特定病原体緑化シトラスカンキツグリーニング病病原細菌属カンキツ葉組織サンプルで使用した従来の PCR の正確な検出
2018年6月29日
カンキツグリーニングは柑橘類の作物に影響を与える世界的に特に破壊的な病気です。ここで紹介は単純なメソッドを使用して PCR およびカンキツ葉組織のゲノム DNA 抽出カンキツグリーニング病原体、カンキツグリーニング病病原細菌属の正確かつ正確な同定のため
この手順の全体的な目標は、柑橘類の葉組織中の柑橘類の緑化病原体Candidatus liberibacter spp.を正確に検出することです。この方法により、柑橘類の農家や研究者は、柑橘類の緑化の原因となる病原体の存在を迅速かつ正確に特定できます。
手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるIan Palmerです。この方法は、効率的で費用対効果が高く、定量分析に適応できます。さらに、最小限のレベルの実験室の経験と機器で実施することができます。
まず、きれいなハサミを使って柑橘類の木から新鮮な葉を丸ごと切り取り、きれいなプラスチックのサンドイッチバッグに入れます。次に、乳鉢と乳棒を冷やし、少量の液体窒素を加えます。次に、はさみを使用して、約1平方インチのサイズの葉組織の小片を切り取ります。
葉片を乳鉢に入れて、すぐに凍らせます。液体窒素が蒸発し、細かい緑色の粉末が残るまで、乳鉢で葉の組織をすばやく粉砕し始めます。次に、金属ヘラを液体窒素で10〜15秒間冷やします。
次に、冷たいヘラを使用して、1.5MLのマイクロ遠心チューブで乳鉢から粉砕された組織をすくい取ります。1000MLのピペットを使用して、600MLの核溶解溶液をサンプルに加えます。次に、サンプルを1〜3秒間ボルテックスします。
チューブを摂氏65度で、水浴中で15分間インキュベートします。インキュベーション期間が終了したら、10MLのピペットを使用して3MLのRNA溶液をライカテに追加し、RNAを除去します。次に、チューブの内容物を2〜5回反転させて混合します。
キャビネットインキュベーターで摂氏37度で15分間インキュベートします。15分後、200MLのタンパク質沈殿溶液をサンプルに加えます。チューブを高速で20秒間ボルテックスします。
次に、サンプルを13000Gで3分間遠心分離します。遠心分離の過程で、室温で維持された600MLのイソプロパノールを新しい1.5MLのマイクロ遠心チューブに加えます。遠心分離が終了したら、遠心分離チューブから上清を慎重に取り出し、イソプロパノールの入ったチューブに移します。
ペレットを捨てます。DNAが糸のような鎖のように見えるように、チューブを反転させます。次に、サンプルを13000Gで室温で1分間遠心分離します。
遠心分離後に上清をデカントします。次に、ペレットに600MLの70%エタノールを加えます。チューブを数回反転させてペレットを洗浄します。
チューブを13000Gで1分間遠心分離します。遠心分離が終わったら、上清を慎重に吸引します。次に、吸収紙の上で蓋を開けた状態でチューブを反転させ、15分間風乾します。
乾燥したら、ペレットに100MLのDNA再水和液を加えます。DNA懸濁液を摂氏65度で水浴中で1時間インキュベートします。ミキシング中に定期的にチューブを軽くたたきます。
マイクロキュベットに精製水1MLを加えます。分光光度計で水を空白として読み取ります。次に、マイクロキュベットに1MLのサンプルを追加します。
マイクロキュベットを分光光度計に置き、DNA濃度を求めます。すべての試薬と100ナノグラムのゲノムDNAを50MLのPCRチューブに追加してPCR反応を構成します。チューブを静かにフリックして試薬を混合し、その後、すばやく遠心分離します。
PCRチューブをサーモサイクラーに入れ、プログラムを実行します。アガロースゲルを調製するには、0.4グラムのアガロース粉末を秤量します。次に、アガロース粉末を200MLの三角フラスコに加え、1X TAEバッファーで容量を50MLに調整します。
アガロース混合物を強火で約1.5分間電子レンジで加熱します。アガロースが完全に溶解するまで30秒ごとに振とうします。次に、臭化エチジウム1ミリリットルあたり2.5ミリグラムの10ミリグラムを液体アガロースに加えます。
次に、フラスコを振って臭化エチジウムを混合し、液体アガロースゲルを水平なゲル型にすばやく注ぎます。すぐに標準の12歯ジェルコームを挿入します。ゲルを室温で約20分間冷ましてから、ゲルコームを取り外します。
次に、固化したゲルを1X TAEバッファーで満たされた電気泳動ユニットに入れます。増幅したDNAサンプルと5 MLのDNAを、後でゲル上の別々のウェルにロードします。電気泳動ユニットを一定の90ボルトで35分間始動します。
次に、電気泳動ユニットからゲルを取り出します。次に、ゲルをUVトランスイルミネーターの上に置きます。トランスイルミネーターのゲルバンディングパターンを302ナノメートルで撮影します。
グリーニング細菌を同定するために、感染したサンプルと非感染サンプルの両方から得られたPCR増幅ゲノムDNAを電気泳動します。ゲル中で500塩基対に対応するこれらのバンドは、CL asiaticas細菌におけるLas16SリボソームDNAの特定の領域の存在を示している。これらのバンドは700塩基対に対応するため、LAA2/LAJ5の存在を示しており、細菌の16SリボソームβオペロンDNA配列にインサートが存在します。
400塩基対のこれらの異なるバンドは、柑橘類のF-box遺伝子のみの増幅を示しており、これは内部増幅制御を指しています。結果が有効であると考えるには、このバンドの存在が必要です。それどころか、400塩基対にバンドしか存在せず、500塩基対と700塩基対に他のバンドがないことは、健康な柑橘類の組織を示しています。
このテクニックを習得すると、適切に実行すれば約4時間で完了します。この手順は、存在する病原体の量を検出するためのRTQPCRなど、より定量的な方法の実行を可能にするように適合させることができます。
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概要
本記事では、柑橘類の葉組織において柑橘類グリーニング病の病原体であるCandidatus liberibacter spp.を正確に検出する方法を紹介します。この手順ではPCRおよびゲノムDNA抽出を用いており、農家や研究者が迅速に同定することを可能にします。
研究の主要構成要素
科学分野
- 植物病理学
- ゲノミクス
- 農学
背景
- カンキツグリーニング病は、世界中のカンキツ作物に被害を与える破壊的な病害です。
- 原因となる病原体はCandidatus liberibacter spp.です。
- この病害の管理と軽減には、正確な検出が不可欠です。
- 本手法は、多様なユーザーにとって効率的かつ利用しやすいように設計されています。
研究の目的
- カンキツグリーニング病病原菌を検出するための信頼性の高い手法を提供すること。
- カンキツ農家による病原菌の存在確認を支援すること。
- カンキツグリーニング病の研究を促進すること。
使用された手法
- 病原体検出のためのPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）。
- 柑橘類葉組織からのゲノムDNA抽出。
- 最小限の実験経験と設備で実施可能。
- 費用対効果が高く、定量分析への適応が可能。
主な結果
- この手法により、病原体を迅速かつ正確に特定することが可能です。
- 大学院生のIan Palmerによって実演されています。
- ユーザーにとって効率的で信頼性が高いことが証明されています。
- 継続的な研究および農業実務を支援します。
結論
- この手法は、カンキツグリーニング病を検出するための有用なツールとなります。
- これにより、農家や研究者が病害を管理する能力が向上します。
- カンキツ作物の健康に関するさらなる研究を促進します。
よくある質問
産業界における重要性
Candidatus liberibacter spp.のような植物病原体を早期かつ特異的に検出することは、作物の損失を軽減し、農業サプライチェーンを保護するために極めて重要です。このPCRベースの手法により、葉組織中のカンキツグリーニング病病原体を迅速かつ費用対効果高く特定することが可能となり、適時な介入判断を支援します。拡張性のある診断ツールを提供することで、柑橘類生産企業の病害管理戦略における予測の信頼性を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：Las16SリボソームDNAおよびLAA2/LAJ5インサート配列の増幅により、Candidatus liberibacter spp.の特異的な検出を可能にし、植物病原体研究におけるターゲットバリデーションを支援します。
- 運用的価値：最小限の設備で実施可能な従来型のPCRを用いるため、カンキツ組織サンプルにおける病原体の存在を迅速にスクリーニングできます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 病原体検出のために500 bpおよび700 bpに明確なアンプリコンバンドを生成し、アッセイの妥当性を確保して偽陰性を減らすための400 bpの内部コントロール（柑橘類F-box遺伝子）を備えている。
- 運用的価値： RT-qPCRなどの定量分析への適応が可能であり、病原体量の測定およびサンプルセット間でのアッセイの標準化を実現する。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値： 症状が発現する前の柑橘類の葉組織から病原体を検出することで、疾患に関連する系のバリデーションを可能にし、宿主と病原体の相互作用に関する初期段階のメカニズム研究を促進します。
- 運用の価値： DNA抽出およびPCRプロトコルが標準化されているため、異なる研究室間での検出結果の再現が可能となり、農業バイオテクノロジーにおける機能横断的な共同研究を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は初期探索の段階に位置づけられ、植物病原体研究において、メカニズム解析やトランスレーショナル研究へと進む前の仮説検証および生物学的リスク低減を支援します。
- 基礎生物学研究：柑橘類の組織における病原体の存在を確認することで治療仮説の検証を可能にし、カンキツグリーニング病の生物学的根拠を明らかにします。
- スクリーニング：葉組織からアッセイに使用可能なゲノムDNAを提供し、再現性のある病原体検出およびスクリーニングへの定量的な適応を支援します。
- 分析：分光光度法による定量的なDNA濃度測定と、ゲル電気泳動による定性的な病原体検出を行い、感染サンプルと健全なサンプルの比較分析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：組織サンプルにおける早期の病原体検出を可能にすることで、発見から前臨床検証までの連続性を支援し、病害管理におけるリスク調整済みの推進決定に寄与します。
- 企業内での再利用：柑橘類病原体監視のための再利用可能な診断ワークフローを確立し、プロトコルの変更を最小限に抑えつつ、季節や地域を問わず適用可能にします。
運用および企業への影響
- 科学的価値：Candidatus liberibacter spp. の DNA ターゲットを特異的に増幅することで、病原体検出における予測信頼性を提供し、病因に関するメカニズム上の曖昧さを低減します。
- 運用上の価値：規定の DNA 抽出、PCR、およびゲル電気泳動の手順を通じて標準化と再現性を確保し、ユーザーや研究室間で一貫した結果を得ることを可能にします。
- 戦略的価値：感染植物を早期に特定することを可能にし、農作物管理における判断（go/no-go決定）を最適化することで、末期段階における生物学的および経済的リスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響：広範な作物被害が発生する前に病原体の存在を特定することで、リスク調整に基づいた病害軽減策の優先順位付けを促進します。
実施上の検討事項
- DNA抽出、PCR、およびゲル電気泳動技術に関する基本的な分子生物学的専門知識が必要です。
- 遠心分離機、サーモサイクラー、分光光度計、およびUVトランスイルミネーターを含む標準的な実験設備へのアクセスに依存します。
- 組織サンプル間での検出感度を一定にするため、サンプル調製およびDNA定量の標準化が必要です。
- 柑橘類組織における病原体濃度の変動を考慮する必要があります。これは検出限界に影響を及ぼす可能性があり、低タイターの場合にはサンプルの繰り返し測定が必要となります。
- Candidatus liberibacter spp. をin vitroで培養できないため、病原体の同定および検証にはPCRベースの検出が不可欠です。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Isolation of Genomic DNA from Plant Tissue
5:04
Perform PCR on Genomic DNA Samplesand Electrophoresis of the Amplified DNA II. Isolation of Genomic DNA from Plant Tissueon an Agarose Gel
7:34
Results: PCR Amplification of Genomic DNA to Identify the Citrus Greening Bacterium
8:52
Conclusion
