Name: 部位特異的タンパク質のリジンのアセチル化のサクシニル化化学量論組成データに依存しない取得質量分析法による定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: 学ぶ、データ非依存的質量分析法を用いたタンパク質のアセチル化とサクシニル化の部位特異的化学量論定量法。この手法は複数のリジン残基を持つペプチドからも正確な修飾率を測定でき、可逆的タンパク質制御の研究に有用です。

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この作品は、NIH 国立研究所糖尿病によって支えられたし、消化器・腎臓疾患 NIH の NIDDK 付与 R24 DK085610 (PI: E. バードン)。JGM NIH T32 交わりに支えられ (T32 AG000266、PI: J. campisi さん)。著者は NIH からのサポート共有バック所 TripleTOF 6600 システム計装グラント認める (1S10 OD016281、PI: マリンスイーツ ギブソン)。

1. 定量的従って同位体標識を使用してビスグリシネートかな蛋白質および/または酢酸または無水コハク酸
<ol><li>並行して、1 μ g/μ L (100 μ L の合計) の濃度でのウシ血清アルブミン (BSA) 蛋白質のサンプルの 100 μ g 3 複製を準備尿素と triethylammonium の重炭酸塩 (TEAB) ソリューション (8 M 尿素、200 mM TEAB、pH 8) を使用して。 注: アミン フリー バッファーを使用することが重要です。BSA、定量的サクシニル化 BSA であり、混合物とサンプルその BSA を降伏の定義サクシニル化占有率 0%、1%、10%、50%、100% でそれぞれ代表の結果セクションでここで使用される蛋白質のサンプル (各サンプルの準備で 3 レプリケートします)。このプロトコルは大腸菌由来タンパク質溶解液の使用も行われて、マウス肝4。プロトコルは、他の細胞や組織の溶解液にも適用できます。</li>
	<li>ジチオトレイトール 250 mM 20 mM DTT の最終濃度に到達し、1,400 rpm で攪拌と 37 ° C, 30 分でサンプルをインキュベート (DTT) の 8 μ L で BSA サンプル (100 μ g) を 100 μ l 添加を減らします。</li>
	<li>アルキレート 40 mM ヨードアセトアミドの最終濃度に到達し、室温で 30 分間暗闇の中でサンプルをインキュベートする 200 mM ヨードアセトアミド 21.6 μ L で低下した BSA サンプル。 注意: 重要ですヨードアセトアミド濃度を少し持っているすべてはタンパク質チオールを減少できるように DTT 濃度よりも 2 倍、アルキル化します。</li>
	<li>
無水酢酸 -d6 (ステップ 1.4.1) またはコハク酸無水物-d4 (ステップ 1.4.2) 化学 (定量的) アセチル化またはサンプルのサクシニル化に必要な準備を進めます。
	<ol>
<li>分子量 (108.13 g/mol) と密度 (1.143 g/mL 25 ° c) から水性酢酸無水 -d6ソリューションの 1 g 因数のモル濃度 (M) を決定します。 注: 1 g パッケージには、無水酢酸 -d6サンプルのアセチル化あたりの使用 10.57 M 溶液を降伏 875 の μ L のボリュームの 9,248 µmol が含まれています。</li>
		<li>試薬の加水分解を避けるためにすぐに反応する前に無水 DMSO の粉末を溶解することによりコハク酸無水物-d4の 5 M 溶液を準備します。コハク酸無水-d4 5 M 解を得るため無水 DMSO の 461 μ L の 0.24 g を溶解します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>それぞれ、無水酢酸 -d6 (10.57 M 溶液 6 μ L) またはコハク酸無水物-d4 (5 M 溶液 12 μ L) 60 µmol を追加することによって定量的な化学アセチル化やサクシニル化を実行し、孵化させなさい、渦のミキサー上で 20 分間の 4 ° C でのサンプルです。 注: 無水物の酸性タンパク質が沈殿させます。メモを取る、1.6 の手順で説明されているように調整します。</li>
	<li>〜 8 O アシル化側の製品を排除するために pH を高めるため孵化後 7.25 M NaOH の 10 μ L を追加します。簡単に渦と ph 試験紙でスポッティング 1 μ L でサンプルの pH をチェック。 注: 場合によっては、pH 8 に到達する 7.25 M NaOH の以上 10 μ L を追加する必要があります。さらに、潜在的に沈殿したタンパク質は再解散すべきです。</li>
	<li>3 回の合計は 1.5 と 1.6 あたりアシル化と pH 調整手順を繰り返します。PH 値をチェックし、基本的なソリューションを繰り返しあたりに追加のボリュームに注意してください。上記の間に素早く作業化学アシル化の手順、無水物が加水分解反応性を失うので。</li>
	<li>ラベリングの反応と pH の調整の最終的な後 O アシル化側の反応を元に戻す 50% ヒドロキシルアミン溶液 10 μ L を追加します。</li>
</ol>2. ダイジェスト反応 Glu C Endoproteinase を使用して蛋白質のサンプル
<ol><li>0.8 M 50 ミリメートル TEAB、pH 8 を使用する尿素の濃度を希釈し、サンプル ボリュームを正規化します。</li>
	<li>1:50 で endoproteinase Glu C を追加することによって蛋白質のサンプルを消化プロテアーゼの基質タンパク質比 (w/w) 1,400 rpm で攪拌と 37 ° C で一晩サンプルをインキュベートし、。</li>
	<li>酸性化し、ボリュームによって 1% ギ酸を加えることによって蛋白質の消化サンプルを消します。</li>
	<li>
親水親油バランス固相抽出カートリッジを使用してサンプルの塩分を除きます。サンプルでは、最大 5 mg 当りカートリッジ4,18あたり 30 mg 吸着剤カートリッジを 1 個を使用します。 注: この脱塩プロセス全体濡れているカートリッジ内の吸着剤を維持することが重要です。必要なときは、溶媒またはカートリッジを通して試料の通過を遅く真空ポンプをオフに。<ol>
<li>24 ポートのガラス ブロックの真空マニホールドのポートにカートリッジを挿入し、真空ポンプをオンにします。未使用ポートのキャップを残します。1 つまたは 2 つのポートは非必要に応じて真空ゲージの低圧を維持するためにキャップのままにします。</li>
		<li>2 倍の 80% アセトニ トリル (ACN)/0.2% ギ acid/19.8% 水 800 μ L で各カートリッジを濡れています。溶剤レベルは 2-3 mm 上吸着剤のレベルのままを確認します。マニホールドの真空ゲージを読み取り 16.9-67.7 kPa (5-20 Hg で) を確認します。</li>
		<li>水の 0.2% ギ酸の 800 μ L で 3 回各カートリッジを平衡します。マニホールドの真空ゲージを読み取り 16.9-67.7 kPa (5-20 Hg で) を確認します。</li>
		<li>カートリッジにペプチドのサンプルをロードします。マニホールドの真空ゲージを読み取り 6.77-なる 847万 kPa (Hg の 2-2.5)、流量が 1 mL/分を超えないことを確認します。</li>
		<li>3 回水の 800 μ L 0.2% ギ酸と各カートリッジを洗ってください。マニホールドの真空ゲージを読み取り 16.9-67.7 kPa (5-20 Hg で) を確認します。</li>
		<li>真空マニホールドからカートリッジを取り外し、1.5 mL マイクロ チューブに落ち着きます。</li>
		<li><li></ol></li><li> </li></ol><ol><li> </li><li><li></li><li> </li><li> </li></ol><ol><li><ol><li></li><li></li><li> </li></ol></li><li></li></ol><ol><li> <ol><li></li><li><li> </li><li></ol></li><li> <ol><li> </li><li></li><li><li></li><li><li><li></ol></li><li> <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57209/57209eq1.jpg"></li><li><li><li><li></ol>

<ol><li>Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+landscape+of+lysine+acetylation+links+metabolism+and+cell+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).</li>
<li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((50+years+of+protein+acetylation%3A+from+gene+regulation+to+epigenetics%2C+metabolism+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).</li>
<li>Choudhary, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+acetylation+targets+protein+complexes+and+co-regulates+major+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions.</a> Science. 325 (5942), 834-840 (2009).</li>
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<li>Still, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+mitochondrial+acetylation+dynamics+highlights+prominent+sites+of+metabolic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantification of mitochondrial acetylation dynamics highlights prominent sites of metabolic regulation.</a> J Biol Chem. 288 (36), 26209-26219 (2013).</li>
<li>Wagner, G. R., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+and+enzyme-independent+N%CE%B5-acetylation+and+N%CE%B5-succinylation+of+proteins+in+the+chemical+conditions+of+the+mitochondrial+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Widespread and enzyme-independent Nε-acetylation and Nε-succinylation of proteins in the chemical conditions of the mitochondrial matrix.</a> J Biol Chem. 288 (40), 29036-29045 (2013).</li>
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<li>Zhou, T., Chung, Y. H., Chen, J., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-Specific+Identification+of+Lysine+Acetylation+Stoichiometries+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Site-Specific Identification of Lysine Acetylation Stoichiometries in Mammalian Cells.</a> J Proteome Res. 15 (3), 1103-1113 (2016).</li>
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<li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS1+Peptide+Ion+Intensity+Chromatograms+in+MS2+%28SWATH%29+Data+Independent+Acquisitions.+Improving+Post+Acquisition+Analysis+of+Proteomic+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">MS1 Peptide Ion Intensity Chromatograms in MS2 (SWATH) Data Independent Acquisitions. Improving Post Acquisition Analysis of Proteomic Experiments.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2405-2419 (2015).</li>
<li>Gillet, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+data+extraction+of+the+MS%2FMS+spectra+generated+by+data-independent+acquisition%3A+a+new+concept+for+consistent+and+accurate+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li>
<li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nat Biotechnol. 27 (7), 633-641 (2009).</li>
<li>Svinkina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep%2C+Quantitative+Coverage+of+the+Lysine+Acetylome+Using+Novel+Anti-acetyl-lysine+Antibodies+and+an+Optimized+Proteomic+Workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Deep, Quantitative Coverage of the Lysine Acetylome Using Novel Anti-acetyl-lysine Antibodies and an Optimized Proteomic Workflow.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2429-2440 (2015).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversed-phase+chromatography+with+multiple+fraction+concatenation+strategy+for+proteome+profiling+of+human+MCF10A+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10A cells.</a> Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).</li>
<li>Schilling, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+acetylation+dynamics+in+response+to+carbon+overflow+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Protein acetylation dynamics in response to carbon overflow in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 98 (5), 847-863 (2015).</li>
<li>Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+High-Quality+SWATH+Acquisition+Data+for+Label-free+Quantitative+Proteomics+Studies+Using+TripleTOF+Mass+Spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of High-Quality SWATH Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF Mass Spectrometers.</a> Methods Mol Biol. 1550, 223-233 (2017).</li>
<li>Meyer, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIQED%3A+automated+identification+and+quantification+of+protein+modifications+from+DIA-MS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">PIQED: automated identification and quantification of protein modifications from DIA-MS data.</a> Nat Methods. 14 (7), 646-647 (2017).</li>
<li>Rost, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSWATH+enables+automated%2C+targeted+analysis+of+data-independent+acquisition+MS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">OpenSWATH enables automated, targeted analysis of data-independent acquisition MS data.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 219-223 (2014).</li>
<li>Lambert, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+differential+interactomes+by+affinity+purification+coupled+with+data-independent+mass+spectrometry+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping differential interactomes by affinity purification coupled with data-independent mass spectrometry acquisition.</a> Nat Methods. 10 (12), 1239-1245 (2013).</li>
<li>Bruderer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+limits+of+quantitative+proteome+profiling+with+data-independent+acquisition+and+application+to+acetaminophen-treated+three-dimensional+liver+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (5), 1400-1410 (2015).</li>
<li>Weinert, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+Quantification+of+Site-specific+Acetylation+Stoichiometry+Reveals+the+Impact+of+Sirtuin+Deacetylase+CobB+on+the+E.+coli+Acetylome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Accurate Quantification of Site-specific Acetylation Stoichiometry Reveals the Impact of Sirtuin Deacetylase CobB on the E. coli Acetylome.</a> Mol Cell Proteomics. 16 (5), 759-769 (2017).</li>
</ol>

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このプロトコルは、小説とサイト固有のリジンのアセチル化と全体プロテオームに適用できるサクシニル化占有を定量化する正確な方法を提供します。このメソッドは、内因性光ペプチドと生成された体外タンパク質の化学的アシル化定量を用いた重水素化酢酸無水-d6うち後者は、外因性の重いペプチドの測定に依存していますかコハク酸無水物-d4 (図 1)。同様のメソッド ネイティブ未変更のリジン残基の安定同位体標識を使用し、いずれか前駆物質イオン専用12またはフラグメント イオン DDA 買収13,14からに基づいたサイト占有率の定量化を行います。このプロトコルはアシル化効率を改善するために試料中にいくつかの手順を適用し、サクシニル化する化学標識化を拡張します。DIA 買収を使用して、データ コレクションを取得前駆イオンと MS2 フラグメント イオン強度フラグメント イオンの干渉を減らす全体の検出可能な質量範囲にします。分析・ スカイライン ・自社開発のカスタム スクリプト経由で数量化含む 1 つ以上のリジン残基と 1 つのサイトで 1 つ以上のアシル化ペプチドのサイト占有率計算を許可します。
サンプル準備段階で密接に従う必要がありますこのプロトコルのいくつかの重要な手順があります。全体のプロトコルは、すべてのリジン残基の効率的な化学修飾に依存しているので、この手順は非常に重要です。ライセートの蛋白質アミンを含むバッファーまたは汚染物質分子を避けなければならないので、無水物は遊離アミンと反応します。また化学あたりアシル化段階では、反応混合物の pH が調整されて pH 8 に戻る各無水試薬と 3 つ孵化の後この反応混合物の酸性し、O アシル化副反応を形成可能性がありますを確認します。さらに、8 M 尿素を含む反応混合物に周りが最適な範囲内に pH を消化してチェック前に 0.8 M 尿素の希釈は Glu C. endoproteinase の最適な活動のために重要プロトコルの主要なコンポーネントはデータ収集ステップと DDA データ サンプリング不整合を克服、MS2 のフラグメント イオンのレベルで定量化が可能、DIA ワークフローの導入。DIA 手法の主な利点の 1 つは、通常はるかに傾向がある、問題があるとき (以前の出版物のいくつかを示唆している)、MS1 前駆イオン信号の干渉の減少です。
非常に複雑なサンプルを準備する際、ワークフローにいくつかの変更を行うことが。中に使用する分数も LC さんさらに、クロマトグラフィーによるグラデーションになったことによって取得がプールされたサンプルの複雑さを低減するオフライン基本 pH 逆相 HPLC 分画を小さくした後にプールの数ペプチドのよりよい分離を可能にする買収。また、裂かれたペプチッドのより大きい変化を生成し、タンパク質のリジン残基のカバレッジを高めるのためのサンプルを消化する複数のプロテアーゼを使用する可能性があります。試運転と最適化は、アセチル化またはサクシニル化の特定の割合を含む商業の BSA を使用して実施できます。
この議定書の 1 つの制限は、メチル化、ユビキチン化など、同じサイト4などの他のリジン変更を行方不明ため可能性のあるわずかなサイト占有率の過大評価です。光と重いアシル変更、L/(L+H) のピーク面積から計算サイト占有率はリジン サイトでの変更の合計レベルが '光' アシル化のみ内因性 (L) で構成されているという仮定に基づいて、化学的に「重い」というラベルの付いたアシル化 (H)。しかし、サイト体内における実際合計アシル化占有率はアセチル化および/またはサクシニル化を超えてその他の変更を含めることができます。さらに、購入した試薬無水酢酸 -d6 (99%) とコハク酸無水物-d4の報告された同位体純度 (> 98%) を 2% (サクシニル) または 1% (アセチル) の小さな過大評価に貢献するかもしれない、内因性アシル化レベル4。一緒に、これらのわずかな過大評価を加える難易度 1% 未満でサイトの定量化における占有率。大きい豊富の完全な違い化学的にアシル化ペプチドとネイティブのアシル化ペプチドにも、潜在的なサイト占有数量誤りで、特に低内因性アシル化ペプチド27。Weinertらによる最近の研究。27発見完了あたりアセチル化ペプチドの減らされた豊富な違いが定量化エラー27を減らすことができます。
このプロトコルを使用して収集した化学量論数量は、生物学的フォロー アップ実験、関心のある特定のサイトのサイト指示された突然変異誘発のための特定蛋白質およびフォーム仮説に重要なアシル化のホット スポットを特定することが。このプロトコルは、タンパク質の構造安定性に間接または微妙な影響を及ぼす可能性がありますし、携帯電話環境をローカライズ低アシル化化学量論サイトの併用効果を明らかにすることも。さらに、アセチル化およびサクシニル化、アセチル化を超えてその他の可能なリジン アシル化の変更を測定するこの議定書の実施が別の下で蛋白質の動的アシル化効果洞察を提供一意に生物学的条件。

NƐ- 蛋白質のリジン残基のアシル化は、タンパク質の機能の重要なレギュレータです。リジンのアセチル化およびサクシニル化、malonylation、glutarylation などの他の acylations は他の細胞プロセス1,2,の3,4、細胞のシグナル伝達、代謝を調節すると考えられています。、代謝性疾患5の含意があるとします。数多くの研究発見したリジン アシル変更の哺乳類ティッシュの異なった条件の下で大規模な倍変化、セルの行5,6,7,8と同様細菌9,10,11, しかし、これらの相対的なフォールドの変更を提供しません変更総蛋白質の割合への洞察力。アシル化サイト占有率の測定は、不足している12,13,14, 関連性にもかかわらず相対倍より詳細な情報を提供するようにこのような研究に必要な研究を変更します。たとえば、10 倍変更は、0.01 から 0.1%、1 に 10% 以上も 10 ~ 100% にサイト占有率増加を表すことができます。正確な組成比の測定が必要なは、アシル化の生物学的意義を解釈し、構造解析、タンパク質の大きさに関する影響を予測して、場合によっては、機能の変更。
1 つ前サイト占有率を定量化する手法は未変更のリジン残基と比較して外因性、内因性の「光」アセチル化間の比率を測定する質量分析法によるその後の重い安定同位体化学標識化学というラベルの付いた「重い」アセチル リジン前駆イオン強度12を使用しています。周らによる別の最近の調査。13説明もすべて変更されていないリジン残基蛋白質の完全な化学のアセチル化を用いた安定同位体標識がフラグメント イオン強度で測定された使用しているリジンのアセチル化化学量論を評価するために同様のアプローチDDA。中安ら。14は同様の DDA アプローチを使用が、代わりに定量化のため光と重いアセチル リジン導かれるインモニウム イオンの比率を使用します。フラグメント イオンに基づく定量化処理そのままペプチド前駆物質イオン (MS1) と比較して少ない信号干渉のほとんどの場合結果に導かれるインモニウムまたはシーケンスのイオン (MS2)。ただし、DDA による MS/MS スペクトルからのフラグメント イオンの定量化が高い豊富な前駆物質イオンを MS/MS を選択し、したがって、偏りのあり、不完全なサンプリングにつながる可能性が高い確率的サンプリング法の欠陥に苦しむことができます前駆物質イオン。
この斬新なワークフロー4 (図 1) を概念的には安定同位体の化学的ラベル付け手法バエサらによって開発された使用します。12ワークフローは両方の前駆体を収集するために DIA と相まってその後ただし、複数のフラグメント イオン魚鱗検出質量範囲15,16正確な化学量論計算を提供します。
ピーク面積からフラグメント イオン、関心のアシル化サイトが含まれているまたはアシル化サイト占有率 (図 2) を定量化する使用 'フラグメント イオンを区別する'。変更が含まれていないフラグメント イオンは同じ光と重い m/z 値を持つ、ペプチッド識別ではなく、定量化に使用されます。スカイライン ソフトウェア17を使用して前駆体とフラグメント ピーク面積を抽出します。与えられたアシル化サイトを含む複数のフラグメント イオンの存在は、いくつかのフラグメント イオンの干渉が検出された場合に柔軟性を提供します。スカイラインでデータの可視化は、軽-重フラグメント イオン比の重要な検査が可能です。DIA を通じて収集された前駆物質イオンとフラグメント イオンのデータを使用し、定量化マニュアル データ分析に加えて社内、StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR) で作成されたオープン ソースの R パッケージが開発されました。化学量論を部位特異的アシル化ペプチド前駆物質イオン専用強度測定4では不可能な機能複数のリジン残基が含まれているから。
このプロトコルはまた endoproteinase、後者は多くの場合、非常に大規模な生成、ふくらむ可能性があるトリプシンまたは Arg C プロテアーゼを使用する代わりに、グルタミン酸とアスパラギン酸残基の C 末端胸の谷間のために特定である Glu C の使用方法を示しますアシル化蛋白質分解ペプチッドのアシル化リジン残基でブロックされているトリプシン分裂に起因。化学分類のプロシージャまたサクシニル化化学量論サクシニル化の定量化が可能となる無水コハク酸 (図 1) を使用する拡張されました。オフライン、基本的な pH によるペプチド分画の実装サンプル準備の強化に加えてさらにペプチドの逆相 (bRP) 分離減少定量化干渉のより良いデコンボリューションを許可します。アシル化化学量論性全体プロテオーム サンプル。一緒に、このメソッドの機能し、ハイライトのいくつかの利点:; 化学アシル化の効率化 (1)(アセチル化; に加えてタンパク質サクシニル化組成の測定 2)正確さ向上の定量化 (3)。向上の定量化は、bRP によるオフライン ペプチド事前分別の実装と同様に、DDA 前駆体信号と比較して径からのフラグメント イオン信号の減少の干渉によるものです。

<table><tbody><tr><td>水性無水酢酸-d6</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>175641-1G</td><td>1% 同位体純度</td></tr><tr><td>無水コハク酸-d4</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>293741</td><td>2% 同位体</td></tr><tr><td>純度シーケンシンググレード エンドプロテイナーゼ Glu-C</td><td>Roche, 米国インディアナポリス州インディアナポリス (Sigma 経由)</td><td>10791156001</td><td>1:50 プロテアーゼ対基質タンパク質比 (wt:wt)</td></tr><tr><td>Oasis HLB 固相抽出 (SPE) カートリッジ</td><td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td><td>WAT</td><td></td></tr> 094225 <tr><td>HPLC アセトニトリル</td><td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td><td>BJAH015-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC グレードの水</td><td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td><td>BJAH365-4</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>I1149-25G</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>D9779-5G</td><td></td></tr><tr><td>質量分析用 FLUKA ギ酸 (FA)</td><td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA</td><td>C988C27</td><td>~98%</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>PI29700</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Pierce,米国イリノイ州ロックフォード</td><td>88341</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸トリエチルアンモニウム (TEAB)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>T7408-100ML</td><td></td></tr><tr><td>無水ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA</td><td>43998</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム (NaOH)</td><td>EMDMillipore, Burlington, MA, USA</td><td>SX0590</td><td></td></tr><tr><td>水中の 50% ヒドロキシルアミン溶液</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO,米国</td><td>438227-50ML</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS グレード水</td><td>バーディック&ジャクソン、ミシガン州マスキーゴン、米国</td><td>BJLC365-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS アセトニトリル</td><td>バーディック&ジャクソン、ミシガン州マスキーゴン、米国</td><td>BJLC015-4</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ テモミキサー コンパクト</td><td>エッペンドルフ AG、ハンブルク、ドイツ</td><td>T1317-1EA</td><td></td></tr><tr><td>サーモサイエンティフィック サヴァント SPD131DDA SpeedVac 濃縮器</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州ウォルサム</td><td>SPD131DDA-115</td><td></td></tr><tr><td>Waters 1525 バイナリ HPLC ポンプシステム</td><td>Waters Corp., マサチューセッツ州ミルフォード, 米国</td><td>WAT022939</td><td></td></tr><tr><td>Waters 2487 デュアル波長 UV 検出器</td><td>Waters Corp., マサチューセッツ州ミルフォード, 米国</td><td>WAT081110</td><td></td></tr><tr><td>Waters 717plus オートサンプラー</td><td>Waters Corp., マサチューセッツ州ミルフォード, 米国</td><td>WAT022939</td><td></td></tr><tr><td>Waters Fraction Collector III</td><td>Waters Corp., マサチューセッツ州ミルフォード,米国</td><td>186001878</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Zorbax 300Extend C18 カラム</td><td>Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA</td><td>770995-902</td><td></td></tr><tr><td>Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer</td><td>Labconco, Kansas City MO, USA</td><td>7751000</td><td></td></tr><tr><td>Indexed Retention Time (iRT) normalization peptide standard</td><td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td><td>Ki-3002-2</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system</td><td>Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA</td><td>model# 845</td><td></td></tr><tr><td>直交四重極飛行時間型 (QqTOF) TripleTOF 5600 質量分析計</td><td>Sciex LLC, Framingham, MA, USA</td><td>per quote</td><td></td></tr> 直<tr><td>交四重極飛行時間型 (QqTOF) TripleTOF 6600 質量分析計</td><td>Sciex LLC, Framingham, MA, USA</td><td>per quote</td><td></td></tr><tr><td>C18 プレカラムチップ (200 &mu;m &times;6 mm ChromXP C18-CLチップ、3 &mu;メートル、300 &Aring;)</td><td>Sciex LLC, Framingham, MA, USA</td><td>804-00006</td><td></td></tr><tr><td>SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2</td><td>Sciex LLC, Framingham, MA, USA</td><td>software download Sciex</td><td></td></tr><tr><td>Spectronaut</td><td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td><td>Sw-3001</td><td></td></tr><tr><td>C18-CL chip (75 & micro;m x 15 cm ChromXP、3 & マイクロ;メートル、300 &Aring;)</td><td>Sciex LLC、フラミンガム、マサチューセッツ州、米国</td><td>804-00001</td><td></td></tr></tbody></table>

部位特異的タンパク質のリジンのアセチル化のサクシニル化化学量論組成データに依存しない取得質量分析法による定量

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

NƐ- アシル化による蛋白質のリジン残基の翻訳後修飾 (PTM) は、たとえば、酵素活性を変更したり、または相互作用を仲介することによって動的にタンパク質機能を調節することができます構造の変化を誘導します。部位特異的タンパク質アシル化占有または化学量論の正確な定量化はグローバル低レベル化学量論および特定リジンの個々 の高度なアシル化の化学量論の機能的な結果を理解するため残基。他のグループは内因性、自然豊富なアシル化からペプチド前駆体の同位体の比率を比較することによりリジンのアセチル化化学量論組成の測定を報告しているし、外因性、重い同位体標識のアシル化導入後定量安定同位体標識無水酢酸を使用して蛋白質の化学アセチル化。このプロトコルを含む、いくつかの改善をした最適化アプローチを記述する: (1) アセチル化、に加えてタンパク質サクシニル化を測定する能力 (2) 化学的アシル化効率を増加した、(3) による定量精度の向上前駆物質イオン信号集録データ依存型 (DDA) からではなくデータに依存しない買収 (DIA) からのフラグメント イオンの定量化を使用して減らされた干渉。定量化のためのフラグメント イオンから抽出されたピークエリアの使用も一意に前駆イオンを使用して可能ではない 1 つ以上のリジン残基を含むタンパク質のペプチドからサイト レベルのアシル化の化学量論の分化を可能にします。定量化のための信号。スカイライン、オープン ソース定量的プロテオミクス環境では、データの可視化は、便利なデータ検査とレビューします。一緒に、このワークフローには、サイト固有のリジンのアセチル化およびサクシニル化の占有率を明らかにすることがあります、アシル化の生物学的関連性の高いサイトを優先、全体の proteome の公平な正確なそして正確な定量化が提供しています。

データ集録後差別化 MS2 フラグメント イオンを蛋白分解のアシル化ペプチドから求めた、スカイラインと対応する光で処理された後で展開されるイオンのクロマト グラム (XIC)、重いピーク面積であったが輸出されました。最後にサイト占有率を計算するため使用されます。図 2 aは、前駆イオン XIC ことができる方法の概念図を示しています、光と重いペプチドの信号の両方を備えた表示され、対応するフラグメントの例を示します図 2 bで、色分けによるイオン団長は、ヨーロッパ (赤青い光 = = 重) リジン アシル化変更を含むフラグメント イオンを区別します。
図 3は、軽/重サクシニル化 1、10、50、または 100% およびサクシニル化占有又は微量で社内に生成された BSA の事前に定義された比率に着目し上記のように稼働実験、結果はデータを示します。スカイラインに DIA 稼働データをインポートするペプチド配列と (図 3 a) 光と重い前駆イオン フラグメント イオンを表示するターゲット ツリーを簡単に表示できます。各定義済みサクシニル化 BSA 比の DIA MS からデータ immanently 軽-重 y7イオン、識別されたペプチド スペクトルの一致から最高位の差別化フラグメント イオンの比率の相対的な違いを明らかにした (赤で示されている図 3B)。ここでプレ サクシニル化 BSA から成る入力蛋白質のサクシニル化パーセントの占有率を確認した MS2 占有率計算から処理の結果の概要を図 4に示します。商業前サクシニル化 BSA、(例えば0、1、10、50、および 100% で) 定義された割合でサクシニル化から得られる 20 の蛋白質分解サクシニル化ペプチドの測定されたリジン サクシニル化占有は表 2のとおりです。各 20 の蛋白質分解 BSA ペプチド、最高ランクに格付け、MS2 を区別するフラグメント イオンは % で L/(L+H) としてリジン サクシニル化 (Ksucc) の占有率を計算する使用されました。全体的にみて、MS2 ベースの定量化は、低い結果でもアシル化占有率を決定する上で非常に良い精度を示した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig1.jpg"> 図 1: 化学量論ワークフロー 。(A) タンパク質は無水酢酸 -d6従って未変更のリジン残基と 3 回を孵化させます。次に、アセチル化蛋白質は endoproteinase Glu C、basic pH 逆相クロマトグラフィーを使用して蛋白質分解ペプチドの高速液体クロマトグラフィー分画が続くと消化されます。LCMS によるペプチドを分析する最後に、ダイヤを用いた可変前駆体の窓の幅。(B) 同じワークフローは、コハク酸無水物 -d4重いアシル化試薬を除く (A) で説明したように、サクシニル化の化学量論組成を変更を確認するためです。マイヤーらから適応の図。4 (j. アメリカ, 質量分析、オープンな選択)。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig2.jpg"> 図 2: 取得可能なデータの例および化学量論計算します。(A) ライト (L) と 1 つのリジンのアセチル化が異なる 3 質量の単位を含む重い (H) MS1 前駆体イオン。団長は、ヨーロッパがそれぞれ赤と青で示された光と重い同位体エンベロープ生成されます。DIA 買収からのフラグメント イオン団長は、ヨーロッパは、'差別化' アセチル化サイトを含む光と重いフラグメント イオンを使用して実行できる MS2 から (B) の定量化は、赤と青で示されます。一般的なフラグメント イオンは、黒の点線で表示され、変更のサイトが含まれていません。マイヤーらから適応の図。4 (j. アメリカ, 質量分析、オープンな選択)。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig3.jpg"> 図 3: 異なるレベルでサクシニル化蛋白分解の BSA のペプチドのスカイライン可視化。(A) スカイライン ターゲット ツリーでの蛋白質分解ペプチッドを表示 LCKsuccVASLRE、その結果フラグメント イオン。(B) スカイラインは、サクシニル化占有のさまざまなレベルでのフラグメント イオンのクロマト グラムを抽出しました。最高ランクの差別化イオン、y7は 1、10、50、および 100% (社内生成) 前サクシニル化 BSA の入力割合に相関ピーク領域を増加します。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig4.jpg"> 図 4: 前サクシニル化 BSA の BSA アシル化化学量論を評価します。重い変更の定義された率で 5 種類の BSA サンプル (e.g。 0、1、10、50、および 100% で、) MS2 入居の決定を受けた。軽い修正 (例えば0、1、10、50、および 100% で) の定義された率で 5 種類の BSA サンプルの最高ランク差別化フラグメント イオンから 20 サクシニル化 BSA ペプチドのサイト占有率を求めた.ボックス ウィスカのプロットが表示されます 20 サクシニル ペプチドの分布、ペプチドの 50% の値は、'ボックス' (75% の百分位数は 25% 位)、上限のひげ 75% の百分位の値が最大 (100%) に表し、下限のひげ25% パーセン タイルから最小 (0% 位) までの値。(J. アメリカ, 質量分析等オープンな選択)。表 2に、測定の定量化を見つけることができます。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>時間 (分)</td>
			<td>% A</td>
			<td>% B</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.00</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>7.27</td>
			<td>92</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>45.27</td>
			<td>73</td>
			<td>27</td>
		</tr>
<tr>
<td>49.27</td>
			<td>69</td>
			<td>31</td>
		</tr>
<tr>
<td>65.27</td>
			<td>61</td>
			<td>39</td>
		</tr>
<tr>
<td>72.27</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>80.00</td>
			<td>10</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>85.00</td>
			<td>10</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>86.00</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>120.00</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">流量: 0.7 mL/分</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">水で pH 10 ギ酸アンモニウム バッファー a: 10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3"></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

部位特異的タンパク質アセチル化および/またはサクシニル化入居 (化学量論) 内因性変更後導入された変更のレシオ メトリック分析を通して全体の proteome の公平な定量化を紹介ここでは、定量的化学のアシル化の安定同位体標識無水物を使用しています。機密性の高いデータに依存しない取得質量分析法と組み合わせて、正確なサイト占有率測定が得られます。

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

この新しいワークフローの全体的な目標は、特定のアセチル化部位におけるタンパク質の翻訳後修飾の占有率または化学量論を決定することです。この新しい質量分析ワークフローにより、より高いレベルの定量精度が得られます。この方法は、リジンアセチル化やサクシニル化部位など、翻訳後修飾による可逆的タンパク質制御に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。部位は最も高度に修飾され、タンパク質機能を変化させる可能性があります。この手法の主な利点は、リジンアセチル化、サクシニル化、およびスクシニル化の部位レベルの化学量論が正確に測定され、この方法が複数のリジン残基を持つペプチドから化学量論を決定できることです。この手法は、無次元の相対的な存在量の変化を測定する代わりに、アセチル化とサクシニル化の化学量論、または修正されたものと変更されていないものの割合を明らかにするため、非常に関連性があります。私が最初にこの方法を思いついたのは、データに依存しない取得とMS2ベースの定量化を化学量論解析に使用すると、測定精度が大幅に向上することに気付いたときでした。100回の反復を3回準備します

quantification-site-specific-protein-lysine-acetylation-succinylation

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、リジンメチル化の変化を定量化するためにMALDI質量分析法と還元的メチル化化学を使用するための手法を提案する。...

リジン脱メチル化酵素活性の定量測定のためのMassSQUIRMのアプリケーション

ネイティブ組み合わせると高解像度質量分析とクロマチン免疫沈降を架橋することにより、ChroPアプローチはヒストン修飾、変異体及び機能的に異なるクロマチンドメインで相乗非histonicタンパク質の複合プロテオミクスアーキテクチャを分析することができます。...

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

還元ジメチル化（REDIラベリング）によるペプチドの安定同位体標識は、正確な質量分析に基づく定量的プロテオミクスのための迅速、安価な戦略である。ここでは、ほぼすべてのサンプルタイプに適用することができるのRediアプローチを使用してタンパク質混合物の調製および分析のためのロバストな方法を示す。...

安定同位体標識するための還元ジメチル化を用いた定量的プロテオミクス

このプロトコルは、サーチュインの特異的脱アセチル化基質としてのタンパク質の役割を確立し、翻訳後修飾としての可逆的リジンアセチル化の役割をさらに研究するために、in vitroおよびin...

脱アセチル化アッセイは、サーチュインの間にInterplay（SIRT2）と特異的なタンパク質 - 基質を解明します

このプロトコルは、質量分析（MS）を用いて、ヒストンの翻訳後修飾を特徴付けるための完全に統合されたワークフローの概要を説明します。ワークフローは、ナノ流液体クロマトグラフィーおよびデータ分析のための命令を使用して、細胞培養物または組織、ヒストン誘導体、消化、MS分析から、ヒストンの精製を含みます。 3日 - プロトコルは2以内に完了するために設計されています。...

ヒストンの抽出からデータ解析まで：ボトムアップ質量分析法を用いてヒストンの翻訳後修飾の解析のための完全なワークフロー

遺伝コードの拡張は、タンパク質アセチル化を含む、生物学的プロセスの広い範囲を研究するための強力なツールとして機能します。均一に生成するためのこの手法を悪用する安易なプロトコルをアセチル化したタンパク質の大腸菌細胞の特定のサイトを示します。...

大腸菌Site-Specifically アセチル化蛋白質を生成する安易なプロトコル

複雑な生体試料から生じるユビキチン化タンパク質を起源とするdiGlyペプチドの精製、検出、同定方法を紹介します。提示された方法は、ユビキチノメ分析の深さのレベルに関して、再現性、堅牢性、および優れたメソッドを上回る。...

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

このワークフローは、定量的なグローバルプロテオーム分析のために、複数のタンパク質翻訳後修飾(PTM)を同時に時間効率とコスト効率の高い濃縮のパフォーマンスを説明します。このプロトコルは、ペプチドレベルPTM濃縮を複数の結合抗体で利用し、続いてデータ非依存の獲得質量分析を行い、PTMクロストークに関する生物学的洞察を得る。...

定量化とサイトローカリゼーションのための2つの翻訳後修飾の同時アフィニティエンリッチメント

Acyl-RAC(アシル-レジンアシストキャプチャ)は、様々な生物学的サンプル中のシステイン残基の可逆的脂質修飾(S-acylation)を検出する方法を非常に敏感で、信頼性が高く、実行しやすいです。...

アシル樹脂アシスト捕捉によるプロテインS-アシル化の検出

タンパク質アルギニン(R)-メチル化は、複数の生物学的経路を調節する広範な翻訳後修飾です。質量分析は、修飾ペプチド濃縮のための生化学的アプローチと組み合わせると、R-メチルプロテオームをグローバルにプロファイリングするための最良の技術です。ここでは、ヒト細胞における全体的なR-メチル化を高信頼で同定するために設計されたワークフローについて説明します。...

質量分析に基づくプロテオミクスアプローチによるグローバルで信頼性の高いタンパク質R-メチル化分析

学ぶ、データ非依存的質量分析法を用いたタンパク質のアセチル化とサクシニル化の部位特異的化学量論定量法。この手法は複数のリジン残基を持つペプチドからも正確な修飾率を測定でき、可逆的タンパク質制御の研究に有用です。

部位特異的タンパク質のリジンのアセチル化のサクシニル化化学量論組成データに依存しない取得質量分析法による定量

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