Name: 合成のバクテリオファージの建設は合わせた多様性と fab 抗体ライブラリーを表示 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: 学ぼう、ファージディスプレイを用いた合成ヒト抗体ライブラリーの構築法。動物免疫を不要とし、治療用モノクローナル抗体開発において従来のハイブリドーマ法に代わる有望な手法です。

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著者は、シンドゥ ラボ クンケルの法合成工場バクテリオファージ図書館建設に批判的なコメントから博士フレデリック Fellouse を感謝しています。著者夫人 Alevtina Pavlenco と高効率電気主務の準備の貴重な助けのシドゥ ラボから他のメンバーに感謝エシェリヒア属大腸菌のセルと高品質デュ ssDNA。この作品は中国の国家自然科学基金によって支えられた (グラント号: 81572698、31771006) DW と ShanghaiTech 大学 (グラント号: F-0301-13-005) 抗体工学研究室に。

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<li>Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+affinity%2C+developability+and+functional+size%3A+the+holy+grail+of+combinatorial+antibody+library+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation.</a> Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).</li>
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</ol>

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電子有能なセル、デュ ssDNA テンプレート、効率性の能力を含む建設プロセスのさまざまな段階を監視する必要がチェック ポイント高い多様性、Fab ライブラリのバクテリオファージ表示、品質管理を構築するにはCCC dsDNA 合成、エレクトロポレーション、Fab 折りたたみと Fab phage クローンの解析から Cdr のアミノ酸の多様性後価。
高収量とデュ ssDNA の純度高い突然変異率のために不可欠です。我々 の経験で一晩 25 ° C でバクテリオファージの誘導は一晩 37 ° C でバクテリオファージの誘導からそれよりもっとデュ ssDNA をもたらすことができます。これは以前のレポート19のと一致しています。SsDNA 抽出に関するスピン キット (QIAprep) の初期のプラスミドはバクテリオファージ溶解とバインディングの MLB を含まれています。その後、MLB は未知の理由で中止、PB に置き換え。デュ ssDNA の収量は MLB の治療からと PB 治療から低くわかった.このプロトコルでは MLB を置き換...

Mab 基礎研究から疾患の診断、治療に至るまで幅広い用途があります。2016 年時点以上 60 Mab は、自己免疫疾患、がん、感染症1,2の臨床治療のためアメリカ合衆国の食品と医薬品管理 (USFDA) によって承認されています。
1975 年ケーラーとミルスタイン、'ハイブリドーマ'、このテクニックと呼ばれる細胞ソースから単一クローンの特異性の抗体の連続的な生成のための技術、薬および企業3 の礎となってその後の報告で ,4。世代この法によるモノクローナル抗体の抗原の生産、マウス免疫、B リンパ球の抽出、不滅のハイブリドーマ細胞、クローンの選択を形成する骨髄腫細胞と治療への応用のための B 細胞の融合など様々 なステップが必要です。人間性がひと抗マウス抗体 (浜)4,5を避けるために必要です。しかし、この技術の毒素や病原体、非常に節約された蛋白質を含む抗原は mAb 生産5生体内で免疫反応をトリガーに比較的有効であります。
1978 年にハチソンらは単一座礁させたファージ ウイルス6残基の直接変異するオリゴヌクレオチドの使用を報告しました。1985 年、スミスは外国の遺伝子断片が III バクテリオファージのコート蛋白質を符号化する遺伝子とフレームに融合することができ、その感染7を損なうことがなくファージ表面に表示することができますはこうしてを報告しました。免疫、世間知らずで抗体のバクテリオファージの表示ライブラリの後続の建設の基礎を築いた先駆これらと合成形作る単一鎖可変フラグメント (scFv) と抗原結合フラグメント (Fab) の形式の治療モノクローナル抗体開発8,9。技術的な観点からバクテリオファージ表示ベースの抗体開発を提供していますいくつかの抗原をもたらすことができます制限を回避することができますハイブリドーマによるモノクローナル抗体開発に相補的なアプローチと、人間化のプロセスハイブリドーマ培養由来の抗体は、5を必要があります。2016 年現在 6 バクテリオファージ表示由来モノクローナル抗体はヒュミラ、リウマチ性関節炎の治療に使用される最も成功したモノクローナル抗体のいずれかを含む市場に承認されているし、多くのバクテリオファージ表示由来抗体の候補者は現在臨床のさまざまな段階で調査10。
免疫と素朴なバクテリオファージの抗体ライブラリ、多様性の相補性決定の地域 (Cdr) 軽鎖重鎖は自然免疫レパートリー (すなわち、B 細胞から) に由来します。対照的に、合成のバクテリオファージの抗体ライブラリの Cdr の多様性は、完全に人工的です。合成ライブラリ構築への配列の多様性のデザインを正確に制御を提供して抗体の構造の解明のための機会を提供して機能の11,12。さらに、大規模な工業開発11,12下流に、容易にするために図書館の建設前に合成ライブラリのためのフレームワークを最適化できます。
1985 年にクンケルは M13 バクテリオファージにサイト指示された突然変異を効率的に導入する一本鎖 DNA 変異のテンプレート ベース アプローチを報告した13。このアプローチは、phage 表示ライブラリの構築のため広く使用された後。化学的に合成した DNA のオリゴヌクレオチド Fab Cdr に多様性を導入するように設計は、抗体のバックボーン テンプレート phagemid に組み込まれます。このプロセスで phagemid はウラシルを含む ssDNA (デュ ssDNA) として表現され、オリゴヌクレオチドは、Cdr に焼鈍、T7 DNA ポリメラーゼと T4 DNA リガーゼの存在下で二本鎖 DNA (dsDNA) を合成する拡張します。最後に、生成された ds DNA は、電気穿孔法による大腸菌に導入することができます。
高い多様性、phage 表示ライブラリ構築、高電圧電気穿孔法と電子有能なセルの二成分混合物の閉じた円形 dsDNA (CCC dsDNA) を慎重に準備されるべき。シドゥらは、従来から大幅に強化されたライブラリ多様性14DNA と電子有能なセルの準備を変更しました。
このプロトコルでは 109-1010単一電気穿孔法を用いて得られる多様性を持つ合成工場バクテリオファージ表示のライブラリの構築手法について述べる.図 1ライブラリ構築などの概要を示します: 1) 高効率電子有能なセルの準備;2) デュ一本鎖 Dna の抽出3) クンケル法オリゴヌクレオチド指示された突然変異誘発;4) エレクトロポレーションとライブラリのサイズの計算5) A/L ベース ELISA のための蛋白質折りたたみと機能の多様性評価;・ 6) 多様性の DNA シーケンス解析。すべての試薬、緊張および機器は、材料のテーブルに表示されます。表 1は、試薬のセットアップを示しています。

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.0 M H3PO4</td><td>Fisher</td><td>AC29570</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M Tris, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>10 mM ATP</td><td>Invitrogen</td><td>18330-019</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dithiothreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4065-60</td>溶液を混合し<td>、dATP、dCTP、dGTP、dTTPをそれぞれ25mM含有します。</td></tr><tr><td>3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン (TMB)</td><td>キルケゴール &Perry Laboratories Inc</td><td>50-76-02</td><td></td></tr><tr><td>50X TAE</td><td>Invitrogen</td><td>24710030</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher</td><td>BP160</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin, carb</td><td>Sigma</td><td>C1389</td><td>100 mg/mL in water,&nbsp; 0.22 &mu;mフィルター滅菌、作業濃度:100 &mu;g/mLです。</td></tr><tr><td>クロラムフェニコール、cmp</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>100 mg/mL エタノール溶液、0.22 &mu;mフィルター滅菌、作業濃度:10 &mu;g/mLです。</td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9620G</td><td></td></tr><tr><td>粒状寒天</td><td>VWR</td><td>J637-500G</td><td></td></tr><tr><td>H2O2 ペルオキシダーゼ基質</td><td>Kirkegaard &Perry Laboratories Inc</td><td>50-65-02</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin, kan</td><td>Fisher</td><td>AC61129</td><td>50 mg/mL in water,&nbsp; 0.22 &mu;m フィルター滅菌、作業濃度:50 &mu;g/mLです。</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4Sigma</td><td></td> <td>94046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>U19C015</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Fisher</td><td>ND2000C</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256</td><td>!注意:NaOHは火傷の原因となります。</td></tr><tr><td>ノンファット粉ミルク</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>A600669</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>フィッシャー</td><td>BP233</td><td></td></tr><tr><td>プロテインA-HRPコンジュゲート</td><td>インビトロジェン</td><td>101123</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep スピン M13 キット</td><td>キアゲン</td><td>22704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick ゲル抽出キット</td><td>キアゲン</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>キアゲン</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>組換えタンパク質 L</td><td>フィッシャー</td><td>77679</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ポリメラーゼ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 ポリヌクレオチドキナーゼ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T7 DNA ポリメラーゼ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0274S</td><td></td></tr><tr><td>テトラサイクリン、テット</td><td>シグマ</td><td>T7660</td><td>50 mg/mL 水溶液、0.22 &mu;mフィルター滅菌、作業濃度:10 &mu;g/mLです。</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher</td><td>0123-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>超高純度グリセロール</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td>エタノール中 25 mg/mL、作業濃度: 0.25 &mu;g/mLです。</td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>VWR</td><td>DF0127-08</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E.coliCJ236</td>ニュー<td>イングランドバイオラボ</td><td>E4141</td><td>遺伝子型: dut-&nbsp;ung-&nbsp;thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr).dU-ssDNAの調製に使用されます。</td></tr><tr><td>E.coli SS320</td><td>Lucigen</td><td>60512</td><td>遺伝子型: [F'proAB+lacIq lacZ&Delta;M15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 &Delta;(araABC-leu)7679 & デルタ;lacX74 galUgalK rpsL thi.高効率のエレクトロポレーションと糸状バクテリオファージの産生に最適化されています。</td></tr><tr><td>M13KO7</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 cm gap electroporation cuvette</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well 2mLディープウェルプレート</td><td>フィッシャー</td><td>278743</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル Maxisorp免疫プレート</td><td>Nunc</td><td>151759</td><td></td></tr><tr><td>バッフルフラスコ</td><td>コーニング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5811000096</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機ボトル</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECM-630 エレクトロポレーター</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マグネティック攪拌子</td><td>ナルゲン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サーモフィッシャー 遠心分離機</td><td>フィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高速シェーカー</td><td>TAITEK</td><td>MBR-034P</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートシェーカー</td><td>QILINBEIER</td><td>QB-9002</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルおよび384ウェル用リキッドハンドラー</td><td>レイニン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mutilチャンネルピペット</td><td>レイニン</td><td>E4XLS</td><td></td></tr><tr><td>アミコン濃縮器</td><td>Merck</td><td>UFC803096</td><td></td></tr></tbody></table>

合成のバクテリオファージの建設は合わせた多様性と fab 抗体ライブラリーを表示

Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity

基礎研究と医学におけるモノクローナル抗体 (Mab) の需要は毎年増加しています。ハイブリドーマ技術は、1975 年にその最初のレポート以来のモノクローナル抗体開発の支配的な方法をされています。代替技術としてモノクローナル抗体開発のバクテリオファージの表示方法は、ヒュミラ、最初のファージ由来の抗体と 1 つのベストセラーの Mab が 2002 年に関節リウマチの臨床治療のため承認されたのでますます魅力的です。非動物ベースのモノクローナル抗体開発技術、バクテリオファージの表示は抗原免疫原性、人間性、および伝統的なハイブリドーマ技術による抗体の開発から必要とされる動物のメンテナンスをバイパスします。このプロトコルでは 109-1010単一電気穿孔法を用いて得られる多様性を持つ合成工場バクテリオファージ表示のライブラリの構築手法について述べる.このプロトコルで構成されています: 1) 高効率電子有能なセルの準備;2) ウラシルを含む単一座礁させた DNA (デュ ssDNA); の抽出3) クンケル法オリゴヌクレオチド指示された突然変異誘発;4) エレクトロポレーションとライブラリのサイズの計算5) 蛋白質 A/L ベース酵素免疫測定法 (ELISA 折りたたみ) と機能の多様性評価;・ 6) 多様性の DNA シーケンス解析。

Fab 抗体ライブラリーの構築のフローチャートを次 (図 1参照)、我々 は M13KO7 ヘルパーに事前に感染するファージ大腸菌SS320 エレクトロ有能なセル準備します。図書館建設のため工場 phagemid バックボーンを使用した場合、これらの電子有能なセルの効率が 2 X 109 cfu/μ g として推定される (図 4)。
ウラシル混入効率比較では大腸菌CJ236 と大腸菌SS320 細胞に抗体価のチェックされました。CJ236大腸菌と大腸菌SS320 細胞は、デュ ssDNA をかくまっているバクテリオファージによって感染しました。大腸菌SS320 は酵素 (dUTPase ・ ウラシル グリ...

このプロトコルでは、合わせた多様性を持つ合成抗体のバクテリオファージの表示ライブラリの構築の詳細な手順について説明します。合成抗体は、病気の診断、治療に基礎研究から広範なアプリケーションを持っています。

Demand for monoclonal antibodies (mAbs) in basic research and medicine is increasing yearly. Hybridoma technology has been the dominant method for mAb ...

この手順の全体的な目標は、読者に、カスタマイズされた多様性を備えたファージディスプレイ合成ヒト抗体ライブラリの構築に関する詳細な実践的な経験を提供することです。合成ファージディスプレイ抗体ライブラリーは、動物免疫とその後の抗体ヒト化の必要性を回避することにより、従来のハイブリドーマベースの治療モノクローナル抗体開発技術を置き換える大きな可能性を秘めています。合成抗体ライブラリーの利点は、高い親和性相互作用と望ましいタンパク質特性をサポートする位置の多様性に関する洞察を使用して、カスタマイズされた多様性を抗体フレームワークに導入できることです。実用的な有用性を超えて、合成抗体ライブラリーは、生体分子相互作用における特定のアミノ酸の役割を実験的に調べるためにも使用でき、したがって、それ自体の継続的な改善をサポートします。この手順は、私たちの研究室の大学院生Zhenwei ZhongとShin-chen Hou博士によってデモンストレーションされます。になる

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオでは、標的タンパク質に対して高い親和性でタンパク質を発現する遺伝子組み換え済みファージを単離するファージディスプレイ技術を実演します。...

ファージディスプレイを用いて標的タンパク質に高い親和性を持つタンパク質を選択

ファージディスプレイは、関心対象の固定化分子と相互作用するタンパク質又はタンパク質部分をキャプチャするための強力な技術である。作成するファージcDNAライブラリーの種類や画面の決定がなされると、ここで説明するプロトコルは、相互作用物質の同定をもたらす効率的な親和性選択を可能にする。...

組換えタンパク質ベイトを用いてファージディスプレイおよび親和性選択のためのプロトコル

この方法は、同時に、抗原の何百に対するファージディスプレイコンビナトリアル合成抗体ライブラリーから、スケーラブルで高スループットの選択を行うための視覚的な伴奏して説明する。このパラレルアプローチを使用して、我々は、標準的な免疫アッセイにおいて機能的に多様な抗原に対する高い親和性および特異性を示す抗体断片を単離した。...

ファージディスプレイされた合成抗体ライブラリーから、スケーラブルな高スループットの選択

無細胞転写・翻訳プラットフォームの新世代は、生化学システムの in vitro遺伝子回路の実行を構築するために設計されています。この記事で私たちはすべて大腸菌無細胞 TXTL システムを使用して彼らのゲノムからのバクテリオファージ MS2、ΦΧ174、T7...

大腸菌の伝染性のバクテリオファージの合成による無細胞発現系

説明されているプロトコルは、建設、特性および DNA の任意のソースから作られた"domainome"ライブラリの (好みのターゲット) に対して選択を許可します。さまざまな技術を組み合わせた研究パイプラインにより、これ: バクテリオファージの表示、折りたたみ記者とシークエンサー データ解析のための web...

インタラクトーム Seq: Domainome ライブラリーの構築、検証およびバクテリオファージの表示と次世代シーケンシングによる選択のプロトコル

任意の与えられた低分子リガンドに対して所望の親和性および特異性を有する化学的に誘導されたタンパク質二量体化システムを作成することは、多くの生物学的センシングおよび作動アプリケーションを有するであろう。ここでは、ファージディスプレイコンビナトリアル単一ドメイン抗体ライブラリーの段階的選択を介した化学的に誘導された二量体化システムのde...

組み合わせ単一ドメイン抗体ライブラリーの段階的ファージ選択による高特異的化学的誘起タンパク質二量体化システムの作成

ユビキチン化は翻訳後修飾の重要なタンパク質であり、その中で多くのヒト疾患に関与している調節不全である。このプロトコルは、ファージディスプレイを使用して、ユビキチン化の特異性、効率、パターンを制御するE3リガスの活性を結合および調節できる新しいユビキチン変異体を分離する方法を詳述する。...

ファージディスプレイを使用してE3リガーゼ用ユビキチンバリアント変性変性器を開発する

優先細菌性病原体の同定のための簡単​​な方法は、遺伝子組み換えレポーターファージを使用することです。その特定の宿主種に固有のこれらのレポーターファージは、、急速に宿主細胞に生物発光信号応答を伝達することが可能です。ここで、我々は、検出のためのレポーターファージの使用について説明します。...

カテゴリの検出細菌性病原体のための&quot;生物発光&quot;レポーターファージ

このプロトコルは、自動化された蛍光タイムラプス顕微鏡を用いて時間の異なる細菌の単セルの動作を監視するためにステップバイステップ手順を提供します。さらに、我々は、顕微鏡画像を分析する方法のガイドラインを提供します。...

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

私たちは、環境ウイルスのコミュニティから一本鎖DNA、二本鎖DNAとRNAの分子を分離する効率的な方法を説明します。核酸はリン酸含有緩衝液の濃度の増加とともにヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて分画する。このメソッドは、環境サンプルからすべてのウイルス核酸の種類の分離を可能にします。...

ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いた環境ウイルスのコミュニティから一本鎖DNA、二本鎖DNAとRNAの分離

学ぼう、ファージディスプレイを用いた合成ヒト抗体ライブラリーの構築法。動物免疫を不要とし、治療用モノクローナル抗体開発において従来のハイブリドーマ法に代わる有望な手法です。

合成のバクテリオファージの建設は合わせた多様性と fab 抗体ライブラリーを表示

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