ターミナル媒介 dUTP を使用してニック終わりラベル (TUNEL) とカスパーゼ 3/7 がカエルツボカビ、カエルのメジャー表皮細胞死に試金します。
2018年5月16日
ツボカビの 2 つの方法を使用して、カエルの表皮細胞死を定量化します。まず、臨床的に感染し、感染動物の差異端末媒介 dUTP ニック終わりラベル (TUNEL)その場で組織を使用します。第二に、カスパーゼ 3/7 タンパク質解析を用いた感染症でアポトーシスの時系列分析を行っています。
この実験の全体的な目標は、両生類の真菌病原体である batrachochytrium dendrobatidisがカエルの表皮組織のアポトーシスと細胞死に及ぼす影響を観察することです。この手法は、感染が細胞死を引き起こすのか、逆に感染に対する免疫機構があるのかなど、野生動物の病気を理解するのに役立ちます。この技術の主な利点は、小さな組織生検サンプルに対して実行できるため、感染の過程を通じて小さな個人を繰り返しサンプリングできることです。
この手順を開始するには、テキストプロトコルに概説されているように、サンプル組織を使用して親水性ガラススライドを調製します。組織切片を脱パラフィンするには、スライドをキシレンで3回、コプリンジャーで5分間それぞれ洗浄します。.次に、スライドを100%エタノールで2回、それぞれ5分間洗浄します。
この後、スライドを95%エタノールと70%エタノールでそれぞれ3分間洗浄します。次に、スライドをPBSで1回5分間洗います。実験スライドおよびネガティブコントロールスライドを調製するには、希釈したばかりのプロテイナーゼKをスライドに直接加えて組織を前処理します。
スライドを室温で10分間インキュベートします。次に、スライドをPBSで2回、それぞれ2分間洗います。ポジティブコントロールスライドを調製するには、DNバッファーで組織を前処理し、スライドを室温で5分間インキュベートします。
この後、DNase 1をDN緩衝液に溶解し、最終濃度0.1マイクログラム/ミリリットルにします。調製したDNase溶液をスライドに加えます。スライドを室温で15分間インキュベートします。
次に、スライドをコプリンジャーで蒸留水で3分間ずつ5回洗います。反応をPBS中の3%過酸化水素で室温で5分間クエントします。次に、スライドをPBSで2回、それぞれ2分間洗います。
次に、スライド上の組織に平衡緩衝液を追加します。室温で10秒間インキュベートします。次に、ティッシュ切片の周りの余分な液体を軽くたたいます。
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を反応緩衝液中で希釈します。次に、実験スライドとポジティブコントロールスライドの組織に加えます。加湿チャンバー内で37°Cで1時間インキュベートします。
この後、スライドをストップバッファーの作業濃度が入ったコプリンジャーに入れます。15秒間撹拌し、次いでスライドを室温で10分間インキュベートする。次に、スライドをPBSで3回、それぞれ1分間洗い、余分な液体を軽くたたいます。
次に、室温に予熱した抗ジゴキシゲニンコンジュゲートを組織に直接加えます。スライドを加湿した暗いチャンバーで室温で30分間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、スライドをPBSで4回、それぞれ2分間洗浄します。
余分な液体を軽くたたいてください。次に、スライドに封入剤を追加します。スライド上の封入剤に15マイクロリットルのDAPI溶液を加えます。
各スライドをカバースリップで覆い、マニキュアで密封します。スライドを暗闇で乾かします。蛍光顕微鏡を使用して、スタンディングプロセスが完了したらすぐにスライドを観察します。
各皮膚部分に沿ってランダムな間隔で400回写真を撮ります。DAPI染色した青色細胞をカウントし、動物1匹あたりの皮膚切片あたり少なくとも100個の細胞が見えることを確認します。次に、細胞の縁がはっきりした赤い単一細胞として現れるTUNEL陽性細胞の数を数えます。
まず、倒立型光学顕微鏡を40回使用して、カエルのつま先をそれぞれ撮影します。つま先クリップの端に線を引き、イメージングソフトウェアを使用して形状内の領域を推定します。3次元皮膚サンプルの表面積を評価するには、推定面積にπを掛けます。
凍結したカエルのつま先サンプルからタンパク質を抽出するには、100マイクロリットルのサンプルバッファーと2つのステンレス鋼ビーズが入った1.5ミリリットルのスクリューキャップマイクロ遠心チューブにサンプルを入れます。ビーズビーターを最大速度で使用して細胞を溶解します。この後、チューブを氷の上に3分間置きます。
次に、チューブを遠心分離して上清を回収します。384ウェルプレートでカスパーゼ3/7アッセイを行うには、ブランクとして10マイクロリットルのサンプルバッファーを、トリプリケートで10マイクロリットルのタンパク質抽出物を追加します。次いで、市販のカスパーゼ3/7試薬10マイクロリットルをタンパク質抽出物とブランクウェルにピペットで移す。
次に、プレートを15秒間静かに振って、2つの試薬を混合します。暗所で室温で30分間インキュベートします。最後に、発光プレートリーダーを使用して、サンプルの発光を測定します。
この研究では、感染した動物は、赤またはピンクに染色された細胞で示されるように、対照動物と比較して有意に多くのTUNEL陽性細胞を示しています。対照動物では、TUNEL陽性細胞は少なく、表皮に集中していません。感染した動物では、TUNEL陽性細胞が表皮でより頻繁に発生します。
TUNEL陽性細胞は、感染した細胞の視界に密集し、直接隣接しています。また、表皮上や、真菌病原体が存在していた場所よりも深い表皮層には、より広範なTUNEL陽性細胞が存在します。感染した動物では、3つの皮膚タイプすべてにTUNEL陽性細胞が多く存在し、特に大腿部とベンターの皮膚に高いレベルがあります。
カスパーゼアッセイでは、感染強度はカスパーゼ3/7活性と正の相関があります。さらに、感染した動物と感染していない動物におけるカスパーゼ3/7活性は、時間とともに異なっていました。カスパーゼ3/7活性は、接種後数週間で減少し、その後、感染した動物では7週目の終わりにかけて増加しました。
カスパーゼ3/7活性は、感染していない個人では一定でした。TUNELアッセイの手順を試行する際は、感度の低下を避けるためにアッセイと同じ日にスライドを読み取ること、および色素を保護するためにスライドを冷暗所に保つことが重要です。このビデオを見れば、両生類の皮膚のような小さな組織サンプルで2つの異なる検出方法を使用してアポトーシスと細胞死を検出する方法について十分に理解できるはずです。
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概要
本研究では、両生類に感染する真菌病原体 Batrachochytrium dendrobatidis が、カエルの表皮組織におけるアポトーシスおよび細胞死に及ぼす影響を調査します。TUNEL in situ 組織学的解析および caspase 3/7 タンパク質分析を用いることで、感染と細胞死の間の関係を明らかにすることを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 野生動物疾患
- 細胞生物学
背景
- ツボカビ症は両棲類個体群にとって重大な脅威となっています。
- 細胞死のメカニズムを理解することは、保全活動に役立ちます。
- 真菌感染への応答において、アポトーシスが役割を果たしている可能性があります。
- 少量の組織サンプルを用いることで、感染期間を通じて繰り返し分析を行うことが可能です。
研究目的
- ツボカビ症に感染したカエルの表皮細胞死を定量化すること。
- 感染個体と非感染個体の間におけるアポトーシスの差を明らかにすること。
- 感染中におけるアポトーシスの時間経過を分析すること。
使用した手法
- 組織学的解析のための末端転移酵素介在性dUTPニックエンドラベル法（TUNEL法）。
- 時系列評価のためのCaspase 3/7タンパク質解析。
- 組織サンプルを用いた親水性ガラススライドの作製。
- キシレンおよびエタノール洗浄による組織切片の脱パラフィン処理。
主な結果
- 感染したカエルと非感染のカエルの間で、アポトーシス率に差が観察されました。
- 時系列解析により、感染経過に伴う細胞死の傾向が明らかになりました。
- これらの手法は、微小な組織サンプルの分析において有効であることが示されました。
- 得られた知見は、感染に対する免疫応答の理解に寄与する可能性があります。
結論
- 本研究は、カエル類の子囊菌症が表皮細胞に及ぼす影響に関する貴重なデータを提供するものである。
- この文脈におけるアポトーシスの理解は、野生動物の保護戦略に寄与する可能性がある。
- 今後の研究では、真菌感染に対する免疫メカニズムの解明が期待される。
よくある質問
産業界における重要性
本研究では、アポトーシスアッセイを用いて野生動物の疾患モデルにおける病原体誘発性の組織損傷を評価する方法を実証し、初期段階のターゲット検証におけるメカニズム的なリスク低減のための枠組みを提示します。Batrachochytrium dendrobatidisに感染したカエルの表皮細胞死を定量化することで、本アプローチは宿主と病原体の相互作用を評価する際の予測精度を向上させ、トランスレーショナルなバイオマーカーの探索に寄与します。少量の組織生検を用いることで縦断的なサンプリングが可能となり、これは前臨床システムにおける疾患の進行や治療介入を追跡する上で極めて重要です。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 表皮組織における病原体誘発性アポトーシスと宿主防御機構を区別することにより、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： TUNEL染色による空間的に分解された細胞死データを提供し、感染症モデルにおける組織破壊のメカニズムを明らかにする。
- 予測的価値： caspase 3/7活性を時間経過に伴う感染量と相関させることで、標的への信頼性を裏付け、用量反応および時間的プロファイリングを可能にする。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： 小さな組織サンプルにおけるアポトーシス検出の標準化されたプロトコルを確立し、材料が限られた条件下での再現性のある化合物スクリーニングを可能にする。
- 運用的価値： Caspase 3/7アッセイは、タイムコース実験におけるハイスループット適合性を提供し、TUNEL法はアポトーシスの空間的パターンの検証を可能にする。
- アッセイの即時性： 蛍光顕微鏡およびルミネッセンス読み取りにより、アッセイの最適化およびラボ間での再現性に適した定量的な出力が得られる。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値： 表皮のアポトーシスと疾患の重症度を関連付け、分子的な読み取り値と臨床的な感染進行との間のバイオマーカーの一致を裏付けます。
- 運用的価値： 縦断的研究において、感染段階を通じた caspase 3/7 のダイナミクスを追跡することで、リスク調整された進展決定を可能にします。
- トランスレーショナルな連続性： 組織学的および生化学的なアポトーシスアッセイを組み合わせることで、感染症モデルにおける前臨床的な妥当性をいかに強化できるかを示します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、アポトーシスの読み取り値を提供することで、ターゲットのバリデーションおよびリード化合物の同定に寄与し、特に組織へのアクセスが制限され従来の組織学的解析が困難な研究における初期の探索ワークフローに統合されます。
- 探索生物学： 病原体への曝露が宿主組織においてアポトーシスを誘導または抑制するかどうかの仮説検証を容易にし、組織損傷のメカニズムを明らかにします。
- スクリーニング： Caspase 3/7アッセイにより、小規模な生検試料においてアポトーシスに影響を与える調節因子のスケーラブルで定量的なスクリーニングが可能になります。
- 分析学： 発光および蛍光出力により、異なる条件や時間経過におけるアポトーシスを比較するための定量化および標準化された測定値が得られます。
- トランスレーショナルリサーチ： 分子レベルのアポトーシス活性を組織病理学的変化と相関させ、前臨床モデルにおけるバイオマーカーの適格性評価をサポートします。
- エンタープライズ再利用： TUNEL法とcaspase 3/7アッセイを組み合わせたアプローチにより、感染症および毒性学研究に再利用可能なアポトーシスプロファイリングプラットフォームが確立されます。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 感染組織と対照組織におけるアポトーシスの局在とキネティクスを区別することで、メカニズム上の不確実性を低減します。
- 運用の価値： 標準化されたスライド作成およびイメージングプロトコルにより、研究室間やサンプルバッチ間での再現性を確保します。
- 戦略的価値： 組織ストレスと病原体の影響を示す早期バイオマーカーを提供することで、より早い段階でのゴー/ノーゴー判定を可能にします。
- ポートフォリオへの影響： 疾患メカニズムの機能的リードアウトとしてアポトーシスを定量化し、リスクに基づくターゲットの優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- 組織学的検査、蛍光顕微鏡観察、および少量の組織試料からのタンパク質抽出に関する専門知識が必要です。
- TUNELアッセイおよび caspase 3/7 アッセイを実施するためのクライオスタット、蛍光顕微鏡、およびルミネッセンスプレートリーダーへのアクセスが必要です。
- アッセイの感度を維持するため、組織切片作成、染色のタイミング、およびイメージング設定について、ユーザー間での標準化が必要です。
- 他のモデルシステムに適用する場合は、異なる組織タイプにおける抗体の浸透性と酵素のアクセシビリティを検証する必要があります。
- 実用上の制限：足指先の生検試料は少量であるためタンパク質の収量が制限されます。そのため、抽出液の消費を避けるために、イメージングによる皮膚表面積の推定などの代替的な標準化方法が必要です。
