Name: 特定病原体緑化シトラスカンキツグリーニング病病原細菌属カンキツ葉組織サンプルで使用した従来の PCR の正確な検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学ぶ、PCRとゲノムDNA抽出を用いて柑橘類の葉組織からCandidatus liberibacter spp.を正確に検出する方法。農家や研究者が黄化病を迅速に識別し、病害管理を支援する効率的な技術です。

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概念化、h. c. および Z. Q. F;Z. Q. F ・ j ・ C、h. c. 調査リソース、Z. Q. F.;書く - 原案、I. A. P.;ライティング-レビューと編集、Z. Q. F.;、s. l. t. h. c. j. c. i. a. p.可視化, H. C.;監督、Z. Q. F.;資金獲得、Z. Q. F と f. q. l.
サウスカロライナ改善先生品質高等教育国家助成金タイトルによるプロジェクト、強化中間等級科学教師の工場プロセスの知識、構造、および植物科学研究 (工場の機能を通じて婚約科学)
ユナイテッド立ち会える教育学科 (CFDA 番号 84.367B) 資金
著者らはゲノム DNA のサンプルを提供するためにフロリダ大学の博士インディアン王を感謝したいから感染シトラスシネンシスバレンシア。

1. ゲノム抽出キットを使用して植物組織からのゲノム DNA を分離します。
<ol><li>切り出して全体の新鮮なきれいなはさみを使用して柑橘類の木から葉し、葉がきれいなプラスチック サンドイッチ バッグ、柑橘類の葉の組織を取得します。 注記: 葉のティッシュの入った袋を配置する 4 ° C の冷却装置でまたは断熱容器で氷の腐敗を防ぐため、コレクション後できるだけ早く。</li>
	<li>乳鉢と乳棒を寒さに液体窒素の少量を追加します。彼らが冷やしている間葉組織、サイズ約 1 平方インチの小片をカットするはさみを使用します。それを瞬時に凍結するモルタルに切断組織を配置します。必要な場合より多くの液体窒素を追加します。 注: 絶縁手袋は、液体窒素を処理しながら常に着用する必要があります。</li>
	<li>すぐに、モルタルを用いた微粉末に植物組織を粉砕します。液体窒素が完全に蒸発して緑の粉のままなるまで研削を続けます。</li>
	<li>簡単に、ヘラを使って 1.5 mL 遠心チューブにモルタル内部地組織をスクープして 10-15 s、液体窒素中での金属のヘラを冷やします。</li>
	<li>核溶解液の 600 μ L を追加 (材料の表を参照) を使用して 1000 μ L ピペットと渦 1-3 s のサンプルは、15 分の 65 ° C の水浴中孵化させなさい。</li>
	<li>逆転管 2 - 5 回、それを混合し、37 ° c 15 分間キャビネット インキュベーターで孵化して、ライセート 10µL ピペットを使用する RNase 溶液 3 μ L を追加します。 注: 続行する前に室温に冷却する混合物を許可します。</li>
	<li>しっかりしたペレットを形成する 13,000 x g でタンパク質沈殿物溶液、20 秒の高速、3 分間遠心する渦の 200 μ L を追加します。サンプルを遠心分離されているが、新鮮な 1.5 mL 遠心チューブに室温イソプロパノールの 600 μ L を追加します。</li>
	<li>1000 μ L ピペットを使用して、慎重にイソプロパノールを含む新鮮な 1.5 mL 遠心管に移し、遠心サンプルから上澄みを取り外します。ペレットを破棄今可能性があります。 注: を使用すること、ペレット上清の非常に小さい量を残すことによって蛋白質の上澄みが汚れない。</li>
	<li>DNA が糸状の繊維の塊として目に見えるようになるまで、チューブを反転し、室温で 1 分 13,000 × g で遠心分離します。</li>
	<li>上清をデカント、ペレットを 70% のエタノールの 600 μ L を追加、DNA を洗浄し、1 分間 13,000 × g で遠心チューブを数回反転します。</li>
	<li>慎重に緩やかな DNA の餌を残して、エタノールを吸引し、開き、吸収紙の上に休んで、チューブを反転します。15 分間室温で乾燥した空気。</li>
	<li>乾燥 DNA の餌に DNA 補水液 100 μ L を追加し、チューブをタップして定期的に混合しながら、1 時間 65 ° C の水浴の DNA を孵化させなさい。</li>
	<li>精製水 1 μ L を microcuvette に置き、空白として使用する分光光度計に挿入します。Microcuvette に 1 μ L のサンプルを配置し、分光光度計を挿入して、現在の DNA の濃度を計算します。DNA 濃度 (ng/μ L) (260-320) として計算される × 希釈係数 × 50 ng/μ L をすることができます。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。サンプルは 4 ° C で保存できます。</li>
</ol>2. ゲノム DNA のサンプルの PCR を実行します。
<ol><li>結合 10 μ L 2 x PCR マスター ミックス (材料の表を参照)、1 μ L 前方プライマー (10 pM/μ L)、1 μ L 逆プライマー (10 pM/μ L) (プライマー シーケンスについて表 2を参照)、100 ng の DNA のサンプルから抽出され、精製水 (最大 20 μ L 最終巻) で50 μ L の PCR チューブ、ミックス、フリックで簡単に遠心分離機。</li>
	<li>たちに PCR チューブを挿入し、それに応じて実行 (表 1参照)。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。必要に応じて、反応が完了した後、4 ° C でサンプルを格納します。</li>
</ol>3. Agarose のゲルに増幅された DNA を electrophorese します。
<ol><li>アガロース パウダー 0.4 g の重量を量る、きれいな 200 mL 三角フラスコ、50 mL を充填する 1 x TAE バッファーと共にそれを追加します。</li>
	<li>マイクロ波高 1.5 分、すべての 30 の揺れの s、アガロースは完全に溶解するまで。 注: 火傷を防ぐために液体のアガロースを処理しながら絶縁手袋を着用ください。</li>
	<li>液体アガロースとミックスする手ふれに臭化エチジウム 10 mg/mL の 2.5 μ L を追加し、レベル ゲル鋳型に液体 agarose ゲルを注ぎなさい。注入後標準 12 歯ゲル櫛をすばやく挿入します。</li>
	<li>ゲルを許可、室温で 20 分間冷却し、ゲルの櫛を削除して、ジェルを 1 x TAE バッファーでいっぱいレベル ジェル ボックスに。</li>
	<li>ピペットを使用すると、増幅された DNA サンプルの合計を井戸に読み込みます。あなたのサンプルから別のよく 5 μ L の DNA の梯子 (材料の表を参照) を追加します。</li>
	<li>定数 90 V、35 分間のサンプルを electrophorese し、ゲルを取り外し、UV transilluminator に置きます。</li>
	<li>写真し、302 の紫外線透過を使用しながらパターンをバンディング ゲル分析 nm。</li>
</ol>

<ol><li>Field Office, F. lorida <a target="_blank" href="http://citrusindustry.net/wp-content/uploads/2016/10/cit1016.pdf">Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size</a>. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).</li>
<li>Singerman, A., Useche, P. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/2aa9/2db973c8f73893a0799ef82cb8883821127b.pdf">Impact of citrus greening on citrus operations in Florida.</a> Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).</li>
<li>Spreen, T. H., Hodges, A. <a target="_blank" href="https://conference.ifas.ufl.edu/citrus12/PDF%20Presentations/Fri-pdf/1045%20Spreen.pdf">The economic impact of HLB on the florida citrus industry</a>. , University of Florida. (2012).</li>
<li>UICEP. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pathology%22">Pathology</a>. , (2013).</li>
<li>Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phloem-limited+bacterium+of+greening+disease+of+citrus+is+a+member+of+the+alpha+subdivision+of+the+Proteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Syst+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria.</a> Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).</li>
<li>Fujikawa, T., Iwanami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+robust+detection+of+citrus+greening+%28huanglongbing%29+bacterium+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B+by+DNA+amplification+with+new+16S+rDNA-specific+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34; by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers.</a> Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).</li>
<li>Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. <a target="_blank" href="https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PDIS-92-11-1547">Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing.</a> Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).</li>
<li>Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. <a target="_blank" href="https://www.cacitrusmutual.com/wp-content/uploads/2015/12/2015-USDA-Citrus-Fruits-Summary.pdf">Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015)</a>. , (2015).</li>
<li>Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+the+two+Candidatus+Liberobacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing+by+PCR+amplification+of+ribosomal+protein+genes+of+the+%CE%B2+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon.</a> Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).</li>
<li>Mafra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+genes+for+accurate+transcript+normalization+in+citrus+genotypes+under+different+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions.</a> PLoS One. 7 (2), e31263(2012).</li>
<li>Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+for+detection+and+identification+of+Candidatus+Liberibacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing.</a> J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).</li>
</ol>

還陳、イアン ・ アーサー ・ パーマー、Jian 陳、明チャン、スティーブン ・ トンプソン、Fengquan リュー、そして鄭清 Fu 利害の対立を宣言しません。

まさに最適な実験条件を達成するためにすべての手順が続いていることが重要です。全体の葉の組織がこのデモ中に使用されました。しかし、理論的には植物組織の任意の種類を含めるにプロトコルを変更できます。以前は、研究者は葉静脈の組織ではなく、全体の葉組織からのゲノム DNA を抽出して同様の結果11を達成しました。シトラスFBOX遺伝子に対応するバンドが表示されない場合、結果は有効でないし、動作の手順でいくつかの技術的なエラーの 1 つ以上可能性があります。一般的なエラー: 汚染または不適切な滅菌水、マイクロ ピペットのヒント、またはマイクロ遠心チューブ用を使用してPCR ミックスやゲノム DNA の抽出の間に必要な 1 つまたは複数のコンポーネントを追加する失敗適切なたちの条件を維持するために失敗しています。試薬またはその有効期限を過ぎている他の食材を使用してください。agarose のゲルに臭化物または別の DNA 染色エチジウムを追加に失敗高すぎる電圧または余りに長くのための増幅された DNA を electrophoresing古いまたは不適切な混合の TAE バッファーを...

カンキツグリーニング、カンキツグリーニング病とも呼ばれる、柑橘類の木々 の重要な損失を引き起こした。1 つの代表格は、フロリダ州 2016-2017 シーズン1現在 7000 万箱に 2 億 4400 万ボックスから 1997-1998 年シーズンのフロリダ オレンジ ボックスの生産の 70% 削減を引き起こす病気を予想する場所です。以上フロリダの柑橘類の木の 90% が感染した2、およびフロリダの柑橘類工業は、前記カンキツグリーニングは3主要な役割を果たしている柑橘類の病気が毎年約 10 億ドルを失うこと推定されています。カンキツグリーニング、侵襲ミカンキジラミミカンキジラミ、によって主に広がる、.の感染組織の接木によって広げることができるも病気の静脈、非対称的な黄化斑点、早期落葉、枝枯れ、根面齲蝕、植物の死の黄変が発生します。重要なことは、疾患の原因となりフルーツ、ほとんど、季節外れの花を作り出す柑橘類の植物。プロデュースは感染したカンキツ果実が未熟な緑、および4の味が苦いです。
このメソッドの目的は、正確し、運動性細菌カンキツグリーニング病病原細菌の属、感染したカンキツ5の師部内に生きてカンキツグリーニング病原を正確に識別。ゲノム DNA は生きている細菌を含む全体の葉組織から抽出されます。この抽出したゲノム DNA は細菌の 16S rdna に相補的なオリゴヌクレオチドは、このシーケンスを増幅するため、従来の PCR のテンプレートとして使用されます。シトラスFBOX遺伝子相補的なオリゴヌクレオチドは、内部増幅制御として使用されます。以前の研究6で成功するために実証されているため、このメソッドを使用にしました。
この方法には、簡単な比較的安価な任意の通常の整った生化学のラボで実施することができるの明確な利点があります。さらに、PCR のままこの病原体の7と病原体の能力を生き残るため、無症候性ホスト8年の再現を養殖の難しさのため、この病原体を検出するため最も正確かつ正確な方法。多くの異なる専門 PCR の試金はこの病原体; を正常に検出に使用されています。しかし、従来の PCR は、無症候性ホスト8の内で特に、正確かつ特定の検出のための最も簡単なアッセイを残ります。

<table><tbody><tr><td>ウィザードゲノムDNA精製キット</td><td>プロメガ</td><td>A1120</td><td>核溶解、RNase、タンパク質沈殿、およびDNA再水和液の供給源</td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>空気製品</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>コントロールパネル付きMastercyclerプロ</td><td>エッペンドルフ</td><td>6321000019</td><td></td></tr><tr><td>1250 W マイクロ波</td><td>パナソニック</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>5424 卓上遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>05-403-93</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 215 デジタルウォーターバス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-462-15Q</td><td></td></tr><tr><td>金属ヘラ</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>Z283274</td><td></td></tr><tr><td>モルタルと乳棒</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>Z247464</td><td></td></tr><tr><td>LSE ボルテックスミキサー</td><td>コーニング</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>2-プロパノール</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>滅菌 10 &mu;Lチップ</td><td>TipOne</td><td>1161-3730</td><td></td></tr>滅菌<tr><td>200 &mu;Lチップ</td><td>TipOne</td><td>1163-1730</td><td></td></tr>滅菌<tr><td>1250 &mu;Lチップ</td><td>TipOne</td><td>1161-1750</td><td></td></tr>可変<tr><td>容量ピペッターキット</td><td>VWR</td><td>75788-460</td><td></td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70041</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17892</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>&mu;キュベット</td><td>エッペンドルフ</td><td>6138000018</td><td></td></tr><tr><td>スタッカブルキャスティングトレイとコーム</td><td>カロライナ</td><td>213655</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac ベーシック電源</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>ミニサブセル GTシステム</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1704487EDU</td><td></td></tr><tr><td>バイオスペクトロメーター ベーシック</td><td>エッペンドルフ</td><td>6135000009</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>3439</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq グリーン PCR マスターミックス</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>フォワードプライマー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>リバースプライマー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>水、PCR グレード</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3315953001</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc XR+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>1 KB+ DNA ラダー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック サイエンティフィ</td><td>ック 10787018</td><td></td></tr></tbody></table>

特定病原体緑化シトラスカンキツグリーニング病病原細菌属カンキツ葉組織サンプルで使用した従来の pcr の正確な検出

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

カンキツグリーニング、カンキツグリーニング病として知られているは、世界的に柑橘類の農場を荒らす破壊的な柑橘類疾患です。この病気には、非対称の黄色葉の斑点、葉脈黄、摘葉、根面齲蝕、最終的には、柑橘類の植物の死が発生します。感染、柑橘類の植物は成長の発育を妨げているし、季節はずれの花を作り出します。これらの花はほとんど果物をもたらすし、小さく、苦い、不規則な形の柑橘系の果物を降伏行うことが望ましい。この病気は、感染したカンキツ組織からの移植、ミカンキジラミ、ミカンキジラミ、広がっています。病原体は柑橘類の植物の中で長いと変数の潜伏期間-時々 年、症状が現れる前に。この病原体の in vitro培養の試みが成功すると、可能性が低いのためにされている、内の病原体の凹凸濃度感染カンキツ組織や環境を複製することは困難だから条件の成長を助長病原体。前にそれが広がっており、その長い潜伏期間と、病原体を培養する研究者の無力のために病気を識別する非常に困難です。その結果、病気のみ明らかになります突然柑橘類の農夫の全体収穫を破壊した後。ここに提示のカンキツグリーニング病原体、ゲノム DNA 抽出キットや PCR を用いたカンキツグリーニング病病原細菌属の正確かつ具体的検出法です。このメソッドは、シンプルで効率的、費用対効果、かつ定量化するための適応です。このメソッドは、カンキツ組織で使用するために合わせることができます。しかし、それは可能性のある病原体の組織内に存在の量によって制限されます。それにもかかわらず、このメソッドは以前、感染した柑橘系植物を識別するために柑橘農家を許可し、それがさらに広がることができる前に、この破壊的な病気の広がりを抑制します。

肯定的な結果が 500 に対応する明瞭なバンドを得られる bpカンキツグリーニング病病原細菌うわさの花姫Las606/Lss6,および/または 700 に対応する異なるバンドのLaa2/Laj5、 16S リボソーム β への挿入のための bpオペロン9。内部増幅制御帯域 400 に現れる場合も bp。このバンドは柑橘類FBOX遺伝子の10では、増幅に対応し、有効と見なされる結果に表示する必要があります (図 1および図 2)。両方 500 の欠如 bp と 700 bp バンド 400 bp のバンドが存在する間は、否定的な結果を表します。約 700 のいくつかの非固有のバンド パターンを...

カンキツグリーニングは柑橘類の作物に影響を与える世界的に特に破壊的な病気です。ここで紹介は単純なメソッドを使用して PCR およびカンキツ葉組織のゲノム DNA 抽出カンキツグリーニング病原体、カンキツグリーニング病病原細菌属の正確かつ正確な同定のため

特定病原体緑化シトラスカンキツグリーニング病病原細菌属カンキツ葉組織サンプルで使用した従来の PCR の正確な検出

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

この手順の全体的な目標は、柑橘類の葉組織中の柑橘類の緑化病原体Candidatus liberibacter spp.を正確に検出することです。この方法により、柑橘類の農家や研究者は、柑橘類の緑化の原因となる病原体の存在を迅速かつ正確に特定できます。手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるIan Palmerです。この方法は、効率的で費用対効果が高く、定量分析に適応できます。さらに、最小限のレベルの実験室の経験と機器で実施することができます。まず、きれいなハサミを使って柑橘類の木から新鮮な葉を丸ごと切り取り、きれいなプラスチックのサンドイッチバッグに入れます。次に、乳鉢と乳棒を冷やし、少量の液体窒素を加えます。次に、はさみを使用して、約1平方インチのサイズの葉組織の小片を切り取ります。葉片を乳鉢に入れて、すぐに凍らせます。液体窒素が蒸発し、細かい緑色の粉末が残るまで、乳鉢で葉の組織をすばやく粉砕し始めます。次に、金属ヘラを液体窒素で10〜15秒間冷やします。次に、冷たいヘラを使用して、1.5MLのマイクロ遠心チューブで乳鉢から粉砕された組織をすくい取ります。1000MLのピペットを使用して、600MLの核溶解溶液をサンプルに加えます。次に、サンプルを1〜3秒間ボルテックスします。チューブを摂氏65度で、水浴中で15分間インキュベートします。インキュベーション期間が終了したら、10MLのピペットを使用して3MLのRNA溶液をライカテに追加し、RNAを除去します。次に、チューブの内容物を2〜5回反転させて混合します。キャビネットインキュベーターで摂氏37度で15分間インキュベートします。15分後、200MLのタンパク質沈殿溶液をサンプルに加えます。チューブを高速で20秒間ボルテックスします。次に、サンプルを13000Gで3分間遠心分離します。遠心分離の過程で、室温で維持された600MLのイソプロパノールを新しい1.5MLのマイクロ遠心チューブに加えます。遠心分離が終了したら、遠心分離チューブから上清を慎重に取り出し、イソプロパノールの入ったチューブに移します。ペレットを捨てます。DNAが糸のような鎖のように見えるように、チューブを反転させます。次に、サンプルを13000Gで室温で1分間遠心分離します。遠心分離後に上清をデカントします。次に、ペレットに600MLの70%エタノールを加えます。チューブを数回反転させてペレットを洗浄します。チューブを13000Gで1分間遠心分離します。遠心分離が終わったら、上清を慎重に吸引します。次に、吸収紙の上で蓋を開けた状態でチューブを反転させ、15分間風乾します。乾燥したら、ペレットに100MLのDNA再水和液を加えます。DNA懸濁液を摂氏65度で水浴中で1時間インキュベートします。ミキシング中に定期的にチューブを軽くたたきます。マイクロキュベットに精製水1MLを加えます。分光光度計で水を空白として読み取ります。次に、マイクロキュベットに1MLのサンプルを追加します。マイクロキュベットを分光光度計に置き、DNA濃度を求めます。すべての試薬と100ナノグラムのゲノムDNAを50MLのPCRチューブに追加してPCR反応を構成します。チューブを静かにフリックして試薬を混合し、その後、すばやく遠心分離します。PCRチューブをサーモサイクラーに入れ、プログラムを実行します。アガロースゲルを調製するには、0.4グラムのアガロース粉末を秤量します。次に、アガロース粉末を200MLの三角フラスコに加え、1X TAEバッファーで容量を50MLに調整します。アガロース混合物を強火で約1.5分間電子レンジで加熱します。アガロースが完全に溶解するまで30秒ごとに振とうします。次に、臭化エチジウム1ミリリットルあたり2.5ミリグラムの10ミリグラムを液体アガロースに加えます。次に、フラスコを振って臭化エチジウムを混合し、液体アガロースゲルを水平なゲル型にすばやく注ぎます。すぐに標準の12歯ジェルコームを挿入します。ゲルを室温で約20分間冷ましてから、ゲルコームを取り外します。次に、固化したゲルを1X TAEバッファーで満たされた電気泳動ユニットに入れます。増幅したDNAサンプルと5 MLのDNAを、後でゲル上の別々のウェルにロードします。電気泳動ユニットを一定の90ボルトで35分間始動します。次に、電気泳動ユニットからゲルを取り出します。次に、ゲルをUVトランスイルミネーターの上に置きます。トランスイルミネーターのゲルバンディングパターンを302ナノメートルで撮影します。グリーニング細菌を同定するために、感染したサンプルと非感染サンプルの両方から得られたPCR増幅ゲノムDNAを電気泳動します。ゲル中で500塩基対に対応するこれらのバンドは、CL asiaticas細菌におけるLas16SリボソームDNAの特定の領域の存在を示している。これらのバンドは700塩基対に対応するため、LAA2/LAJ5の存在を示しており、細菌の16SリボソームβオペロンDNA配列にインサートが存在します。400塩基対のこれらの異なるバンドは、柑橘類のF-box遺伝子のみの増幅を示しており、これは内部増幅制御を指しています。結果が有効であると考えるには、このバンドの存在が必要です。それどころか、400塩基対にバンドしか存在せず、500塩基対と700塩基対に他のバンドがないことは、健康な柑橘類の組織を示しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば約4時間で完了します。この手順は、存在する病原体の量を検出するためのRTQPCRなど、より定量的な方法の実行を可能にするように適合させることができます。

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Research

JoVE Journal

Environment

環境

出典: Gulla, S. ほか。 魚類病原性細菌 Yersinia ruckeri の多遺伝子座可変数タンデムリピート解析(多重PCRおよび毛細管電気泳動による解析)。 J. Vis. Exp. (2019年)。このプロトコルは、超純水に単離されたコロニーを懸浮させ、熱を加えて細胞を溶解することで Yersinia ruckeri...

病原性細菌に感染した植物の葉組織からゲノムDNAを抽出する

出典: Chen, H., 他 柑橘類の葉組織サンプルを用いた従来のPCRを用いた柑橘類緑化病原体 Candidatus liberibacter 属の特異的かつ正確な検出。 J. Vis. Exp.

細菌感染検出のための葉から総DNA抽出

病原体の成長の定量化は、様々なシロイヌナズナ(以下:シロイヌナズナ)の免疫応答を特徴づける強力なツールです。ここで説明する方法は、Pseudomonas syringae...

使用した植物防御応答のファインキャラクタリゼーションのための細菌の葉浸潤アッセイ<em&gt;シロイヌナズナシュードモナスシリン</em&gt; Pathosystem

Nested pcr 法は、ライム病ライム病の病原のプローブ DNA を抽出し目盛りに適用できる敏感な具体的で、わかりやすい手法です。最初の PCR 実験は遺伝子特定のプライマーを使用し、内部のプライマーを使用して後続の反応のためのテンプレートとなる長い amplicons...

Nested pcr 法を使用してのタイマー刻みでライム病ライム病スピロヘータを検出

タバココナジラミの迅速同定のループ介在増幅法 (LAMP) アッセイ

フィルターペーパーDNA抽出法と、現場や研究室で分析できるループ媒介等熱増幅(LAMP)アッセイを用いて、水源中の フィトフトーラ・カプシチ...

ループ媒介等熱増幅を用いた灌漑水中フィ トフトーラカプシ の検出

本研究では、CRISPR-Cas12aと組み合わせたリコンビナーゼポリメラーゼ増幅に基づくカン ディダトゥス...

CRISPR-Cas12aと組み合わせたリコンビナーゼポリメラーゼ増幅を用いたフィールド展開可能な カンディダトゥス ・リベリバクター・アジアティカス検出(英語)

師部が豊富な樹皮の柑橘類のつぼみ組織を迅速に処理する機器を設計、製造、検証しました。現在の方法と比較して、バッドウッド組織抽出器(BTE)はサンプルスループットを向上させ、必要な人件費と設備コストを削減しました。...

機器エンジニアリングによる下流の病原体検出のための柑橘類の芽処理の自動化

この原稿は、黄龍峰柑橘類病に関連する細菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)またはその昆虫ベクター(Diaphorina...

植物における分子送達のための直接注入装置

このプロトコルでは、外来植物病原体 Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4の検出のために、組み合わされたリコンビナーゼポリメラーゼ増幅CRISPR/Cas12aアッセイが示されている。...

Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4 検出のための複合リコンビナーゼポリメラーゼ増幅 CRISPR/Cas12a アッセイ

ここでは、増幅可能な細胞溶解、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、およびCRISPR/Cas12aアッセイを使用して、 Lotmaria passim や Nosema ceranae...

RPA/CRISPR/Cas12aシステムへのアルカリ溶解によるトリパノソーマ科寄生虫および Nosema ceranae のオンサイトDNA検出

学ぶ、PCRとゲノムDNA抽出を用いて柑橘類の葉組織からCandidatus liberibacter spp.を正確に検出する方法。農家や研究者が黄化病を迅速に識別し、病害管理を支援する効率的な技術です。

特定病原体緑化シトラスカンキツグリーニング病病原細菌属カンキツ葉組織サンプルで使用した従来の PCR の正確な検出

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