腸管病原体の胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成: 同定及び定量化の手法

このバイオフィルム形成および評価プロトコルの全体的な目標は、特に胃腸の通過と胆汁酸塩への曝露を模倣する条件下で、腸内細菌性病原体がバイオフィルムを形成する能力を決定することです。この方法は、腸管病原体が胃腸管の過酷な胆汁酸塩条件を生き残る能力など、細菌の病因分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、3つのアッセイから得られた結果を組み合わせることで、各病原体の胆汁酸塩曝露に応じたバイオフィルム形成の詳細な特性評価がサポートされることです。

私たちは最初に、赤痢菌の胆汁酸塩誘発性バイオフィルム形成を完全に定量化する必要性を考慮して、組み合わせた方法のアイデアを思いつきました。一般に、この分析法を初めて使用する人は、アッセイの側面によって再現性が制限されるため、苦労します。そのため、再現性を確保するために、重要なステップに注意してください。

手順を実演するのは、私の研究室のメンバー、ポスドク研究員のKourtney Nichersonと臨床研究員のAlejandro Llanosです。まず、2つの1.5ミリリットルチューブにTSBおよびTSBプラスBSのラベルを付けます。次に、1ミリリットルのTSBまたはTSBとBSをそれぞれのチューブに追加します。次に、チューブに20マイクロリットルの一晩培養液を1〜50希釈で接種します。

次に、130マイクロリットルの未接種コントロール培地を、無菌、透明、平底、組織培養処理済み、96ウェルプレートの3つのウェルのそれぞれに加えます。これが空白のコントロールになります。130マイクロリットルの接種培養物を3つのウェルのそれぞれに加えます。

コントロールと接種した培養物をそれぞれのウェルに添加した後、96ウェルプレートを摂氏37度で4〜24時間静的にインキュベートします。インキュベーションが終了したら、プレートリーダーでコントロールをブランクにセットします。次に、各ウェルから培地を吸引します。

次に、200マイクロリットルの滅菌PBSでウェルを一度優しく洗います。洗浄後、PBSを吸引し、プレートを反転させて約20分間乾燥させます。EPSマトリックスが乱されないように、メディアを優しく取り外し、穏やかに洗浄することが非常に重要です。

次に、150マイクロリットルの0.5%クリスタルバイオレットを実験ウェルとコントロールウェルのそれぞれに加えます。その後、プレートを室温で5分間インキュベートします。5分後、400マイクロリットルの蒸留水でウェルを一度洗います。

200マイクロリットルの蒸留水を加えて、井戸を5回洗います。5回の洗浄をすべて行った後、プレートを裏返し、光から保護して完全に乾かします。一貫した結果を得るためには、先に進む前にサンプルを十分に乾燥させることが重要です。

プレートが完全に乾いたら、200マイクロリットルの95%エタノールを使用してウェルを脱汚します。その後、蒸発を防ぐために、プレートを摂氏4度で30分間シェーカーの上に置きます。30分後、OD540をプレートリーダーに記録します。

EPSを半定量的に検出するには、マルチチャンネルピペットを使用して、培養培地を透明な96ウェルプレートに移します。その後、200マイクロリットルの固定用試薬を使用して、黒板を室温で15分間固定します。次に、標準化のためにコントロールウェルをブランクに設定して、OD 600の読み取り値を記録します。

次に、付着した集団が固定されている間に培地の読み取りを記録します。固定が完了したら、試薬を取り出し、有害廃棄物として捨てます。次に、200マイクロリットルの滅菌PBSを使用して、ウェルを2回優しく洗います。

洗濯後、PBSを吸引します。次に、ConA-FITCの1ミリリットルあたり25マイクログラムの150マイクロリットルを追加します。プレートを室温で15分間インキュベートします。

インキュベーション後、ウェルを200マイクロリットルのPBSでやさしく洗います。次に、各ウェルに150マイクロリットルのPBSを加え、488ナノメートルで蛍光を記録します。新鮮な試薬を調製した後、PBS、PBSをブドウ糖、PBSを胆汁酸塩、PBSをブドウ糖と胆汁酸塩で27°Cに温めます。

次に、コントロールウェルをブランクに設定して、プレートリーダーにオーバーナイトバイオフィルムプレートからのOD600値を記録します。次に、プラスチック表面の付着者集団を乱さないように、真空ラインを使用して培地を吸引します。ウェルを200マイクロリットルの滅菌PBSで2回優しく洗います。

PBSで洗浄した後、予熱したPBS、ブドウ糖入りPBS、胆汁酸塩入りPBS、胆汁酸塩とブドウ糖入りPBSをそれぞれ3つのウェルに130マイクロリットル加え、プレートを摂氏37度で30分間インキュベートします。30分後、プレートをインキュベーターから取り外します。上清をピペットで新鮮な滅菌96ウェルプレートに取り出します。

最後に、上清のPBSによる1〜10回の段階希釈液を96ウェルプレートまたは希釈ブロックで調製します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、各希釈液の5マイクロリットルをLB寒天プレートに移します。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。

翌日、コロニーの数を数えます。バープロットは、腸内病原体における胆汁酸塩依存性バイオフィルム形成を定量化するために得られます。これは、培地中の胆汁酸塩の存在下と非存在下で、個々の菌株のOD 540値をプロットすることによって行われます。

プロットは、腸管凝集性大腸菌を除くほとんどの病原体株のバイオフィルム形成の有意な増加を示しています。次に、バイオフィルム形成中に生成されるEPSは、EPSによって保持されるConA-FITCの量を決定することにより検出されます。棒グラフは、胆汁酸塩の存在下で蛍光の読み取り値が有意に増加したことを示しています。

これにより、病原体赤痢菌のEPS産生が確認されました。ここで、EPSマトリックスのConA-FITC依存性染色は、胆汁酸塩にさらされると有意に高くなります。これは、多糖類に富むEPSマトリックスを特徴とする細菌のバイオフィルムの形成を示しています。

One X PBSとDAPIは、それぞれFITC依存性の特異性と細菌DNAの存在を示すために使用されます。最後に、コロニー形成ユニットの数をカウントして、バイオフィルムからの細菌の胆汁酸塩依存性分散を分析します。プロットは、細菌がPBSおよびグルコースを含むPBSのバイオフィルムから容易に分散することを示しています。

しかし、細菌が胆汁酸塩にさらされると、バイオフィルムからの分散が大幅に阻害されます。これらのアッセイは、結腸に感染する前に小腸で胆汁酸塩に曝露されたことに応答して、腸内病原体、特に赤痢菌によって形成される一過性の毒性バイオフィルムを捕捉し、定量するために開発されました。ベース培地の種類、使用する胆汁酸塩の組成、細菌の増殖条件など、アッセイの変更は、消化管内の感染部位に応じて、さまざまな病原体に合わせて調整する必要がある場合があります。

このビデオを見た後、関心のある細菌株または変異株のバイオフィルム形成を徹底的に評価するための各アッセイの実施方法について十分に理解しているはずです。病原体や一部の溶液を扱う作業は、非常に危険であることを忘れないでください。これらのアッセイを実施する際には、適切な取り扱いや廃棄方法などの予防措置を常に考慮する必要があります。

さらに、新鮮な胆汁酸塩培地の調製、適切な制御、および実験の再現性の確保は、胆汁酸塩によるバイオフィルム表現型のデータ解析と確認に不可欠です。この技術は、従来の方法のユニークで創造的なハイスループットアプリケーションであり、腸内病原体における胆汁酸塩誘発バイオフィルム形成の多面的かつ動的なプロセスの適切な定量化を可能にします。