Name: マルチ弔土壌試料の分析のための MPLEx プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学ぶマルチオミクス解析のためのMPLExプロトコル。土壌試料から代謝物・タンパク質・脂質を同時抽出し、環境撹乱下の微生物群集の分子変化を正確に解析します。試料調製時間を短縮し、高精度なデータ取得を実現します。

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著者らは、彼について数字を準備ネイサン ジョンソンを感謝したいです。この研究は、米国エネルギー省のオフィスの生物学・環境研究 (ゲノム科学プログラム)、移行 (ミント) 研究室研究開発の内細菌叢解析によって資金を供給されるパン オミックス プログラムによって支えられました。イニシアチブは、国家機関の健康国立環境衛生研究所 (R01 ES022190) と同様、太平洋の北西国立研究所で、NIH (P42 ES027704)。KEBJ は、R21 HD084788 新規マルチ弔抽出技術開発する金融支援を感謝したいです。この作品で、w. r. ワイリー環境分子科学研究所 (EMSL)、DOE 国立科学ユーザー施設で太平洋の北西国立研究所 (なり) を行った。なり、マルチ プログラム国立研究所契約 DE AC06 76RL01830 下 DOE のバテルが運営。

注: 非常にウェット土壌は抽出の有効性を損なうことがなく抽出前に凍結乾燥することができます。湿った土も使用できますが、特定の比率で試薬を追加する場合に考慮すべき。
注: 2 つの 50 mL チューブ (最大 50 mL チューブあたり 10 g 土) 間で分割する必要があります抽出あたりの乾燥した土壌重量の 20 g を使用することをお勧めします。抽出は、使用可能なサンプルに依存する上下に拡張できます。
注: 乾燥した土壌サンプルは均質化し、小さな根や岩を削除するために 3 mm のスクリーンを通してふるわれたことができます。サンプル画面でスタックを取得しますと、ウェット土壌試料をふるいないか。
1. 土壌のセル換散と代謝、蛋白質および脂質 (タイミング 〜 1 d) の抽出
<ol><li>20 g の土壌サンプルあたりメタノール/クロロホルム互換性のあるは、2 つの別の 50 mL チューブに 10 g の重量を量る。クロロホルムはほとんどのプラスチック、サンプルの汚染を溶出するように選択すると、チューブに非常に注意をします。ポリプロピレンまたはポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) から可能なまたはプラスチック管が行われるたびに、ガラスを使用します。 : 注意氷、クールな土壌初期の重量を量ると均質化の手順中に可能な限り。</li>
	<li>各管に 10 mL のクロロホルム洗浄ステンレスとガーネットのビーズを追加します。氷の上を追加 4 mL 冷たい超純水の各管 (2 つの管の間の 1 つのサンプル分割) に (浄化システムの材料の表を参照) を水し、ヒューム フードに氷バケットにサンプルを転送。</li>
	<li>25 mL ガラス製血清ピペットを使用して、簡単に 20 mL の冷たい 2:1 クロロホルム: メタノール (v/v) を追加します。 注意: クロロホルム: メタノールは潜在的な健康への急性影響: 皮膚刺激、可能な化学熱傷および呼吸器系への刺激。腎臓、肝臓、心臓に影響を与える可能性があります。適切な保護眼鏡、衣類、手袋を着用し、発煙のフードとは限りません。</li>
	<li>ソリューションには、蓋と渦を締めます。2:1 choloroform:methanol は原核生物の細胞壁を破ることができます、また酵素を不活性化します。</li>
	<li>可能であれば 50 mL チューブ渦添付ファイルと水平方向に冷蔵庫内の 4 ° C で 10 分間の渦にチューブを接続します。その後、完全にそれらを冷却するために 〜 15 分-80 ° C のフリーザーの中サンプルを置きます。</li>
	<li>30 に対する振幅 60% で 6 mm (1/4") プローブを各サンプルを超音波ヒューム フード内プローブ超音波発生装置を使用して s の各氷の上。 注意: sonicating ながら筐体と耳の保護を和らいでサウンドを使用することをお勧めします。高電圧は電源の供給と高周波ケーブルであります。アクティブ ・ プローブ; と下部またはサンプル容器の側面に触れないようにそれは亀裂、プラスチックを溶かします。</li>
	<li>多くの熱を生成することができます sonicating として 〜 15 分-80 ° C のフリーザーにサンプルを配置します。</li>
	<li>1.5 1.7 の手順を繰り返します。 注: サンプルは換散プロシージャ全体で寒い日になっていることを確認します。</li>
	<li>遠心分離機の 4 ° C、5 分間 4,000 x g でサンプルこの時点で、サンプルは上部の代謝物層、蛋白質中間層と下層脂質 (および残りの破片ペレット) に分離されます。図 1を参照してください。</li>
	<li>アイスバ ケットに氷のサンプルを場所外し、ヒューム フード、10 mL のガラス製血清ピペットを使用して、内部上部代謝物層 2 つの 50 mL チューブから 1 つの大きなガラスの瓶に。 注: を避ける; ピペットに蛋白質のレイヤーのいずれかを吸引必要な場合は、代謝物の小さな層をままにします。</li>
	<li>低脂質層に浮遊して蛋白質中間膜をリリースする 50 mL のチューブに少しだけ傾けます。きれいなステンレス フラット ヘッド ラボへらを使用して、慎重に蛋白質の中間層の両方をスクープ、一緒に 1 つの新しい 50 mL のチューブにそれらを置きます。</li>
	<li>25 mL ガラス製血清ピペットを使用して、1 つの大きなガラス瓶に下位の脂質層を削除します。 注: 意欲的な土壌粒子を回避しようとしてください。ただし、いくつかの土の破片や粒子を一緒に志しました脂質は後で削除されます。</li>
	<li>代謝と脂質の上に通気性膜ガラス瓶と真空濃縮乾燥まで乾燥 (脂質 4 〜 5 h、代謝産物の一夜)。</li>
	<li>タンパク質サンプル チューブおよび残りの破片ペレット チューブ、それぞれに冷たいメタノール 20 mL、渦を追加します。これは、それを投げる前に残骸から任意の可能な残りのタンパク質を可溶化する前に、クロロホルムを洗い流す破片ペレットのため。</li>
	<li>破片ペレットし蛋白質 4 ° C、5 分間 4,000 x g で層間、ヒューム フード内有害廃棄物コンテナーにメタノールをデカントを遠心します。</li>
	<li>蛋白質および残骸のペレットを液体窒素で凍結し、乾 (-105 ° C メタノール-98 ° C の凍結ポイントを非常に低いことが原因のことができるコレクター温度) とエアカーテン 〜 2 時間。 注: は過剰の可溶化が難しくなるために、ペレットを乾燥します。</li>
	<li>蛋白質中間チューブおよび破片ペレットのそれぞれに 20 mL にタンパク質の可溶化バッファー (4 %sds、100 mM DTT (DL ジチオトレイトール) 50 mM tris バッファー、pH 8.0; 参照補助試薬セットアップ) の 10 mL を追加します。 注意: SDS により、急性毒性、可燃性です。それは、皮膚、眼、気道刺激性です。手袋と安全メガネを着用してください。</li>
	<li>発煙のフード プローブ超音波 30 20% 振幅のサンプル ソリューションに持参する s。2 分の渦。</li>
	<li>300 rpm、50 ° C で 30 分間ラボ チューブ回転子にタンパク質の可溶化蛋白質の層間サンプルを配置します。</li>
	<li>水平渦任意の残りのままの細胞を溶解にさらに 10 分間破片サンプルと共に回転して残り 20 分間蛋白質層間のサンプル。</li>
	<li>すべての 10 分間、室温 (RT)、4,500 x g でサンプルを遠心し、サンプルあたり各管から 2 つの 50 mL チューブに上清を収集します。</li>
	<li>10 mL の可溶化バッファー蛋白質層間ペレットを超音波し、渦戻るソリューション、遠心分離前に追加します。</li>
	<li>固定角バケット ローター内の 4 ° C, 10 分間 8,000 × g で遠心分離機し、均等に 2 つの 50 mL チューブに培養上清を組み合わせます。 メモ: 最終的なの遠心分離は過度の汚染フミン物質を除去する必要が。</li>
	<li>これが各 30 mL がある 2 つの 50 mL チューブに培養上清をデカントします。その後、10 mL のガラス製血清ピペットを使用して、各管に TCA (トリクロロ酸) 7.5 mL を追加します。ソリューションに渦。これにより、20% 各 30 mL サンプルの TCA (調整) 注意: TCA は腐食性、有毒であり 5 月皮膚のやけどを引き起こします。手袋と安全メガネを着用してください。</li>
	<li>一夜にして 2 時間-20 ° C のフリーザーにサンプルを配置します。 注意: 蛋白質 1 h 以内通常沈殿させるが左一晩 (18 h まで) することができます。 注意: 蛋白質の酸加水分解可能なため 18 h より長く行く TCA 抽出てはいけないです。サンプルは凍結されている場合は; 氷の上それを解凍します。過去の雪解けのウォーム アップのサンプルを聞かせてはいけません。</li>
	<li>沈殿したタンパク質を餌に 4 ° C, 10 分間 4,500 x g でサンプルを遠心し、廃棄物に上清をデカントします。</li>
	<li>各蛋白ペレット、渦とペレットのような結合する 1 つの管に 100% 氷冷アセトン 10 mL を追加します。</li>
	<li>(バランスを使用)、結合された餌を含んでいる管を遠心し、廃棄物に上清をデカントします。 注意: アセトン気道や皮膚や目の炎症の原因し、は、可燃性の液体および蒸気。手袋・保護メガネと白衣を着用、ヒューム フードの仕事します。</li>
	<li>2 回 1.5 mL のアセトンおよび最終的に 5 分 10,000 x g で最後のスピンの 2 mL チューブへの転送を使用してペレットを洗浄します。</li>
	<li>廃棄物に上清をデカント乾燥ペレットを発煙のフードの 〜 20 分または窒素気流下における紙ワイプ倒立ペレットは少し亀裂を開始するまで許可する.</li>
	<li>ペレットのサイズによって、タンパク質の可溶化バッファーの 100-200 μ L を追加します。 注意: 可能な限り低くサンプルに追加可溶化バッファーのボリューム。その後フィルター支援サンプル準備 (FASP) のみ列ごとに可溶化されたサンプルの 50 μ L まで使用できます。いずれかはより複数の FASP 列に分割する必要があります。</li>
	<li>超音波および渦のソリューションにペレット。サンプルはその後遠心分離と削除されるタンパク質と共に沈降腐植物質による粘性かもしれないことに注意してください。</li>
	<li>ソリューションにタンパク質を可溶化し、タンパク質の消化に進む 300 rpm、40 ° C で 30 分間、インキュベーター/シェーカーでサンプルを振る。</li>
	<li>スナップは、タンパク質消化の準備ができるまで液体窒素、-80 ° C のフリーザーの店でサンプルを凍結します。</li>
</ol>2. 脂質準備 (タイミング 〜 20 分)
<ol><li>脂質サンプルは乾燥、バイアル、ソリューションに渦と 1.5 mL ポリプロピレン チューブに転送する 2:1 クロロホルム: メタノール 200 μ L を加えるガラス追加 200 μ L を追加バイアル、渦とピペットの残りの脂質とチューブに転送します。</li>
	<li>遠心分離機の 4 ° C で 5 分間、12,000 × g でサンプルから破片</li>
	<li>クロマトグラフィー-タンデム質量分析 (LC ・ MS/MS補正方法の詳細) まで脂質バイアル、-20 ° C でストアに上澄みを転送します。</li>
	<li>作製直後にサンプルを分析することはできません、する場合、脂質は酸化・劣化を防ぐために-20 ° C で溶剤に格納される必要があります。</li>
</ol>3. 代謝物の調製及び誘導体化 (タイミング 〜 5 h)
<ol><li>抽出の翌日には、速度 Vac から代謝物サンプルを削除し、GC での誘導体化と分析準備が整うまで-20 ° C で乾燥保存します。そうでない場合は楽器のための適切なプロトコルを使用してそれらを準備して GC での代謝産物を実行しています。</li>
	<li>前処理の直前に GC の分析のための代謝物はメタノール、ボルテックス、1.5 mL ポリプロピレン チューブに追加の 200 μ L の追加によって大規模なガラスの瓶からそれらを転送します。もう一度繰り返します。</li>
	<li>4 ° C、10 分間 12,000 × g でチューブを遠心分離します。小さなガラスの瓶に上清を移す、追加通気性膜上に速度 Vac で完全に乾燥します。</li>
	<li>サンプルバイアルと 30 の渦に methoxyamine 溶液 20 μ L を追加することによって、代謝を derivatize 上の中程度の速度で vortexer 秒。 注意: Methoxyamine 塩酸塩は重度の火傷や目に深刻な被害が発生、皮膚への接触により感作性を引き起こす可能性があります。安全眼鏡、手袋、白衣を着るとヒューム フード。</li>
	<li>風呂超音波発生装置を使用すると、サンプルを完全に溶解します。</li>
	<li>揺れ 1,000 rpm で 1 時間 30 分の 37 ° C で維持結露防止ふた付けインキュベーターでサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>キャップ表面に凝縮滴とサンプルを混合する 1 回のバイアルを反転します。1 分、右の 1,000 x g でサンプルをスピンダウンします。</li>
	<li>シリル化を実行 80 μ (注射器を使用して) N を追加-メチル - N-(トリメチルシリル) トリフルオロアセトアミド 1% トリメチルクロロシランと。10 秒のための渦。 注意: MSTFA + 1 %tmcs 皮膚腐食性、眼に対する重篤な損傷および特定標的臓器毒性を引き起こす可能性が、可燃性の液体および蒸気。安全眼鏡、手袋、白衣を着るとヒューム フード。</li>
	<li>揺れ 1,000 rpm で 30 分の 37 ° C で維持結露防止ふた付けインキュベーターでサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>キャップ表面に凝縮滴とサンプルを混合する 1 回のバイアルを反転します。</li>
	<li>スピン ・ ダウンした 2,000 x g で 5 分サンプル</li>
	<li>ガスクロマトグラフィー質量分析に適したバイアルに反応液を転送します。</li>
</ol>4. 蛋白質消化 (タイミング 〜 1 d)
<ol><li>5 分、任意の残骸をペレットに RT 15,000 × g のサンプルを遠心します。</li>
	<li>FASP を使用して消化キット (材料の表を参照してください) のフィルター支援サンプル準備 (FASP) を実行する次の製造元の手順31,32を変更します。<ol>
<li>FASP 列 (500 μ L 30 K MWCO スピン フィルター) に 8 M 尿素バッファーの 400 μ L を追加します。</li>
		<li>サンプルの遠心分離が終了すると、ピペットの上澄み (廃棄ペレット) を離れて、最大 50 μ L のサンプルを列で 8 M 尿素の 400 μ L に追加します。 注: は、列ごとにサンプルののみ最大 50 μ L を追加します。以上 50 μ L のサンプルの場合、複数の列を使用し、消化後、ペプチドを結合します。それは最高のこのボリュームを可能な限り低く残して (30 μ L が理想的です)、FASP を確保するために列が削除されます大量スペック解析を妨げることができます劇的に SDS のすべて。</li>
		<li>付属の 1.5 mL のチューブに列を置き、RT。 30 分 14,000 x g でサンプルを遠心分離</li>
		<li>廃棄物に流れを削除列に 8 M 尿素の 400 μ L を追加し、再び遠心分離します。</li>
		<li>3 尿素リンスの合計は 1 つのより多くの時間前の手順を繰り返します。 注: サンプル行く確認乾燥に近い列のいずれかがある場合以上 〜 30 μ L フィルターの各回転後、残り続ける遠心分離します。</li>
		<li>20 分間 14,000 x g で 50 mM NH4HCO3および遠心分離機の 400 μ L を追加、廃棄物を破棄、もう一度繰り返します。</li>
		<li>きれいな 1.5 mL 遠心チューブに列を転送します。</li>
		<li>列にトリプシン消化バッファーの 75 μ L を追加し、750 rpm で結露防止ふた付けインキュベーターで 3 h の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>50 mM NH4HCO3の 40 μ L を列に追加します。</li>
		<li>列の上に高分子量の汚染物質を保ちながらチューブにペプチドを収集するために 15 分間 14,000 x g でサンプルを遠心します。</li>
		<li>再度列と遠心分離機に 50 mM NH4HCO3の 40 μ L を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>列を捨てて、乾燥速度 Vac 〜 30 μ L と BCA 法 (ビシンコニン酸タンパク質アッセイ キット; 参照テーブルの材料) が管内にペプチドをペプチド。</li>
	<li>SDS の汚染は (目に見える泡)33を疑いがある場合、必要に応じて、クリーンアップ手順を実行します。このオプションを選択する場合、固相抽出法はその後行う必要があります。このクリーンアップ メソッドの詳細については、補助的な手段で利用可能です。</li>
	<li>MS 分析用サンプルを希釈または必要に応じて HPLC 分画 (次の 2 つの手順) に進みます.
</li>
	<li>分別、10 mM アンモニウム ギ酸緩衝 (pH 10.0) 400 μ L のボリュームにサンプルを希釈します。</li>
	<li>C18 カラムで解決 (材料の表を参照してください) pH 10.0/アセトニ トリル (10: 90) 10 mM ギ酸アンモニウムを 0.5 mL/分移動相 (A) 10 mM ギ酸アンモニウム, pH 10.0 および (B) を用いた高速液体クロマトグラフィー システムで区切ります。<ol>
<li>最小 10 を 70 分 85 に 70、85、95 分以上 30 %a で維持を 30%、65%、100%、95% は最初の 10 分、95% の上でから 65 %a へのグラデーションを調整します。</li>
		<li>100 パーセント分 95 に 105 以上で再平衡し、100% A 120 分まで押し続けます。</li>
		<li>分数 1.25 分毎に (全体のグラデーションの上 96 分数) を収集し、最後に 12 のサンプルまたは 24 サンプルの各行の合計のすべての行を組み合わせる (各 n = 8 または n = プール 4 分画)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>真空下ですべての画分を乾燥し、クロマトグラフィー-タンデム質量分析までそれぞれ-20 ° C で保存用に 15 μ L の純水を追加します。</li>
</ol>

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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

それは、すべてではない所が同じ利用可能な機器特定のメソッドは、たとえば散のステップを合わせることができるので注意してください。ここで我々 はボルテックスと sonicating、ただし 50 mL の大きいビード ビーターの使用動作を使用します。-105 ° C のコレクターの温度とエアカーテンを使用できない場合は、窒素気流下におけるサンプルを乾かすことができます。また土壌の種類が大きく異なるし、砂、シルト、粘土、泥炭、およびローム (など) を含めることができます、彼らは、pH、塩分、有機物の豊かさによっても変わることができます。柔軟に対応するときに必要な調整を行うことが重要ですので、それぞれこれらの差異のプロトコル上影響を持つことができます。ただし、比と割合が同じままが重要です。
MPLEx プロトコルは、多数の生物学的および環境システムとマルチ弔土壌微生物群集の解析を有効にする機能のアプリケーションの偉大な約束を示しています。多様なシステムの他の抽出のプロトコル MPLEx の前の比較には、ペプチド重複10の高...

炭素循環と気候変動を理解するための重要な含意がある土壌微生物の評価最近の研究はしかし各種土壌中の細菌のゲノムをシーケンスの欠如など検出される蛋白質の多くの未知関数の難しさを強調しています。これらの課題は、1,2,3これまで知られている最も複雑な微生物群集をされている土壌から起因します。メタゲノム、metatranscriptomic、metaproteomic、メタボローム、リピドミクス研究からの結果を組み合わせると、マルチ弔分析は存在中の微生物により深い理解を得るために多数の土壌調査で最近実装されています。環境変動1,4、5のため起きている分子変化について包括的な情報を取得します。マルチ本腰を入れて研究課題の 1 つは質量分析法 (MS)-ベース metaproteomic、メタボローム、リピドミクスの測定通常各 MS の互換性6,7に本腰を入れての特定抽出処理が必要,8,9. これらの正確な手順を作るその実装非常に困難または不可能なときだけのサンプルの数量限定。これらの課題は、方法の検討を同時代謝・蛋白質・脂質抽出 (MPLEx) 小さいサンプル ボリュームまたは固まりを使用して、精度、およびすべての 3 つの解析の高速サンプル準備を提供することができる私たちを求めています。10. までに、これらの目標をすべて達成することができます代替土壌抽出手順がないです。
グローバル マルチ弔単一の土壌サンプルの分析を有効にするには、クロロホルム、メタノール、水分離に基づく有機溶媒抽出プロトコルは利用10だったこのメソッドは総脂質抽出9,11のために開発、最近では単一のサンプル12,13 代謝、蛋白質および脂質の同時抽出のため改正されました。、14,15,16,17,18,19,20,21,22、 23,24,25,26,27,28,29,30より少ないサンプル量を有効にして実験的変動10。MPLEx プロトコルでクロロホルムは異なる画分にサンプル成分の三相の化学分離のための基礎を提供する水と混和性ではありません。トップの水相にはしたがって蛋白質ディスクおよび脂質層の順下クロロホルム段階 (図 1) で親水性の代謝物が含まれます。ほとんどの土に MPLEx を適用すると、微粒子の残骸はサンプリング チューブの一番下で蓄積し、すべてのレイヤーが収集された後に破棄することができます。各土壌の種類が異なる、ただし、泥炭などの高有機質土、土の破片中間層にとどまり、サンプリング チューブの底にも該当しません。MPLEx マルチ弔解析で同じサンプル低下 2) マルチ弔抽出 1) サンプルの少量を使用できるよう、同じサンプルから型複数分子を分離するときにいくつかの利点を提供します全体的に実験的変動と3) より多くのサンプルは、高スループット研究10はるかに速く準備できます。一緒にこれらの利点が評価土壌試料および彼らの複雑な微生物群集のより優れた計測機能を提供するために不可欠です。

<table><tbody><tr><td>クロロホルム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>650498-20°Cで保存されています。C !注意クロロホルムは、急性の潜在的な健康への影響、皮膚の炎症や化学火傷の可能性、呼吸器系への刺激、腎臓、肝臓、心臓に影響を与える可能性があります。適切な保護メガネ、衣服、手袋を着用し、ドラフトで作業します。</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td>は<td>-20°Cで保管されています。C !注意 メタノールは、気道、皮膚、眼の炎症を引き起こし、神経、腎臓、肝臓を損傷する可能性があります。適切な保護メガネ、衣服、手袋を着用し、ドラフトで作業します。</td></tr><tr><td>Millipore</td><td>Milli-Q</td><td></td><td>純水製造装置</td>からの精製水。</tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6026</td><td>!注意:SDSは急性毒性を引き起こし、可燃性です。皮膚、目、気道を刺激するものです。手袋と安全メガネを着用してください。</td></tr><tr><td>土壌タンパク質抽出キット</td><td>MoBio、NoviPure土壌タンパク質抽出キット、Qiagen</td><td>30000-20</td><td></td></tr><tr><td>DL-dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>1M Trizma HCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2694</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td>!注意 TCAは腐食性で毒性があり、皮膚の火傷を引き起こす可能性があります。手袋と安全メガネを着用してください。</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>650501-20°Cで保存されています。C !注意:アセトンは気道や皮膚、目の炎症を引き起こす可能性があります。可燃性の液体と蒸気。安全メガネ、手袋、白衣を着用し、ドラフトで作業します。</td></tr><tr><td>尿素</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>208884</td><td>!注意尿素は目や皮膚を刺激する、手袋や安全メガネを使用してください</td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>フルーカ</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>プロメガ</td><td>V528A</td><td>20&micro;gバイアルビ</td></tr><tr><td>シンコニン酸タンパク質アッセイキット</td><td>ピアス</td><td>23227</td><td></td></tr>ギ<tr><td>酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09735</td><td></td></tr>アセ<tr><td>トニトリル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998</td><td>!注意:アセトニトリルは皮膚や目を刺激するものです。引火性が高い。手袋と安全メガネを着用してください。ヒュームフードで作業します。</td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>!注意 TFAは、皮膚への接触、目への接触、摂取、吸入の場合に非常に危険です。特に目、口、気道の粘膜に組織損傷を引き起こす可能性があります。皮膚に付着すると火傷を負うことがあります。手袋、白衣、安全メガネを着用し、ドラフトで作業してください。</td></tr><tr><td>メトキシアミン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>226904</td><td>!注意 メトキシアミン塩酸塩は、重度の火傷や目に深刻な損傷を引き起こし、皮膚接触による感作を引き起こす可能性があります。安全メガネ、手袋、白衣を着用し、ドラフトで作業してください。</td></tr><tr><td>ピリジン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>270970</td><td>!注意ピリジンは、皮膚や目の炎症、中枢神経系のうつ病を引き起こす可能性があります。蒸気はフラッシュ火災を引き起こす可能性があります。安全メガネ、手袋、白衣を着用し、ドラフトで作業してください。</td></tr><tr><td>N-メチル-N-(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミドと1%トリメチルクロロシラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69478</td><td>!注意 MSTFA + 1% TMCS は、皮膚の腐食、深刻な眼の損傷、および特定の標的臓器の毒性を引き起こす可能性があります。可燃性の液体と蒸気。安全メガネ、手袋、白衣を着用し、ドラフトで作業してください。</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 浄水システム</td><td>ミリポア</td><td></td><td>モデル MPGP04001</td></tr><tr><td>ボルテック</td><td>ス・サイエンティフィック・インダストリー</td>ズ <td>SI-0236</td><td>ボルテックス・ジーニー 2</td></tr><tr><td>プローブ ソニケーター</td><td>フィッシャーブランド</td><td></td><td>モデル FB505</td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>モデル 5810R</td></tr><tr><td>50mLチューブスイングバケットローター</td><td>エッペンドルフ</td><td>A-4-44</td><td></td></tr><tr><td>50mL 固定角ローター</td><td>エッペンドルフ</td><td>FA-45-6-30</td><td></td></tr><tr><td>天秤</td><td>OHAUS</td><td></td><td>model V22PWE150IT</td></tr><tr><td>セロジカルピペットコントローラー</td><td>エッペンドルフ</td><td>12-654-100</td><td></td></tr><tr><td>10mL, 25mL ガラスセロジカルピペット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-678-27F, 13-678-36D</td><td></td></tr><tr><td>サーモミキサーサーモトップ</td><td>付き エッペンドルフ</td><td>5382000015、5308000003</td><td></td></tr><tr><td>0.9 &ndash; 2.0 mm ブレンド ステンレス鋼ビーズ</td><td>NextAdvance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>0.15 mm ガーネットビーズ</td><td>MoBio</td><td>13122-500</td><td></td></tr><tr><td>マグネティックスタープレート</td><td>FisherBrand</td><td>11-100-16SH</td><td></td></tr><tr><td>マグネティックスターバー</td><td></td><td>FisherBrand 14512130</td><td></td></tr><tr><td>pH ペーパーストリップ、pH範囲 0&ndash;14</td><td>FisherBrand</td><td>M95903</td><td></td></tr><tr><td>15mL、50mL円錐形ポリプロピレン遠心分離管</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-103 21-108</td><td>クロロホルム対応</td></tr><tr><td>50mL ボルテックスアタッチメント</td><td>MoBio</td><td>13000-V1-50</td><td></td></tr><tr><td>アイスバケツ</td><td>FisherBrand</td><td>02-591-44</td><td></td></tr><tr><td>27.25x70mm ガラスバイアル</td><td>FisherBrand</td><td>03-339-22K</td><td></td></tr><tr><td>呼吸より簡単なプレート膜</td><td>中西部科学</td><td>BERM-2000</td><td></td></tr><tr><td>アルコールワイプ</td><td>多様化 バイオテクノロジー</td><td>BPWP-1000</td><td></td></tr><tr><td>ヒーターシェーカー インキュベーター</td><td>ベンチマーク、インキュシェーカー ミニ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アナログ ロティサリー チューブ ローテーター</td><td>SoCal BioMed, LLC</td><td>82422001</td><td></td></tr><tr><td>Filter-Aided-Sample-Prep キット</td><td>FASP;Expedeon</td><td>44250</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>Biotek、EPOCH-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>°C フリーザー</td><td>フィッシャー</td><td>13986149-80</td><td></td></tr><tr><td>°C フリーザー</td><td>スターリング 超低温</td><td>SU78OUE</td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive イオントラップ質量分析計</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 7890A ガスクロマトグラフとシングル四重極の組み合わせ5975C質量分析計</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap Velo</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters NanoEquityTM UPLC システム</td><td>マサチューセッツ州</td><td></td><td></td>ミルフォード</tr><tr><td>250mL メディアボトル</td><td>FisherBrand</td><td>1395-250</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターズバイアル</td><td>Waters</td><td>186002805</td><td></td></tr><tr><td>Glass MS サンプルバイアルおよびインサート</td><td>MicroSolv</td><td>9502S-WCV、9502S-02ND</td><td></td></tr><tr><td>ガラスHPLCバイアルとスナップキャップ</td><td>MicroSolv</td><td>9512C-0DCV, 9502C-10C-B</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 96ウェルプレート</td><td>Agilent</td><td>5042-6454</td><td></td></tr><tr><td>大型ガラスバイアル 27.25x70mm</td><td>FisherBrand</td><td>03-339-22K</td><td></td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td>Labconco</td><td>7934021</td><td></td></tr><tr><td>ポリッシュステンレススチールフラットヘッドスパチュラ</td><td>スプーニュラ;FisherBrand</td><td>14-375-10</td><td></td></tr><tr><td>Kim wipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34721</td><td></td></tr><tr><td>XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 &mu;M 4.6x20 mm ガードカラム</td><td>Waters</td><td>186003117、186003064</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1100 シリーズ HPLC システム</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1380-90000</td><td></td></tr><tr><td>1.7mL 遠心分離管</td><td>Sorenson</td><td>11700</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton ガラスシリンジ、5mL、50&micro;Lおよび250&micro;L</td><td>Hamilton</td><td>81517、80975、81175</td><td></td></tr>パス<tr><td>ツールピペットFisherBrand</td><td></td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット電球</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z111597</td><td></td></tr><tr><td>バス超音波処理機</td><td>ブランソン1800超音波洗浄機</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空遠心分離</td>機<td>Labconco Centrivap耐酸性濃縮器システム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroSpinカラム、C18シリカ</td><td>ネストグループ</td><td>SEMSS18V</td><td></td></tr></tbody></table>

マルチ弔土壌試料の分析のための mplex プロトコル

The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

質量分析法 (MS)-ベースの統合された metaproteomic、メタボローム、リピドミクス (マルチ弔) 研究私たちの能力を理解し、環境および生物学的システムにおける微生物群集の特性を変形させています。これらの測定は、最も複雑な土壌微生物の有効な解析結果を有効にしても複雑な微生物システムの日付に知られています。別々 に抽出は通常準備時間と必要なサンプル量を大幅増幅の本腰を入れて研究に必要なのでマルチ弔解析では、ただし、サンプル準備課題を必要は。この制限に対処するため、同じ土壌サンプルから代謝、蛋白質および脂質 (MPLEx) の同時抽出法 3-1 では、溶剤ベースのアプローチの適応によって作成されました。この MPLEx プロトコルは、複雑な土壌サンプルの数量限定に利用する場合も簡単でかつ多くのサンプルの種類、強健をあると証明しました。MPLEx メソッドには、生物的および環境の摂動に起きている変化を評価しながらそれぞれの微生物のコミュニティのメンバーのより良い理解を得るために必要な高速マルチ本腰を入れて測定も大きく有効になります。

カンザス ネイティブ草原土壌 (Mollisol 土) から分子を抽出する MPLEx プロトコルを使用すると、帳票分析結果 3376 ペプチド、105 の脂質および提供 102 代謝物 (すべての一意の識別子)。MPLEx プロトコルは脂質代謝12,13,14,15,16,17,18 の一般的な抽出のために確立されています。 ,,1920,<sup c...

同時に単一の土壌サンプルからの代謝、蛋白質および脂質の抽出、低下したサンプル準備時間を許して、数量限定でサンプルのマルチ弔質量分析を有効にするプロトコルが表示されます。

マルチ弔土壌試料の分析のための MPLEx プロトコル

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and ...

この手法は、プロテオミクス、メタボロミクス、リピドミクスの分野で使用され、環境摂動によって土壌に関連する微生物群集で起こる分子変化に関する包括的な情報を得るのに役立ちます。この手法の主な利点は、単一の土壌サンプルから複数の分析種を取得することで、精度と精度が向上し、サンプル調製の時間と労力が削減されることです。まず、20グラムの土壌サンプルごとに、10グラムを2本の別々の50ミリリットルメタノール/クロロホルム適合チューブに計量します。クロロホルムはほとんどのプラスチックを浸出させ、サンプルを汚染するため、PTFE製のプラスチックチューブを使用してください。各チューブに約10ミリリットルのクロロホルム洗浄ステンレス鋼とガーネットビーズを追加します。次に、氷上で4ミリリットルの冷たい超純水を各チューブに加え、氷のバケツに入ったサンプルをドラフトに移します。25ミリリットルのガラス血清ピペットを使用して、20ミリリットルの氷冷した2対1のクロロホルムをメタノール容量/容量にチューブにすばやく追加します。蓋を締め、土壌混合物を溶液に渦巻きます。クロロホルムメタノールは、原核生物の細胞壁を分解するのを助け、酵素活性を不活性化します。次に、チューブを50ミリリットルのチューブボルテックスアタッチメントに取り付け、可能であれば冷蔵庫内で摂氏4度で10分間水平にボルテックスします。次に、サンプルをマイナス80°Cの冷凍庫に約15分間入れて、完全に冷却します。次に、ドラフト内のプローブ超音波処理器を使用して、6ミリメートル、1/4インチのプローブで60%の振幅で各サンプルを氷上で30秒間超音波処理します。超音波処理後、超音波処理は大量の熱を発生させる可能性があるため、サンプルをマイナス80°Cの冷凍庫に入れます。水平渦巻き、超音波処理、および凍結のステップを繰り返した後、サンプルを4, 000倍の重力と摂氏4度で5分間遠心分離します。この時点で、サンプルは上部代謝物層、タンパク質中間層、および下部脂質層に分離されます。サンプルを氷の上に置きます。次に、ドラフト内で、10ミリリットルのガラス血清ピペットを使用して、2つの50ミリリットルチューブから上部代謝物層を1つの大きなガラスバイアルに移します。次に、50ミリリットルのチューブを少し傾けてタンパク質中間層を放出し、下部脂質層に自由に浮遊するようにします。次に、清潔なステンレス製のフラットヘッドラボ用スパチュラを使用して、両方のタンパク質中間層を慎重にすくい取り、それらを一緒に1つの新しい50ミリリットルチューブに配置します。25ミリリットルのガラス血清ピペットを使用して、下部脂質層を1つの大きなガラスバイアルに移します。20ミリリットルの氷冷メタノールを、破片のある2本のチューブとタンパク質中間層のある1本のチューブに加え

the-mplex-protocol-for-multi-omic-analyses-of-soil-samples

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

我々は、オリゴヌクレオチド結合蛍光ビーズを用いて試料内の微生物の検出のための多重方法を説明します。サンプル内のすべての生物からのアンプリコンは、プローブ結合ビーズのパネルにハイブリダイズさせる。ルミネックスまたはバイオプレックス機器は、ビーズタイプとハイブリダイゼーションシグナルのための各ビーズを照会するために使用されます。...

オリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを使用して複雑な臨床及び環境試料中の細菌の多重検出

リン脂質脂肪酸は土壌微生物群集の構造に関する情報を提供します。我々は、単相クロロホルムの混合物で土壌サンプルからの抽出、固相抽出カラムを用いて抽出された脂質の分画、およびキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析された脂肪酸メチルエステルを生成するためのメタノリシスのための方法を提示します。...

土壌中の微生物のリン脂質脂肪酸の抽出と分析

本研究では、地下水文学、地球化学、および土壌ライシメータの微生物学的異質性を調査するための掘削方法を提示します。ライシメータは、均一の条件で最初にあったと18ヶ月の期間中に灌漑の8サイクルにわたって水の約5000ミリメートルを施した人工hillslopeをシミュレートします。...

結合水文学、地球化学、および微生物学的調査のための土壌ライシメータ発掘

この論文は、多くの試料を用いた研究において土壌微生物群集構造を決定するために、総脂質と指標脂質の相対存在量の両方を特徴づける微生物の細胞膜から脂質を抽出するための努力と正確さとをバランスさせながらスループットを増加させる方法を記載している。...

多数の試料を用いた実験における土壌微生物の同定のための脂質抽出と分析法

シーケンスの生体分子のナノ細孔技術、幅広い病原体、食品安全監視、ゲノム解析、metagenomic 環境の監視、および細菌の特性の識別を含む生命科学で抗生物質耐性。この記事でメタゲノム土壌 DNA...

ナノポア DNA シーケンス メタゲノム土壌分析用

ここでは、土壌、根圏、ルート endosphere 内細菌叢解析・増幅シーケンス...

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

フィールドから植物の根の発掘だけでなく、土壌、根圏、endosphere に試料の加工は、DNA...

実験で多年生の草の根、根、土壌微生物の分離と解析

このプロトコルでは、相補的な分析とオミックス技術の天然有機物と異なる生態系における微生物のプロテオミクスの完全にペアの特性で最高潮に達する単一のスループットについて説明します。この方法は、代謝と環境変化への応答を予測する温室効果ガス生産を記述するため重要な変換を識別するための堅牢な比較を許可します。...

シングル スループット複雑な天然有機物の混合物の評価の補完的な高解像度分析の手法

このプロトコルは、わずか7日間で大量の土壌サンプルから酵母とカビ アスペルギルス フミガーツス を培養する効果的で迅速な方法です。この方法は、実験に必要なさまざまなインキュベーション培地と温度に対応するように簡単に変更できます。...

土壌からの培養酵母・カビの分離による菌群構造調査

ナノ粒子の表面特性は、周囲の媒体との相互作用にとって重要ですしたがって、カーボンナノチューブの表面改質は、多孔質媒体を介したカーボンナノチューブの輸送と保持に重要になる可能性があります。ここでは、ラボスケールのカラム実験を使用して、これらのナノ粒子の輸送と保持の可能性を理解します。...

土壌カラムを通して表面修飾カーボンナノチューブの輸送

学ぶマルチオミクス解析のためのMPLExプロトコル。土壌試料から代謝物・タンパク質・脂質を同時抽出し、環境撹乱下の微生物群集の分子変化を正確に解析します。試料調製時間を短縮し、高精度なデータ取得を実現します。

マルチ弔土壌試料の分析のための MPLEx プロトコル

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