部位特異的タンパク質のリジンのアセチル化のサクシニル化化学量論組成データに依存しない取得質量分析法による定量
2018年4月4日
部位特異的タンパク質アセチル化および/またはサクシニル化入居 (化学量論) 内因性変更後導入された変更のレシオ メトリック分析を通して全体の proteome の公平な定量化を紹介ここでは、定量的化学のアシル化の安定同位体標識無水物を使用しています。機密性の高いデータに依存しない取得質量分析法と組み合わせて、正確なサイト占有率測定が得られます。
この新しいワークフローの全体的な目標は、特定のアセチル化部位におけるタンパク質の翻訳後修飾の占有率または化学量論を決定することです。この新しい質量分析ワークフローにより、より高いレベルの定量精度が得られます。この方法は、リジンアセチル化やサクシニル化部位など、翻訳後修飾による可逆的タンパク質制御に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。部位は最も高度に修飾され、タンパク質機能を変化させる可能性があります。この手法の主な利点は、リジンアセチル化、サクシニル化、およびスクシニル化の部位レベルの化学量論が正確に測定され、この方法が複数のリジン残基を持つペプチドから化学量論を決定できることです。この手法は、無次元の相対的な存在量の変化を測定する代わりに、アセチル化とサクシニル化の化学量論、または修正されたものと変更されていないものの割合を明らかにするため、非常に関連性があります。私が最初にこの方法を思いついたのは、データに依存しない取得とMS2ベースの定量化を化学量論解析に使用すると、測定精度が大幅に向上することに気付いたときでした。100回の反復を3回準備します
概要
本研究では、タンパク質の翻訳後修飾、特にアセチル化およびスクシニル化を定量するための新しい質量分析ワークフローを提示します。本手法は、これらの修飾の部位特異的な占有率（ストイキオメトリー）を決定することにより、測定精度を向上させます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 生化学
- 質量分析
- プロテオミクス
背景
- 翻訳後修飾はタンパク質の機能において重要な役割を果たします。
- アセチル化とコハク酸化を理解することは、可逆的なタンパク質調節を研究する上で不可欠です。
- 従来の手法では、これらの修飾を定量化する際の精度が不十分な場合があります。
- 本研究は、化学量論的測定の精度を向上させることを目的としています。
研究目的
- タンパク質のアセチル化およびコハク酸化を正確に定量するためのワークフローを構築する。
- どのリシン部位が最も修飾されており、それがタンパク質機能にどのような影響を与えるかを特定する。
- 複数のリシン残基を持つペプチドを分析できる手法を提供する。
使用した手法
- 内因性修飾のレシオメトリック解析。
- 安定同位体標識酸無水物を用いた定量的化学アシル化。
- データ非依存的解析（DIA）質量分析。
- 精度向上のための複数回反復サンプルの調製。
主な結果
- この手法により、部位レベルの化学量論的な比率を精密に決定することが可能です。
- 修飾されたリシン残基と修飾されていないリシン残基の割合を明らかにします。
- 従来の手法と比較して、測定精度が高くなっています。
- タンパク質機能に影響を与える主要なアセチル化およびコハク酸基化部位を特定します。
結論
- このワークフローにより、タンパク質修飾の定量化が大幅に向上します。
- アセチル化およびスクシニル化によるタンパク質機能の調節に関する知見が得られます。
- この手法は、幅広いプロテオーム解析研究に適用可能です。
よくある質問
産業界における重要性
部位特異的なリシンアセチル化およびコハク酸化した化学量論を正確に定量することで、翻訳後修飾の占有率を精密に評価でき、これは薬物標的経路における可逆的なタンパク質調節を理解する上で極めて重要です。本手法は、プロテオーム全体にわたる修飾レベルの不偏的な測定を可能にし、生物学的に関連のあるアシル化部位をバックグラウンドノイズから区別することで、標的のバリデーションを支援します。相対的な量的な変化ではなく化学量論的なデータを提供することで、初期探索段階におけるメカニズム的なリスク低減における予測の信頼性を高めます。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 特定のリシン残基におけるアセチル化およびスクシニル化の占有率を定量化することで、治療仮説の検証を可能にします。
- 運用上の価値： 修飾の化学量論的な測定により、タンパク質活性への機能的な影響を明確にし、生物学的なリスク低減を支援します。
- 予測的価値： どの修飾部位が機能を変える可能性が最も高いかを特定することで、ターゲットへの信頼性を向上させ、ポートフォリオの優先順位付けを支援します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイ準備状況：部位レベルのアシル化占有率データを提供することで、ダウンストリームワークフローに向けたバリデート済み生物学的システムを準備します。
- 定量出力：DIA-MSからのフラグメントイオンピーク面積を利用し、アッセイ標準化に適した、干渉を低減した正確な定量を実現します。
- 拡張性：アセチル化およびスクシニル化の再現可能でマルチプレックス対応のプロテオーム解析を通じて、スクリーニング準備を促進します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：疾患に関連するアシル化部位を特定することにより、探索フェーズの修飾プロファイリングを前臨床検証へと結びつけます。
- メカニズムによるリスク低減：複数のリシン残基を持つペプチドから化学量論を決定することで予測価値に焦点を当て、部位特異的な解像度を可能にします。
- リスク調整後の進展：どのリシン修飾が機能的に重要であり、どれが確率的なものであるかを明らかにすることで、go/no-go判断を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、初期のターゲットバリデーションからリード化合物の同定に至る創薬の連続的なプロセスに統合されており、タンパク質機能に対する化合物およびメカニズムの理解に寄与する、定量的（化学量論的）なアセチル化およびスクシニル化データを提供します。
- 探索生物学：摂動に応じた部位特異的な修飾占有率を定量化することで、仮説検証およびパスウェイの解明をサポートします。
- スクリーニング：プロテオームサンプル全体の修飾レベルを標準化された定量測定により評価することで、アッセイへの移行を可能にします。
- 分析：DIA-MSフラグメントイオン定量による精密な化学量論測定を提供し、修飾状態の正確な比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：バイオマーカーまたはメカニズムのリードアウトとなり得る高占有率のアシル化部位を特定することで、前臨床試験への継続性を構築します。
- エンタープライズ再利用：プロジェクトやターゲットクラスを横断して一貫したPTMプロファイリングを行うための、再利用可能なプロテオーム解析機能として機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： アセチル化およびスクシニル化の正確な部位レベルの化学量論により予測の信頼性を提供し、ターゲットバリデーションにおけるメカニズム的な曖昧さを低減する。
- 運用的価値： DIA-MSおよびSkylineベースの定量化を通じて標準化と再現性を確保し、技術的なばらつきを最小限に抑える。
- 戦略的価値： 占有率が高く機能的に重要な修飾部位を特定することで、go/no-go判断を改善し、後期の生物学的リスクを低減する。
- ポートフォリオへの影響： 修飾主導の機能的根拠に基づいた、リスク調整済みのターゲット優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 質量分析ベースのプロテオミクスおよびPTM濃縮技術に関する専門知識が必要です。
- 正確なフラグメントイオン定量のためには、DIA対応の装置およびスペクトルライブラリの構築への依存があります。
- 再現性を確保するため、サンプル調製および化学的アシル化プロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 本ワークフローを多様なモデルシステムや組織タイプに適用する場合、最適化の検討が必要となります。
- 複雑な混合物におけるペプチドの検出能およびリシン残基のアクセシビリティに関連する実用上の制限があります。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:04
Title
1:18
Quantitatively Acetylate and/or Succinylate Proteins Using Isotope-labeled Acetic or Succinic Anhydride
3:48
Digest Reacted Protein Samples Using Glu-C Endoproteinase
6:27
Fractionate Peptides Using Offline Basic-pH Reversed Phase HPLC
8:15
Example Data Analysis Tutorial
10:28
Results: Succinylation Stoichiometry Ratio Calculation of Pre-succinylated BSA
11:13
Conclusion
