マルチ弔土壌試料の分析のための MPLEx プロトコル

この手法は、プロテオミクス、メタボロミクス、リピドミクスの分野で使用され、環境摂動によって土壌に関連する微生物群集で起こる分子変化に関する包括的な情報を得るのに役立ちます。この手法の主な利点は、単一の土壌サンプルから複数の分析種を取得することで、精度と精度が向上し、サンプル調製の時間と労力が削減されることです。まず、20グラムの土壌サンプルごとに、10グラムを2本の別々の50ミリリットルメタノール/クロロホルム適合チューブに計量します。

クロロホルムはほとんどのプラスチックを浸出させ、サンプルを汚染するため、PTFE製のプラスチックチューブを使用してください。各チューブに約10ミリリットルのクロロホルム洗浄ステンレス鋼とガーネットビーズを追加します。次に、氷上で4ミリリットルの冷たい超純水を各チューブに加え、氷のバケツに入ったサンプルをドラフトに移します。

25ミリリットルのガラス血清ピペットを使用して、20ミリリットルの氷冷した2対1のクロロホルムをメタノール容量/容量にチューブにすばやく追加します。蓋を締め、土壌混合物を溶液に渦巻きます。クロロホルムメタノールは、原核生物の細胞壁を分解するのを助け、酵素活性を不活性化します。

次に、チューブを50ミリリットルのチューブボルテックスアタッチメントに取り付け、可能であれば冷蔵庫内で摂氏4度で10分間水平にボルテックスします。次に、サンプルをマイナス80°Cの冷凍庫に約15分間入れて、完全に冷却します。次に、ドラフト内のプローブ超音波処理器を使用して、6ミリメートル、1/4インチのプローブで60%の振幅で各サンプルを氷上で30秒間超音波処理します。

超音波処理後、超音波処理は大量の熱を発生させる可能性があるため、サンプルをマイナス80°Cの冷凍庫に入れます。水平渦巻き、超音波処理、および凍結のステップを繰り返した後、サンプルを4, 000倍の重力と摂氏4度で5分間遠心分離します。この時点で、サンプルは上部代謝物層、タンパク質中間層、および下部脂質層に分離されます。

サンプルを氷の上に置きます。次に、ドラフト内で、10ミリリットルのガラス血清ピペットを使用して、2つの50ミリリットルチューブから上部代謝物層を1つの大きなガラスバイアルに移します。次に、50ミリリットルのチューブを少し傾けてタンパク質中間層を放出し、下部脂質層に自由に浮遊

次に、清潔なステンレス製のフラットヘッドラボ用スパチュラを使用して、両方のタンパク質中間層を慎重にすくい取り、それらを一緒に1つの新しい50ミリリットルチューブに配置します。25ミリリットルのガラス血清ピペットを使用して、下部脂質層を1つの大きなガラスバイアルに移します。20ミリリットルの氷冷メタノールを、破片のある2本のチューブとタンパク質中間層のある1本のチューブに加えます。

チューブを短時間ボルテックスし、デブリペレットとタンパク質中間層を重力4,000倍、摂氏4度で5分間遠心分離します。次に、メタノールをドラフト内の有害廃棄物容器にデカントします。タンパク質と破片のペレットを液体窒素で凍結し、凍結乾燥機で約2時間乾燥させます。

50ミリモルトリスバッファー(pH 8.0)に20ミリリットルのタンパク質可溶化バッファーを各デブリペレットに加え、10ミリリットルをタンパク質層間チューブに加えます。ヒュームフード内で、サンプルを20%の振幅で30秒間超音波処理し、溶液に持ち込みます。サンプルを2分間ボルテックスします。

次に、タンパク質中間層サンプルを摂氏50度のラボチューブローテーターに30分間入れて、タンパク質を可溶化します。デブリサンプルをさらに10分間水平にボルテックスして、残っている無傷の細胞を溶解します。その後、残りの20分間、タンパク質中間層サンプルとともに回転させます。

室温で4、500倍の重力で10分間すべてのサンプルを遠心分離し、サンプルごとの各チューブから上清を2本の50ミリリットルチューブに収集します。10ミリリットルの可溶化バッファーをタンパク質層間ペレットに加えます。次に、ペレットを超音波処理し、ボルテックスして溶液に戻します。

遠心分離に続いて、破片の餌の上清が付いている2つの50ミリリットルの管に上清を均等に結合し、8、000倍の重力および4°Cで10分間固定角度のバケツ回転子の管を遠心分離機に残る破片を餌にするために。上清を2本の50ミリリットルチューブに分割します。次に、10ミリリットルのガラス製セロジカルピペットを使用して、各チューブに7.5ミリリットルのTCAを追加します。

サンプルを溶液にボルテックスします。次に、サンプルをマイナス20°Cの冷凍庫に2時間から一晩置きます。沈殿したタンパク質をペレット化するには、サンプルを重力4,500倍、摂氏4度で10分間遠心分離し、上清を廃棄物にデカントします。

各タンパク質ペレットに10ミリリットルの100%氷冷アセトンを追加します。チューブをボルテックスし、ペレットのように1本のチューブに組み合わせます。アセトンを遠心分離し、デカントします。

少量のアセトンを使用して、ペレットを2回洗浄し、懸濁液を1.5ミリリットルまたは2ミリリットルのチューブに移して最終回転します。上清を廃棄物にデカントし、ペレットをドラフト内のペーパーワイプで逆さまにして約20分間乾燥させます。ペレットのサイズに応じて、100〜200マイクロリットルのタンパク質可溶化バッファーを追加します。

ペレットを超音波処理し、溶液にボルテックスします。タンパク質とともに沈殿する腐植物質により、サンプルが粘性である可能性があり、その後の遠心分離で除去されることに注意してください。最後に、インキュベーターまたはシェーカーでサンプルを300rpm、摂氏40度で30分間振とうし、タンパク質を溶液に可溶化してから、タンパク質消化または将来の処理のためのスナップ凍結に進みます。

このビデオで紹介されているMPLExプロトコールを使用して、カンザス州の原生の大草原の土壌から3,376のペプチド、105の脂質、および102の極性代謝物を抽出し、プロトコールのタンパク質抽出を逆相LC-MS/MSを使用したタンパク質抽出キットおよびSDS抽出と比較します。市販のタンパク質抽出キットと SDS メソッドの 3 回の繰り返しを最初に比較したところ、2 つの手法間で重複するペプチドはわずか 12% であり、微生物群集の複雑さと異なる抽出効果が示されました。MPLExを市販のタンパク質抽出キットおよびSDS抽出物と比較したところ、MPLEx法で観察されたペプチドの約38%が、SDSおよび/または市販のキット抽出物を使用した場合にも検出されました。

カンザス州の土壌細菌群集とそのメタゲノムの種数を考慮すると、ペプチド同定の重複は合理的です。ここに示すように、MPLExアプローチの広範な適用性は、古細菌S.acidocaldarius、ユニシアノバクテリアコンソーシアム、マウス脳皮質組織、ヒト尿、およびA.thalianaの葉を使用して以前に評価されています。いずれの場合も、MPLExメソッドで観察されたタンパク質の数はコントロールの数と同程度であり、多くの異なるサンプルタイプに対する有用性が示されました。

このビデオを見れば、1つの土壌サンプルからタンパク質、代謝物、脂質を得る方法についてよく理解できるはずです。この手順を試みるときは、すべての土壌タイプが異なるため、柔軟性を持つことが重要です。例えば、タンパク質中間層のサイズは、土壌バイオマスおよび土壌中に存在する腐植物質によって異なります。

クロロホルムでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を試みるときは、ドラフトでの作業などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。