Name: Pax7 とラミニン抗体抗体法による骨格筋衛星細胞の同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 学ぶPax7とラミニン抗体を用いた免疫蛍光法による骨格筋衛星細胞の同定法。生理的環境で筋肉幹細胞を可視化し、筋再生や疾患研究への応用が可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIAMS 光イメージング セクション顕微鏡と技術的なサポートを提供するために感謝いたします。MF20 Pax7 抗体は、発育の後援の下で開発され、アイオワの大学、生物科学専攻、アイオワ シティで維持発達研究ハイブリドーマの銀行から得られました。この作品は、国立衛生研究所の NIAMS の学内研究プログラムによって支えられました。

このプロトコルではアダルト マウス (2-6 ヶ月)、脛骨前方 (TA) と長趾伸筋 (EDL) の前後肢の筋肉は、SCs の染色蛍光を実行する例として用いられました。マウスおよび筋肉の処理手順をすべて組織解剖は、動物の世話、NIAMS/NIH の使用委員会 (ACUC) によって承認されています。
1. マウスの後肢から TA/EDL 筋を解剖します。
<ol><li>NIH の ACUC のガイドラインの下で CO2充填安楽死室でマウスを安楽死させます。必要な場合は、頚部転位を実行します。</li>
	<li>マウスの顔アップを郭清パッド (仰臥位) に置きます。その腹の皮の上に 70% エタノールをスプレーします。マウスの腹皮の中央に水平方向に開く 1 ~ 2 cm をカットし、マウス フィートに向かって開口部を引っ張って、マウスを deskin します。マウスの後肢の片側を公開します。</li>
	<li>2 つのシャープな鉗子を使用: TA/EDL を付ける、足首の腱を保持するために 1 つを使用し、破るし、TA/EDL を覆う筋膜をせん断する他の 1 つを使用します。筋膜を剥離鉗子の先端の鋭利な TA/EDL 筋の下にあるヒントを実行して、脛骨骨から TA/EDL をデタッチするのに使用します。</li>
	<li>まだそれらを生検鉗子で保持しながら足首の腱をハサミでカットします。足首から膝までの TA/EDL の縦の線に沿ってハサミ鉗子足首側から TA/EDL を持ち上げながら筋肉をトリムします。脛骨から全体の TA/EDL をデタッチする膝側の腱を切った。</li>
</ol>2. TA/EDL 筋の低温埋め込み
<ol><li>液体窒素容器、例えばお風呂の準備します。、液体窒素デュワー フラスコ。Methylbutane を半分に小さなプラスチック ビーカー (約 20 mL) に注ぐ。それを凍結する液体窒素風呂でビーカーを置きます。数分後、methylbutane が固定されることを確認します。 注: 液体窒素、ドライアイスのバケツによって置き換えることができますが、凍結時間は遅くなります。</li>
	<li>小さなプラスチック製のシリンジのプランジャーの平らな表面に切り裂かれた TA/EDL を横たわっていた。数滴の最適な切削温度 (O.C.T.) 化合物 (凍結中) TA/EDL を完全にカバーします。</li>
	<li>液体窒素風呂から methylbutane ビーカーを取るし、温かみのあるオブジェクトで表面を解凍 (e.g。、はさみのハンドル)。すぐにディップ、O.C.T. はプランジャー TA/EDL をスナップ凍結組織を溶かし methylbutane に覆われて。</li>
	<li>鉗子、プランジャーから埋め込まれた組織を外し、1.5 mL 遠心チューブに入れてください。多くのサンプルを処理しながら保存する液体窒素にチューブを配置します。 注: 埋め込み組織は-80 ° C の長期 (2 年) または-20 ° C で短期 (6 ヶ月) に格納できます。</li>
</ol>3. クライオスタット切片
<ol><li>クライオスタットの試料ホルダーの中心に化合物 O.C.T. のドロップを追加します。O.C.T. 化合物はほぼ固化するまでを待ちます。O.C.T. 化合物、足首側に垂直に埋め込まれた TA/EDL をすばやくスティック ダウンと膝側を。</li>
	<li>クライオスタットに試料ホルダーをマウント、10 μ m 間隔で組織をカット、低温セクションに、フロスト コーティング スライドと収集 1 つのスライド上の 4-8 のセクション。</li>
	<li>一夜にして、少なくとも 3 時間室温でセクションを乾燥させます。 注: 乾燥一晩以上冷凍庫のセクションは問題ありませんが、それは必然的に増やすこと、蛍光。最高の結果を得るには、乾燥 0.5 h のセクション進みます固定や染色の手順ですぐに。</li>
	<li>スライド ボックスのスライドを収集し、すぐにそれらを使用または-80 ° C または-20 ° C 保存用のスライドを保存します。</li>
</ol>4. 蛍光染色試薬の調製
<ol><li>
次のバッファーを準備します。
	<ol>
<li>10 x PBS からのリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 2 L を準備します。</li>
		<li>16% から 1 × PBS で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 40 mL を準備 PFA。</li>
		<li>PBST の 2 L を準備: 0.1% トリトン-100 と 1 × PBS。</li>
		<li>2% ウシ血清アルブミン (BSA) と pbst; b: PBST の 50 mL を準備します。</li>
		<li>2 %bsa と 5% 通常ヤギ血清 pbst; B-g: PBST の 10 mL を準備します。</li>
		<li>ブロッキング溶液 1 mL を準備します。希釈 AffiniPure Fab フラグメント ヤギ抗マウスは IgG pbst; b (H + L) (1:10)</li>
		<li>200 mL の 1x クエン酸バッファーを準備します。 注: ソリューション上記のボリュームは、少なくとも 5 つのスライドに対して十分です。ボリュームは、スライドの数およびスライド容器のサイズに合わせて調整する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
抗体は汚れるを準備します。
	<ol>
<li>一次抗体 (作業濃度): Pax7 マウスのモノクローナル抗体 (IgG1) を希釈して一次抗体ミックス 1.2 mL を準備 (1 ~ 5 μ g/mL) + ラミニン ポリクローナルウサギ (0.5-2 μ G/ml) MF20 マウスのモノクローナル抗体 (IgG2b) + (0.5 2.5 μ g/mL) pbst; B g 注: MF20 マウスのモノクローナル抗体 (IgG2b) はオプションです。</li>
		<li>二次抗体 (作業濃度): ヤギ抗マウス IgG1 クロス吸着二次抗体、Alexa Fluor 488 希釈することによって二次抗体ミックス 1.2 mL を準備 (0.5-2 μ g/mL) + 二次抗体高いクロス吸着ヤギ抗うさぎ IgG (H + L)、Alexa Fluor プラス 555 (0.5-2 μ g/mL) + ヤギ抗マウス IgG2bクロス吸着二次抗体、Alexa Fluor 647 (0.5-2 μ G/ml) pbst; B g 注: Alexa Fluor 647 はオプションです。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 蛍光染色手順
<ol><li>
水分補給、PFA と低温セクションを修正します。
	<ol>
<li>スライド ボックスから TA/EDL クライオ セクション スライドのいくつかを削除します。暖かい室温でスライドを保持トレイにスライド。</li>
		<li>低温 - のすべてのセクション スライドにはが含まれている領域を描画するのに液体ブロッカー ペン (PAP ペン) を使用します。このサークルでは、ソリューションがスライドを離れて流れることをできなくなります。</li>
		<li>研究室の発煙のフードにトレイを取る。4% の 300-500 μ L を追加 10 分 1 × PBS で PFA を洗って室温でセクションを修正する囲まれた領域内のスライドに PFA スライド コンテナーに少なくとも 3 x 5 分。 注意: PFA は毒性と有害廃棄物;ケアと運営し、有害廃棄物容器に廃棄する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
抗原検索
	<ol>
<li>別のスライドのコンテナーを 200 mL のクエン酸バッファーに入力します。</li>
		<li>コンテナーにスライドをコピーします。スライドのコンテナーを 10 分間の高圧モードでスライドを調理する圧力鍋に転送します。</li>
		<li>排水の水で 10 分間転送 PBST (200 mL) を新しいコンテナーにすべてのスライドを持つコンテナーを冷やす、PBST と少なくとも 3 x 5 分用のスライドをすすいでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ブロック
	<ol>
<li>トレイ スライドの乾燥を避けるために湿った環境を作成するスライドを保持する水に浸したキムワイプを追加します。</li>
		<li>トレイにスライドを戻すし、ブロック各スライドに液 200 μ L を追加します。カバー キャップ付きトレイと 30 分間開発ブロックを聞かせてください。 注: マウスの筋肉組織に高いバック グラウンドを作成するマウス IgG の不明確な結合があるので、Pax7 抗体はマウスのモノクローナル抗体です。マウスの非特異的結合をブロック、AffiniPure Fab フラグメント ヤギ抗マウス IgG (H + L) を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
一次抗体を適用します。
	<ol>
<li>スライドのコンテナーに一度 PBST とスライドをすすいでください。その後に移動するスライド染色トレイ。</li>
		<li>各スライド上の一次抗体ミックス 200 μ L を適用、キャップ、トレイをカバーし、反応室温 1 時間または一晩のための 4 ° C で開発を聞かせてください。 注: 4 ° C で一晩反応は満足のいく結果を与えるが室温で反応の開発に最高の結果を与えます。ミオシン MF20 抗体は、トリプル (Pax7、ラミニン、MF20) ラベルを実行するためにミックスに追加できます。MF20 汚れには、筋線維が区別されます。この手順は、二次抗体 (ヤギ抗体) 次の手順でから潜在的な非特異的結合を抑える pbst; B g ブロック一歩としても使用されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
二次抗体を適用します。
	<ol>
<li>常温 PBST と一次抗体を洗浄、少なくとも 3 x 5 分。</li>
		<li>各スライドに二次抗体ミックス 200 μ L を追加し、少なくとも 1 時間室温で開発する反応します。 注: Pax7 + ラミニン ヤギ抗マウス IgG1 アレクサ 488 とヤギ抗うさぎ Alexa 555 を使用します。 Pax7 + ラミニン + MF20 ミックスでヤギ抗マウス IgG2b Alexa 647 を追加します。</li>
		<li>PBST と二次抗体を洗浄、少なくとも 3 x 5 分。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) カウンターの汚れと取り付け
	<ol>
<li>スライド コンテナーなど、DAPI pbst; 200 mL に 10 μ L の PBST の DAPI (1:20, 000) を希釈します。</li>
		<li>3 分の DAPI コンテナー内のスライドを染色します。</li>
		<li>少なくとも 5 x 5 分 PBST の DAPI を洗い流します。</li>
		<li>メディアをマウントをスライドをマウントします。Coverslips にスライドをカバーします。 注意: DAPI は有害です。取り扱いし、廃棄ボトルで破棄する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 蛍光顕微鏡
注: 上記の報告蛍光汚損のプロトコルと可能にする SCs 可視化ワイド フィールドまたは共焦点蛍光顕微鏡のいずれか。SCs を識別するために最初に困難なことがあります。助けになることがありますいくつかの推奨される手順を示します。
<ol><li>DAPI チャネルと低倍率の目的を使用して、スライドのセクションを視覚化します。</li>
	<li>高から低倍率を切り替えます。SCs を観察するには、少なくとも 20 の X 目的が必要) です。</li>
	<li>488 (FITC) 用デュアル フィルター キューブ/555 SCs を識別するために同時に信号を (ローダミン) Pax7 とラミニンを観察します。この設定は、Pax7 染色の信号はバック グラウンド ノイズに優れたコントラストを持ちます。</li>
	<li>すぐに別の SCs を正しく識別するために DAPI を FITC からチャネル。すべての Sc は、Pax7/DAPI 陽性をする必要があります。</li>
</ol>

<ol><li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+and+cell+lineages+that+underlie+the+formation+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).</li>
<li>Buckingham, M., Relaix, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX3+and+PAX7+as+upstream+regulators+of+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis.</a> Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).</li>
<li>Relaix, F., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+insect+eye+to+vertebrate+muscle%3A+redeployment+of+a+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network.</a> Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).</li>
<li>Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+Cells+in+Muscular+Dystrophy+-+Lost+in+Polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Satellite Cells in Muscular Dystrophy - Lost in Polarity.</a> Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).</li>
<li>Kuang, S., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+biology+of+satellite+cells+and+their+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential.</a> Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).</li>
<li>Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+the+engines+of+muscle+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, the engines of muscle repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).</li>
<li>Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%3A+therapeutic+potential+and+roadblocks%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks.</a> Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).</li>
<li>Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+satellite+cells+and+adult+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).</li>
<li>Giordani, L., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+of+skeletal+muscle+regeneration%3A+Integrating+genetic+determinants+and+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes.</a> FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+acts+directly+on+the+zebrafish+dermomyotome+to+promote+myogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation.</a> Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).</li>
<li>Juan, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+EZH2+controls+self-renewal+and+safeguards+the+transcriptional+identity+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells.</a> Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).</li>
<li>Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+fiber-specific+green+autofluorescence%3A+potential+for+stem+cell+engraftment+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts.</a> Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).</li>
<li>Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+satellite+cells+and+embryonic+muscle+progenitors+have+distinct+genetic+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements.</a> Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

上記のプロトコルは、ゼブラフィッシュ骨格筋12Pax7/MF20 染色法に基づいていた。ソリューションの使用手順をブロックが同じまたは類似しました。使用抗体は同一です。調整手順は、マウスの筋肉組織と SCs の機能に基づいていた。まず、ラミニン抗体は、視覚化し、SCs の位置を確認するためにミックスに追加されました。それは 488/555; のデュアル フィルター キューブを使用して顕微鏡下で Sc の数をカウントする特に有用だったこれは、騒々しいされる背景から目立つように SC 派生 Pax7 信号を大幅に強化。第二に、使用 Pax7 抗体はマウス抗体なので、マウス igg 抗体の非特異的結合から生じる背景を減らすためにマウスでブロック ステップ (ステップ 5.3) を追加しました。第三に、抗原検索ステップ (ステップ 5.2) は固定ティッシュ PFA Pax7 抗体の汚損のために批判的であった。
(子犬と胚) 若いマウスの筋肉組織で使用された同じプロトコル (図 2)...

骨格筋は多核巨細胞の筋肉細胞から成るであると呼ばれる、力および収縮運動を生成する筋線維で構成されています。いくつかの顔面の筋肉を除いて、最も骨格筋は、体節1と呼ばれる一時的な萌芽期の構造から派生します。筋芽細胞になる上皮体節から筋前駆細胞が剥離されます。さらに筋芽細胞は多核筋線維を形成する細胞になる融合細胞に分化します。上記のプロセス筋形成と遺伝子発現の制御を一時的に規制されているが特徴です。筋原性前駆体は筋芽細胞表現 MyoD および/または Myf5 と心筋細胞表現する myogenin とミオシンの2,3に対し Pax3 と Pax7 を表現します。筋肉の成長は、既存のファイバー (過形成) により筋核を組み込むことによって、筋線維 (肥大) のサイズ4の増加によってに筋線維が大きくなるプロセスです。筋肉の成長の間に、彼らは区別し、自己更新できる幹細胞プロパティを持つ筋細胞の持続可能なソースです。これらの細胞は筋鞘 (筋線維の細胞膜) と基底膜5の間の物理的な場所に基づく衛星細胞と呼ばれます。SCs は、精力的に幼若期 (生後マウスの最初の 2-3 週間) 筋肉の成長に貢献するが、大人の筋6を安静時の休止状態になります。驚くことに、筋肉への応答で再アクティブ化できます傷つけるし、7損傷した筋肉を修復する新しい筋肉細胞に分化します。
茎セルのプロパティは、基本的な筋生物学、筋疾患8の治療に関連する SCs の研究を行います。その結果、過去数十年で強烈な調査の領域だった。途方もない進歩は、遺伝学および SCs9,10のエピジェネティクスを切り裂くことにしました。分離するとその場でSCs を識別する技術を開発し、11の方法に沿って最適化します。免疫蛍光染色は、Pax7 を含む特定の抗体を使用して SCs を識別できます。しかし、希少性と大人の骨格筋組織の強い自己蛍光と組み合わせて SCs の小型レンダリング視覚化挑戦。ここでは、蛍光染色プロトコル Pax7 のマウスの筋肉組織の最適化し、ゼブラフィッシュ筋12既存法に基づくについて述べる。さらに、SCs が下である基底膜を識別するために異なる蛍光ラベルの付いたラミニン抗体を採用します。このプロトコルは、一貫して Pax7 正 SCs と発達段階とすべてのテストの生理学的な条件の下で筋前駆体の可視化をできます。

<table><tbody><tr><td>メチルブタン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>最適切断温度 (O.C.T.) 化合物</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>62550-01</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco, Themo Fisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>16% PFA</td><td>TED PELLA</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Triton-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>サーモフィッシャー</td><td>0 1-6201</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab フラグメント ヤギ抗マウス IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-007-003</td><td></td></tr><tr><td>20x Citrate Buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>00 500</td><td></td></tr><tr><td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (superkinant)</td><td>Developmental Study Hybridoma Bank</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Laminin polyclonal rabbit antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (superkitant)</td><td>Developmental Study ハイブリドーマBank</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG1交差吸収二次抗体, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG2b交差吸収二次抗体, Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21242</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG(H+L) 高交差吸着二次抗体, Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>ライカCM1860 クライオスタット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカDM6000広視野蛍光顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカDMR広視野蛍光顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ツァイスLSM510共焦点顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ツァイスLSM780共焦点顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クイジナート電子圧力鍋</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pax7 とラミニン抗体抗体法による骨格筋衛星細胞の同定

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

蛍光抗体法は、異なる細胞ティッシュ セクションの種類を識別するため効果的な方法です。目的のセル人口を研究するために特定のセル マーカーの抗体はティッシュ セクションに適用されます。大人の骨格筋衛星細胞 (SCs)、筋肉の修復と再生に貢献する幹細胞です。したがって、視覚化し、異なる生理学的な条件の下で衛星細胞集団を追跡することが重要です。安静時骨格筋の SCs は基底膜と筋線維膜の間に存在します。筋線維、細胞培養、SCs を識別するために一般的に使用されるマーカーは、ペアになっているボックス タンパク質 Pax7 です。この記事では、非特定の染色と背景を最小限に抑える骨格筋のセクションに最適化された Pax7 蛍光プロトコルが表示されます。基底膜のタンパク質 (ラミニン) を認識する別の抗体はまた SCs 同じようなプロトコルを識別するのに役立つダブルまたはトリプル Pax7 興味の他の蛋白質のための抗体とラベル付けを実行するも使用ことができますを追加しました。

上記の手順に従って、SCs は、蛍光顕微鏡 (図 1) 成人の安静時筋セクションで正常に視覚化できます。大人の筋組織は強い自己蛍光が繊維の特定のタイプで、明るいアレクサ シリーズ染料がバック グラウンド ノイズを克服できるし、際立っている信号 (図 1 a, B; 矢印)。二光子励起共焦点顕微鏡は、広視野蛍光顕微鏡 (図 1 a) よりも比較的クリーンなイメージ (図 1 b) をキャプチャします。同じプロトコルはまた少年マウス (図 2 a)、マウス胚 (図 2 b) の筋肉組織で十分に働きました、大人の筋組織 (図 3) ...

衛星細胞の正確な同定は様々 な生理学的、病理学的条件の下でその機能を研究するために不可欠です。この記事では、蛍光抗体法による染色による大人の骨格筋のセクションの衛星細胞を識別するためにプロトコルを示します。

Pax7 とラミニン抗体抗体法による骨格筋衛星細胞の同定

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

このプロトコルの全体的な目標は、免疫蛍光法によって成体の骨格筋サテライト細胞を同定することです。この方法は、生理学的および病理学的条件の両方で、筋幹細胞の数と分布に関連する重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、限られた操作だけで生理学的環境内の筋幹細胞を同定できることです。その手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるFaiza Nazです。まず、デュワーフラスコに液体窒素を注いで液体窒素浴を準備します。次に、10ミリリットルのメチルブタンを20ミリリットルのプラスチックビーカーに注ぎ、ビーカーを液体窒素浴に移します。解剖した前脛骨筋を小さなプラスチック製シリンジプランジャーの平らな面に置きます。次に、解剖した筋肉を数滴の最適切断温度化合物またはOCTで覆い、液体窒素浴からメチルブタンのビーカーを取り外し、はさみのハンドルを使用して表面を解凍します。O.C.T.で覆われた組織を溶かしたメチルブタンにすばやく浸して、スナップフリーズします。次に、鉗子を使用して埋め込まれた組織をプランジャーから取り外し、1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。次に、微量遠心チューブを液体窒素に保管します。クライオスタット切片作製を開始するには、クライオスタットの試料ホルダーの中央にO.C.T.化合物を一滴加え、部分的に固化させます。次に、埋め込まれた組織を足首を下にして膝を上にしてO.C.T.コンパウンドに貼り付けます。次に、試料ホルダーをクライオスタットに取り付け、10マイクロメートル間隔で組織を切断します。霜でコーティングされた各スライドに4〜8個の凍結切片を収集します。切片を室温で3時間乾燥させた後、スライドボックスにまとめてマイナス80°Cで保管します。次に、スライドボックスからスライドを取り出し、室温まで温めます。次に、液体ブロッカーペンを使用してクライオセクションの周囲に印を付け、液体が側面から流れ落ちるのを防ぎます。ドラフトで、マークされた領域に300〜500マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを追加します。スライドを室温で10分間インキュベートし、切片を固定します。次に、スライド容器内のPBSでスライドからパラホルムアルデヒドをすすぎます。抗原賦活化を開始するには、スライド容器に200ミリリットルのクエン酸緩衝液を充填し、スライドを容器に移します。次に、スライド容器を高圧の圧力鍋に10分間移します。抗原賦活化ステップは、切片を室温で30分間乾燥させ、すぐに進める場合、オプションです。そうすれば、抗原賦活化のステップは不要です。しかし、切片を室温で3時間以上乾燥させた後、マイナス80°Cで保存する場合は、抗原賦活化ステップが必要になります。次に、スライドコンテナを流水で10分間冷却します。次に、スライドを200ミリリットルのPBSTが入った新しい容器に移し、PBSTですすいでください。水に浸したラボ用ワイプをトレイに追加し、すすぎたスライドにPAPペンで注釈を付けてトレイに置きます。スライドに200マイクロリットルのブロッキング溶液を追加します。次に、トレイを覆い、室温で30分間インキュベートします。使用されているPax7抗体はマウスモノクローナル抗体であるため、ブロッキングステップは非常に重要です。マウス・オン・マウスのブロッキング・ステップにより、不特定のバインディングが削減されます。次に、スライドコンテナ内のPBSTでスライドをすすぎ、トレイに戻します。200 μLの一次抗体ミックスをスライドに加え、室温で1時間インキュベートします。次に、スライドをPBSTですすぎ、200 μLの二次抗体ミックスを加え、室温で1時間暗所でインキュベートします。インキュベーション期間後、スライドをPBSTですすいでください。DAPIをスライドコンテナで希釈し、スライドをコンテナ内で3分間インキュベートします。次に、DAPIをPBSTで5分間すすぎます。最後に、封入剤でスライドをマウントし、カバースリップを貼ります。この研究では、蛍光顕微鏡下で成体の安静時筋切片で衛星細胞をうまく視覚化しました。通常、成人の筋肉組織や特定の種類の繊維に見られるバックグラウンドノイズは、マウスオンマウスブロッキングを使用することで低減されます。特異的な免疫染色シグナルは、明るいAlexa色素と結合した二次抗体を使用することで増強されます。2光子共焦点顕微鏡は、広視野蛍光顕微鏡と比較してより鮮明な画像をキャプチャします。同じプロトコルは、幼若マウス、マウス胚、および損傷した成体筋肉組織由来の筋肉組織にも適用できます。若年筋組織と胚筋組織の両方が、より活性化された衛星細胞または比較的大きな核を持つPax7筋原性前駆体を示しています。これにより、成体マウスよりも若年マウスの衛星細胞を可視化しやすくなります。損傷した筋肉組織では、より活性化されたPax7陽性細胞が見られます。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば5時間で完了します。この手順を試行する際には、自家蛍光および非特異的なマウスオンマウス免疫結合から生じるノイズを完全に除去することはできないことを覚えておくことが重要ですが、このプロトコルではノイズを大幅に低減できます。このビデオを見れば、筋肉凍結切片のサテライト細胞を同定する方法を十分に理解できるはずです。

identification-skeletal-muscle-satellite-cells-immunofluorescence

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

筋線維の単離および培養は、ゴールドスタンダードである...

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

静止衛星細胞の純粋な集団の単離および培養、筋肉幹細胞集団は、筋肉幹細胞生物学および再生、ならびに筋ジストロフィーおよび他の変性疾患における治療のための幹細胞移植の理解に不可欠である。...

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

体外培養系では 、脊椎動物の筋形成の理解に不可欠であることが分かっている。しかし、多くの、特に基底の分類群において、非哺乳動物の骨格筋の発達と成長について学んだことを残る。この組織を、筋原性前駆細胞（MPCは）の成体幹細胞を単離すること、及び初代培養の設定におけるそれらの自己再生、増殖、および分化を維持するための効率的かつ堅牢なプロトコルは、全体にわたって保存された発散の調節機構の同定を可能脊椎動物の系統。...

基礎脊椎動物の系統からの一次筋原前駆細胞/筋芽細胞培養液の調製

ヒトの筋肉に由来する主な接着細胞タイプは、筋原性細胞と線維芽細胞です。ここでは、CD56抗原に基づく磁気活性化細胞ソーティングを用いて細胞集団を濃縮します。その後、特異的抗体による免疫標識と画像解析技術の使用により、個々の細胞の細胞質および核特性を定量化できます。...

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

このプロトコルは、9週齢のラットのbranchiomeric頭筋からの衛星細胞の単離を記載しています。筋肉は異なる鰓弓に由来します。次いで、衛星細胞は、それらの分化を研究するためのミリメートルサイズのスポットコーティング上で培養されます。このアプローチは、衛星細胞の増殖および継代を避けることができます。...

ラットヘッドBranchiomeric筋肉から衛星細胞の単離とキャラクタリゼーション

アクティブなオートファジーは、筋肉幹細胞（MuSC）の活性化に不可欠な、筋肉の再生を促進します。ここでは、コントロールマウスおよび損傷マウスからの筋組織切片のMyoD陽性MuSCにおける自食作用マーカーであるLC3のin situ検出のためのプロトコールを提供する。...

筋幹細胞におけるオートファジーのin situ Immunofluorescent Staining

骨格筋のカルタトキシン媒介損傷と自己送出型siRNAの注射を組み合わせて、衛星細胞における特定の遺伝子の機能的損失を調べるためのインビボ法について述べた。...

カーディオトキシン損傷による骨格筋再生中の衛星細胞機能の解析と生体内での自己送出型siRNAの注射

ここでは、出生後初期の発達段階で単一の筋線維を効率的に得る方法を、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー(EDMD)の非常に重篤なモデルであるホモジューザイゴウス変異体ラミンΔ8-11マウスモデルから提案する。...

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

このプロトコルでは、筋肉幹細胞のインビトロ培養および機能解析方法が記載されており、内因性ニッチとの相互作用のほとんどを維持する。...

成人筋幹細胞機能評価のための単一筋繊維培養アッセイ Ex Vivo

骨格筋は、常在幹細胞を含む複数の細胞タイプで構成されており、それぞれが筋肉の恒常性と再生に特別な貢献をしています。ここでは、生理学的、in vivo、および環境的特性の多くを保持するex...

マウス骨格筋の未分画バルク培養によるニッチおよび幹細胞の静止を再現

このプロトコルは、組織解離、逐次ろ過、プレプレート処理、定義された培養条件を通じて、成体および新生マウスの骨格筋から一次筋芽細胞を単離・濃集する標準化された方法を提供し、衛星細胞由来の筋肉芽細胞培養の確立と維持を可能にし、下流の実験応用を可能にします。...

In vitro 筋形成研究のための骨格筋サテライト細胞の単離

学ぶPax7とラミニン抗体を用いた免疫蛍光法による骨格筋衛星細胞の同定法。生理的環境で筋肉幹細胞を可視化し、筋再生や疾患研究への応用が可能です。

Pax7 とラミニン抗体抗体法による骨格筋衛星細胞の同定

さらに動画を探す