腎組織のプライマリ セグメントと新規スキャフォールド フリー構造技術と定款の
2018年3月27日
腎構造の組織設計は、臓器不足や透析の有害な影響のためのソリューションを提供します。ここでは、マイクロ プロトコルについて述べるマウス腎臓皮質延髄セグメントの分離を解剖。これらのセグメントは、腎オルガノイドを形成、細胞スキャフォールド フリー構造に注入されます。
この顕微鏡的解剖手順の全体的な目標は、組織工学アプリケーションのために、生体腎組織の離散的なセグメントを無傷の腎構造で分離することです。この方法は、孤立した一次臓器組織の全セグメントを無菌的に採取し、培養で生かし続けることができるかなど、組織工学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞株を使用して26種類以上の異なる細胞タイプを持つ複雑な臓器を再現するのではなく、セグメントに無傷の腎構造が含まれていることです。
この技術の意味は、これらの構築物が濾過を改善し、患者が透析から離れるのを助ける可能性があるため、末期腎疾患の治療にまで及びます。手術中は、汚染のリスクを最小限に抑えるために、マスクやキャップなどの適切な手術用具を着用してください。同様に、全体を通して無菌性を維持するためにあらゆる努力をしてください。
手術台をドレープして準備を始めます。次に、オートクレーブ滅菌された器具のパックを滅菌ドレープに開けます。それらには、3つの小さな止血剤、歯のある細かい鉗子、歯のない細かい鉗子、およびまっすぐな虹彩はさみが含まれている必要があります。
手術台の中央を2つ目の穴あき手術用ドレープで覆います。手術室を設置する前に、50ミリリットルの抗生物質を添加したDBPSを準備し、5ミリリットルを15ミリリットルのチューブに分注します。次に、生後8〜12週間のC57ブラックシックスマウスに麻酔をかけ、つま先をしっかりとつまんでペダル反射を評価することにより、麻酔のレベルを定期的に監視します。
次に、脱毛クリームを使用して腹側胴体部分の毛をすべて取り除き、蒸留水でクリームと髪を洗い流します。次に、マウスを手術台に移し、穴あきのないドレープの下に仰向けに置きます。次に、マウスの腹部の上のドレープに2センチ四方の開窓を切り取ります。
次に、露出した皮膚をポビドンヨードでこすり、続いて70%エタノールで3回こすり、皮膚を滅菌し、手術の準備を完了します。歯と虹彩はさみ付きの細い鉗子を使用して手術を開始します。正中線の左1/2センチメートルの正中線に平行な3〜4センチメートルの皮膚切開を行います。
次に、歯のない細い鉗子で腹膜をつかみ、虹彩ハサミで切開して腹腔内に入ります。次に、皮膚と腹膜の上端と下端に止血剤を適用して、横方向に張力をかけ、露出を高めます。次に、腸の内容物を腹部の右側に繊細に移動し、左腎臓を露出させます。
次に、腎臓にトラクションをそっと置き、腹部から持ち上げます。次に、腎臓の門全体に止血剤を配置し、虹彩はさみを使用して尿管と腎血管を横断します。次に、腎臓を氷上の1%ペン連鎖球菌DBPSのチューブに移します。
このチューブを滅菌培養フードに持って行き、処理します。そこで腎臓を60ミリメートルのペトリ皿に移し、カルシウムとマグネシウムを含む新鮮な5ミリリットルのDPBSで2回すすぎます。2回目の洗浄後、新しい60ミリメートル皿に新しい5ミリリットルのDBPSで腎臓を懸濁します。
次に、後で使用するために、5ミリリットルのDBPSのみを含む追加のシャーレを準備します。汚染リスクを最小限に抑えるために、滅菌手袋、サージカルマスク、フワフワなどの滅菌技術を引き続き使用してください。次に、ステージ領域と実体顕微鏡の周囲をドレープします。
次に、顕微鏡のフォーカスノブにプラスチックの粘着シートを置き、70%エタノールをスプレーします。次に、デュアルグースネックイルミネーターをオンにしてステージを照らします。次に、滅菌ドレープの上に、歯のない細かい鉗子、メスのハンドル、15番のメスの刃、2つのストレート止血器、および2つの30.5ゲージの中空穴針を含む滅菌器具のパッケージを開きます。
15番のブレードをメスのハンドルに置き、各ニードルアダプターハブに1つの止血器を取り付けて、ニードル解剖器具を作成します。次に、腎臓がDPBSにあるディッシュとDPBSのみの2つのディッシュを顕微鏡領域に移します。腎臓皿の蓋を外し、顕微鏡を腎臓の前面または後面に3.2〜4倍の倍率で焦点を合わせます。
次に、利き手ではない手で、歯のない細い鉗子を使用して、腎臓の下極と上極の皿に腎臓を突き刺して固定します。次に、利き手で、15番のブレードを使用して、露出した表面から半透明の繊維状被膜層を取り除きます。腎臓表面の露出面から最も表面的な0.5ミリメートルを剃り、カプセルの残りの部分を取り除きます。
続けて、15番のブレードを使用して、約2平方ミリメートルのカプセル化解除された領域から組織の逆ピラミッドを解剖します。次に、組織をDBPSのきれいな皿に移し、腎臓の残りの部分を廃棄します。次に、解剖された組織に焦点を合わせ、倍率を1.5〜2.0倍に下げます。
2つの止血針器具を切削工具として使用して、組織セグメントが針先のサイズ以下になるまで、組織断片を徐々に小さくスライスします。約50のセグメントを制作する必要があります。これは、手順の重要な部分です。
各セグメントは、拡散を妨げる可能性のある大きなセグメントを避けるために、30-1 / 2ゲージの針先の直径に近づける必要があります。組織を組織培養フードに戻し、P1000マイクロピペットを使用してDPBSを取り外してください。次に、10%ウシ胎児血清と1%ペン連鎖球菌を添加した5mmのDMEMを再び加えます。
その後、すぐに組織を培養するか、細胞構築物内に移植します。記載された手順によって産生された無傷の腎セグメントの生存率を、生存率アッセイを使用して培養中で3日間にわたって調べました。緑色蛍光カルシウムAMは、生細胞を示す細胞内エステラーゼ活性を伴って存在します。
赤色蛍光エチジウムホモダイマー-1は、原形質膜の完全性が失われた状態で見られます。腎セグメントを足場のない内皮線維芽細胞構築物に埋め込むと、3日目までに細胞構築物に組み込まれて無傷の構造が形成されました。コンストラクトは、von Willebrand因子による標識によって示される血管前内皮ネットワークを維持しました。
腎上皮細胞は、サイトカテン-18で標識された緑色で見ることができます。体外腎機能試験のため、構築物をFITC標識アルブミンとインキュベートしました。埋め込まれた腎組織のセグメントから離れた場所にはアルブミンが残存していましたが、腎尿細管上皮細胞にもホットスポットが見られました。
これらのホットスポットは、管腔内を横断するアルブミンであり、腎臓セグメントの細胞構築物におけるアルブミンの再取り込みを表していると考えられています。このビデオを見れば、組織工学の応用のためにマウスの腎臓から腎臓セグメントを分離する方法を十分に理解できるはずです。一度習得すると、この手順は1〜1時間半で完了します。
この手順に続いて、腎コンストラクトの作製および特性評価に関する他の疑問に答えるために、細胞化コンストラクトの播種を含む他の方法を実施することができる。手術器具や加圧酸素ボンベでの作業は非常に危険であることを忘れないでください。鋭利なものを扱うときは注意し、酸素ボンベを実験室のベンチに固定することを忘れないでください。
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概要
本記事では、組織工学への応用のために、皮質・髄質セグメントを分離するためのマウス腎臓の微小解剖プロトコルを紹介します。分離されたセグメントは、完全な腎構造を維持しており、臓器再構築における従来の細胞株に代わる有望な選択肢となります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 組織工学
- 腎生物学
- 臓器構築物
背景
- 臓器不足と透析による合併症のため、革新的な解決策が必要とされています。
- 効果的な組織工学には、完全な腎臓の構造が不可欠です。
- 初代臓器組織セグメントは、臓器の機能と修復に関する知見を提供します。
- 本手法は、治療への応用に向けた腎臓構築物の生存性を向上させることを目的としています。
研究の目的
- 生存している腎組織セグメントを単離するための無菌的な手法を開発すること。
- 組織工学におけるこれらのセグメントの有用性を評価すること。
- 解剖中の臓器構造の維持における課題に対処すること。
使用方法
- マウス腎臓の顕微鏡下解剖。
- 皮質・髄質セグメントの単離。
- スキャフォールドフリー細胞構築物への移植。
- 手技全過程における無菌状態の維持。
主な結果
- 構造を維持した状態で腎臓セグメントの分離に成功した。
- 分離したセグメントは、培養および実験において生存能を維持した。
- 腎構築物におけるろ過機能向上の可能性がある。
- 末期腎不全の治療法の進歩に寄与する。
結論
- この手法は、腎組織工学に対する新しいアプローチを提供します。
- 機能的なオルガノイドを実現するには、腎臓の構造を維持することが不可欠です。
- 今後の応用により、透析の代替案に大きな影響を与える可能性があります。
よくある質問
産業界への適用可能性
この手法により、構造を維持した生存腎組織セグメントの単離が可能となり、前臨床段階での腎構築物開発に向けた生物学的に妥当なシステムが提供されます。天然の皮質髄質構造を保持することで、組織工学を用いた腎治療におけるメカニズムのデリスキング（リスク低減）を支援します。本アプローチは、末期腎不全に対する介入における複雑な臓器機能のモデリングという、トランスレーショナルなギャップを解消するものです。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 天然の構造的コンテキスト内での腎セグメント機能の解析を可能にする。
- 実用的価値： 構築物の統合における仮説検証のため、無菌で生存可能な一次組織を提供する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 機能評価のためのアルブミン再取り込みホットスポットなどの定量的な出力を生成する。
- 運用上の価値： 再現性のある構築物播種のための標準化されたセグメント調製を支援する。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： ろ過および再吸収経路のモデル化に不可欠な皮質髄質構造の完全性を維持する。
- 運用の価値： 血管新生研究のためのスキャホールドフリー構造体への迅速な組み込みを容易にする。
パイプラインおよびワークフローの統合
機能的検証に先立ち、前臨床段階の腎臓構築物を構築するための、ディスカバリー段階のイネーブリングステップとして、単離された腎臓セグメントを配置します。
- 探索生物学：無傷の一次セグメントを用い、組織レベルでの腎機能に関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：構築物とホストの統合およびろ過能を評価するための、アッセイ可能なセグメントを提供します。
- 分析：生存率アッセイやアルブミン輸送指標を含む、構造的および機能的なリードアウトを提供します。
- トランスレーショナル研究：セグメントの生存性と、透析に関連するモデルにおける前臨床構築物の性能を関連付けます。
- エンタープライズ再利用：反復的な腎構築物設計のための、再利用可能な組織調達方法を確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 解離細胞系と比較して、天然の腎臓組織構造を維持することで、メカニズム上の曖昧さを低減します。
- 運用上の価値： セグメントサイズ（200-300 μm）の標準化を可能にし、構築物の播種における一貫性を確保します。
- 戦略的価値： 初期段階の統合を検証することで、腎臓構築物開発におけるgo/no-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響： 原組織を用いたスキャフォールドフリー（足場を用いない）アプローチの、リスク調整後の優先順位付けをサポートします。
実施上の考慮事項
- 無菌的なマイクロサージェリーおよびげっ歯類の腎臓解剖学に関する専門知識が必要です。
- 実体顕微鏡、精密器具、および無菌領域の維持に依存します。
- 生物学チームと工学チーム間でのセグメントの品質管理のため、チームを横断した標準化が必要です。
- 適応に関する検討事項には、種特異的なセグメントのサイズ設定およびコンストラクトの適合性が含まれます。
- 実用上の制限として、セグメントの生存可能期間および新鮮なドナー臓器への依存が挙げられます。
