療の開始に関する洞察を提供しますが、他の科学分野にも適用できます。分子メカニズムの研究、DNA損傷の研究、酵素の活性化と化学物質の毒素化に関する口頭研究など。この方法のアイデアを初めて耳にしたのは、化学発がんの開始段階に関与するプロセスを調査したときでした。まず、すべての化合物と酵素システムを最終容量の0.75ミリリットル、摂氏4度まで加えて、インキュベーション混合物を調製します。これは、シトクロムp450の存在下で発がん性物質をDNAとインキュベートするためです。次に、ミクロソームまたは純粋な組換え体p450をスーパーソームで混合物に加えます。次に、DMSOに溶解した0.1ミリモルエリプチシン薬7.5マイクロリットルと水42.5マイクロリットルを加えて、最終容量を0.75ミリリットルに調整します。次に、チューブを5秒間ボルテックスして成分を混合します。直後に、蓋を開けた状態でチューブを摂氏37度で30〜60分間インキュベートします。次に、フェノールまたはフェノールクロロホルムを、エッペンドルフチューブ内のインキュベーション混合物と1対1の比率で混合します。これにより、インキュベーション混合物中のDNAからタンパク質汚染が除去されます。次に、混合物を攪拌してエマルジョンを形成します。次に、混合物を1600倍gで周囲温度で3分間回転させます。遠心分離が終了したら、ピペットを使用して上部水相を新しいポリプロピレンチューブに移します。次に、タンパク質界面を有機相と一緒に廃棄します。次に、水相を等量のフェノールとクロロホルムと1対1の比率で混合します。その後、遠心分離を繰り返します。次に、収集した水相に同量のクロロホルムを加え、再び遠心分離します。次に、マイナス20°Cに維持された2容量の冷エタノールを添加することにより、水相からDNAを沈殿させます。次に、溶液をよく混ぜます。DNA付加物を標識する準備をするには、ビシン緩衝液を放射性標識ATP溶液と混合してDNA付加物を標識します。標識混合物をNP1溶液またはブタノール濃縮混合物に加えま

formation-covalent-dna-adducts-enzymatically-activated-carcinogens

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JoVE Journal

Biochemistry

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