共有結合 DNA 付加体生成活性酵素によって発ガン性物質の in Vitro薬物と32p-ポストラベルで決意
2018年3月20日
環境化学物質、酵素中間体の共有結合 DNA の生成に bioactivated が付加体に薬剤の効力を評価するがんとその治療法の開発に重要な分野です。DNA 付加体、その検出と定量の技術だけでなく、フォームに化合物の活性化のための方法を説明します。
このプロトコルの全体的な目標は、シトクロムp450および追加の生体内変換酵素によって触媒される反応を使用して、化学物質または薬物が共有結合DNA付加物を形成する代謝産物に活性化するための効力を調査する方法の説明です。この方法は、がんの発生とその治療の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、環境化学物質や薬物の効力を評価して、がんの発生の開始を表す共有結合DNA付加物を形成する方法の一種を示していることです。
化学物質の発がん性を決定する技術の意味。環境効力、毒物、および薬物、およびそのような化合物によって形成される共有結合DNA付加物の形成のための比較的単純な方法も決定します。この方法は、がんの発生とその治療の開始に関する洞察を提供しますが、他の科学分野にも適用できます。
分子メカニズムの研究、DNA損傷の研究、酵素の活性化と化学物質の毒素化に関する口頭研究など。この方法のアイデアを初めて耳にしたのは、化学発がんの開始段階に関与するプロセスを調査したときでした。まず、すべての化合物と酵素システムを最終容量の0.75ミリリットル、摂氏4度まで加えて、インキュベーション混合物を調製します。
これは、シトクロムp450の存在下で発がん性物質をDNAとインキュベートするためです。次に、ミクロソームまたは純粋な組換え体p450をスーパーソームで混合物に加えます。次に、DMSOに溶解した0.1ミリモルエリプチシン薬7.5マイクロリットルと水42.5マイクロリットルを加えて、最終容量を0.75ミリリットルに調整します。
次に、チューブを5秒間ボルテックスして成分を混合します。直後に、蓋を開けた状態でチューブを摂氏37度で30〜60分間インキュベートします。次に、フェノールまたはフェノールクロロホルムを、エッペンドルフチューブ内のインキュベーション混合物と1対1の比率で混合します。
これにより、インキュベーション混合物中のDNAからタンパク質汚染が除去されます。次に、混合物を攪拌してエマルジョンを形成します。次に、混合物を1600倍gで周囲温度で3分間回転させます。
遠心分離が終了したら、ピペットを使用して上部水相を新しいポリプロピレンチューブに移します。次に、タンパク質界面を有機相と一緒に廃棄します。次に、水相を等量のフェノールとクロロホルムと1対1の比率で混合します。
その後、遠心分離を繰り返します。次に、収集した水相に同量のクロロホルムを加え、再び遠心分離します。次に、マイナス20°Cに維持された2容量の冷エタノールを添加することにより、水相からDNAを沈
殿させます。次に、溶液をよく混ぜます。DNA付加物を標識する準備をするには、ビシン緩衝液を放射性標識ATP溶液と混合してDNA付加物を標識します。標識混合物をNP1溶液またはブタノール濃縮混合物に加えます。
混合物を室温で30分間放置します。次に、PEI-セルロースTLCプレート上のサンプル全体に約20マイクロリットルを塗布します。PEI-セルロースTLCプレート上のサンプルを見つけた後、プレートをD1方向に発達させたままにして、付加物をクリーンアップします。
プレートが乾いたら、プレートをD3およびD4方向に発達させます。D3で開発するには、pH 3.5のギ酸リチウム緩衝液と尿素を使用します。D4の開発には、塩化リチウムと尿素を含むTris-HClバッファーを使用します。
D4方向に現像する際の問題を避けるため、プレートもD5方向に現像してください。まず、P32ポストラベリング技術を利用して、DNA付加物の形成におけるミクロソームp450媒介生物活性化エリプチシンの効率を研究します。結果は、ラットおよび/またはヒトの肝臓ミクロソームの存在下で、ウシ胸腺DNAのデオキシグアノシンに共有結合DNA付加体が形成されることを示しています。ただし、対照群では付加物は形成されません。
次に、ペルオキシダーゼ酵素依存性活性化エリプチシンの可能性について検討します。この画像は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウシラクトペルオキシダーゼ、およびヒトミエロペルオキシダーゼの存在下でのウシ胸腺DNAの共有結合DNA付加物の形成を示しています。実際、DNA付加体は、ラットがin vivoで体重1キログラムあたり40ミリグラムのエリプチシンで治療されたときにも肝臓のDNAから形成されます。
興味深いことに、ヒトシトクロムp450酵素CYP3A4も、エリプチシンを効率的に酸化して12-ヒドロキシエリプチシンや13-ヒドロキシエリプチシンなどの代謝物に酸化する強い可能性を示しています。これらの代謝産物は、DNAに容易に結合して付加物を形成することができます。次に、ヌクレアーゼP1およびn-ブタノール濃縮法を使用して、ラットおよびヒト由来のNQ01などの細胞質レダクターゼによる3-ニトロベンザントロンの活性化によるDNA付加物の形成を研究します。
その結果、ラット、ヒト肝細胞質、およびマウスの肝臓から得られたウシ胸腺DNAから最大5つのDNA付加体が形成されることが示されています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2日で完了します。この手順を試みることにより、使用される酵素システムの安定性を覚えておくことが重要です。
氷上に保存しないと、酵素活性が低下する可能性があります。その開発後、この技術は、化学発がんの生化学である生化学の分野の研究者が、生物の癌発生の開始過程から現象の性質を探求する道を開きました。このビデオを見れば、遺伝的共有結合DNA付加物を代謝するために酵素的に活性化される環境化学物質や薬物の効力を評価する方法についてよく理解できるはずです。
このプロセスは、がんベースの治療法の開発にとって非常に重要です。非常に危険な化学物質を扱っていることを忘れないでください。潜在的な発がん性物質、放射性化学物質、例えばリンATP。
したがって、この手順を実行するときは、実験用ラテックス手袋やプレキシガラスシートなどの予防策を常に講じる必要があります。
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概要
本プロトコールでは、がんの発症に不可欠な、酵素的にバイオアクティベーション（生体内活性化）されて共有結合性DNAアドダクトを形成する環境化学物質および薬剤の効力を評価する方法について説明します。概説する手法により、これらのDNAアドダクトの検出と定量が可能となり、その発がん性の潜在能に関する知見を得ることができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- がん研究
- 毒性学
- 生化学
背景
- 反応性代謝物がDNAに結合すると、共有結合性DNAアドダクトが形成されます。
- 化学物質の活性化を理解することは、その発がん性リスクを評価する上で不可欠です。
- シトクロムP450酵素は、これらの化合物の生物学的変換において重要な役割を果たしています。
- この手法は、がん研究以外のさまざまな科学分野にも適用可能です。
研究目的
- 環境化学物質および薬剤がDNAアドダクトを形成する能力を評価すること。
- がん発生の開始を評価するための手法を提供すること。
- がん治療における化学的活性化の影響を探索すること。
使用方法
- シトクロムP450およびその他の生物変換酵素の利用。
- 反応性中間体を生成させるための化合物の活性化。
- DNAアドダクトの検出および定量技術。
- アドダクト形成のための比較的簡便な手法の適用。
主要な結果
- 化学的有効性を評価する上での本手法の有効性を実証した。
- 発がんのメカニズムに関する知見を提供した。
- がん研究および治療におけるこれらの手法の重要性を強調した。
- 他の科学分野への応用の可能性を示した。
結論
- 記載された手法は、環境化学物質の発がん性を評価する上で有用です。
- DNAアドダクトの形成を理解することは、がん予防戦略において極めて重要です。
- 本プロトコルは、より安全な医薬品や化学物質の開発に寄与します。
よくある質問
業界における重要性
酵素的に活性化される発がん物質や薬剤による共有結合性DNAアドダクト形成の定量化は、腫瘍学および毒性学のパイプラインにおける初期段階のターゲット検証およびメカニズム的なリスク低減において極めて重要です。このアプローチにより、遺伝毒性のリスクを予測的に評価することが可能となり、ポートフォリオの優先順位付けや、リスクを調整した開発推進の意思決定を支援します。これらのアッセイを創薬ワークフローに統合することで、化合物選択の信頼性が向上し、トランスレーショナル戦略への知見が得られます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲット検証
- 化学物質および薬剤誘発性のDNA損傷メカニズムの直接的な解析を可能にします。
- 発がんに関連する代謝活性化経路の機能的バリデーションをサポートします。
- バイオアクティベーションと遺伝毒性結果を関連付けることで、メカニズムに基づくリスク低減を促進します。
- オンコロジーおよび安全性ポートフォリオにおける化合物の優先順位付けに対する予測信頼性を提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 化合物ライブラリ全体におけるDNAアドダクト形成を評価するための、検証済みin vitroシステムの構築。
- 32P-ポストラベリングによる定量的かつ再現性のあるリードアウトを提供し、堅牢なアッセイの標準化を実現。
- 代謝活性化およびDNA反応性プロファイルの拡張可能なスクリーニングを可能にする。
- ハイスループットな遺伝毒性試験および安全性試験への後続的な統合をサポート。
トランスレーショナル・前臨床研究
- in vitroのDNA付加体データをin vivoのバイオマーカー開発と整合させ、トランスレーショナルな連続性を確保します。
- 種を越えた代謝活性化経路をマッピングすることで、前臨床リスクアセスメントに情報を供します。
- 遺伝毒性影響を早期に検出するためのトランスレーショナルバイオマーカーの特定を支援します。
- メカニズム的な知見を前臨床エンドポイントに結びつけることで、候補物質選定のリスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、化合物の代謝とDNA損傷の間のメカニズム的な関連性を示すことで、初期探索、リード化合物の同定、および前臨床安全性評価を橋渡しするものです。
- 探索生物学： 代謝活性化およびDNA付加体形成の仮説検証を、早期のリスク低減ステップとして可能にします。
- スクリーニング： 化合物の遺伝毒性プロファイルを比較するための、定量的で再現性のあるアウトプットを提供します。
- 分析： データに基づいた意思決定を行うため、DNA付加体の高感度な検出および定量化を実現します。
- トランスレーショナルリサーチ： in vitroからin vivoモデルへのバイオマーカーの整合性と連続性をサポートします。
- 企業内での再利用： 多様な化合物クラスや生物学的システムに適応可能な、標準化されたプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ターゲットバリデーションにおける予測信頼度を高め、遺伝毒性のメカニズム的な理解を深める。
- 運用上の価値：クロスファンクショナルチームにおけるアッセイの再現性、標準化、および拡張性を向上させる。
- 戦略的価値：意思決定（go/no-go）を改善し、予期せぬ遺伝毒性リスクによる後期の脱落を減少させる。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整後の優先順位付けを可能にし、より安全で効果的な候補物質の推進を実現する。
実施上の検討事項
- 酵素学、放射性標識、およびDNA付加体分析の専門知識が必要です。
- チトクロムP450系、生物変換酵素、および放射化学的な取り扱い設備へのアクセスが不可欠です。
- 再現性のあるデータ生成のためには、チーム間での厳格な標準化が必要です。
- 様々なモデルシステムに適応可能ですが、酵素の安定性と保存条件に敏感です。
- 有害物質および放射性物質の取り扱いを含むため、厳格な安全プロトコルが要求されます。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:04
Title
2:01
Incubation of Carcinogen and Drugs with DNA in the Presence of Enzymatic Systems
3:04
Isolation of the DNA from the Incubate
4:30
32P-postlabeling for Detection of DNA Adduct Formation
5:04
TLC Separation of Adducted Deoxyoligonucleotides
5:43
Results: Study of the Potency of Metabolically Active Ellipticine Drug in Generating Covalent DNA Adducts
7:33
Conclusion
