Name: 篩部と半翅目昆虫の植物 sap 供給の RNA 干渉を誘発する二本鎖 RNA の経口配信方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学ぶ 篩部と半翅目昆虫への経口dsRNA配信法。植物維管束を介したRNA干渉誘導技術で、害虫防除における遺伝子サイレンシングの効果と環境配慮型バイオ農薬の応用可能性を解明する。

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作者は感謝して実験のため BMSB と HB を提供し、植民地の維持のドナルド ・ ウェーバーとミーガン ハーリヒ (アルス ベルツヴィル, メリーランド、米国農務省) を認めるマリア ・ T ・ ゴンザレス、サルバドール p. ロペス、(米国農務省、アルス、フォート ピアス、フロリダ) と植民地維持、試料調製及び分析ジャッキー ・ l ・ メッツ (フロリダ大学、フォート ピアス、フロリダ)。

1. BMSB 飼育
<ol><li>標準的なラボ実習と説明した63あたりリア BMSB 昆虫。</li>
	<li>グラスハウス (22 ° C) と自然光で柑橘系のアジサイの ACP (黒点) 昆虫を上げます。大人の ACP を使用、約 5-7 日で羽化を投稿します。</li>
</ol>2. 各種遺伝子領域、dsRNAの試験管内合成
<ol><li>以前に発行されたトランスクリプトームのプロファイル32から BMSB に特定の遺伝子を選択します。</li>
	<li>選択した関心領域によって異なります 200 に 500 塩基対を確認します。</li>
	<li>ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) ゲノム DNA からの興味の選択した遺伝子に関連付けられているフラグメントを生成する次の条件を使用してを実行します。遺伝子特定のオリゴヌクレオチドの表 1を参照してください。<ol>
<li>PCR の反作用: 0.25 mL PCR チューブ PCR バッファー、dNTP (2.5 mM) の混合物の 4 μ L、2 μ L の DNA のテンプレート (50 ng/μ L)、プライマー 1 と 2 (10 μ M)、0.25 μ L の DNA ポリメラーゼ (5 U/μ L) の 2.5 μ X 10 の 5 μ L を組み合わせる、DNase/RNase フリー水最大 50 μ L とします。</li>
		<li>PCR 条件: サイクル 3 分 10 98 ° C の 30 サイクルによって続いて 95 ° C で関心領域を増幅する PCR 反応 s、55 ° C、30 秒、1 分加温追加 10 分 PCR 反応を用いた浄化のための 72 ° C で反応のための 72 ° C、浄化キットです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>遺伝子特異的プライマーの T7 RNA ポリメラーゼのプロモーターと並ぶとさらに得られた PCR のフラグメントを増幅 (5'-GAA TTA ATA CGA CTC 法 ATA GGG アガ-3') として言及以前62。</li>
	<li>RNAi のため (もどき) のネガティブ コントロールとして LacZ 遺伝子を使用します。 注: LacZ β-ガラクトシダーゼ (使用されるプライマーは、表 1に示す) Escherichiacoli genomic DNA からの増幅をエンコードする遺伝子であります。</li>
	<li>説明以前62dsRNA を生成するための in vitro転写を実行します。</li>
	<li>解散し 150 μ L DNase/RNase 自由水の結果の dsRNA を再懸濁します、濃度、測定、将来使用するため-80 ° C で保存します。</li>
</ol>3. dsRNA 使用緑豆の配達
<ol><li>選択早く 4th齢 BMSB 幼虫から同じ孵化卵の質量と dsRNA を供給する前に 24 時間それらを飢えさせます。</li>
	<li>細長い認定有機緑豆 (インゲンL) を選択し、5 分 0.2% ナトリウム次亜塩素酸溶液で洗浄します。 注: 細長い緑色の豆は、豆は 2 mL の遠心管で容易に収容することができますので、選ばれました。</li>
	<li>DdH2O 3 回を洗浄し、乾いた空気で乾燥させて。</li>
	<li>きれいなかみそりの刃を使用した 7.5 cm の長さの合計に萼の端から生豆をトリムします。</li>
	<li>制御ソリューションの 300 μ L を含むキャップレス 2 mL 遠心チューブ内洗浄とトリミングされた緑色の豆を浸す (、1:10 緑の食品着色料の希釈 (成分: 水、プロピレング リコール、Fd & C 黄色 5、Fd & C ブルー 1、および、プロピルパラベン防腐剤))。</li>
	<li>[生体外の作る希釈希釈 5 μ g または 0.017 μ g/μ L または 0.067 μ g/μ L の最終濃度をそれぞれ生成するため RNase/DNase 自由水の 300 μ L で 20 μ g が英領バージン諸島、JHAMT、LacZ の二本を合成しました。</li>
	<li>キャップレス 2 mL 遠心管内の dsRNA ソリューション (ステップ 3.6) から 300 μ L の洗浄とトリミングされた緑色の豆を浸します。</li>
	<li>ラップし、dsRNA 溶液の蒸発を避けるために、動物が遠心管に入るを防ぐために浸漬豆を囲むマイクロ遠心チューブ用のエッジをシールします。</li>
	<li>毛管作用によって緑豆でロードする dsRNA ソリューションを許可する 3 時間室温で直立した方法でこれらの管を配置します。</li>
	<li>きれいな培養容器 (ポリプロピレン) にこれらの管を配置します。場所 3 には、培養容器で 4th齢 BMSB 幼虫が餓死しました。</li>
	<li>緑色食品の着色や dsRNA の溶液で 3 つの緑色の豆を含む各培養器あたり 3 つの動物を扱います。25 ° C および 72% の相対湿度、インキュベーターで 16 L: 8 日長下で昆虫を維持します。</li>
	<li>緑豆 (浸漬および dsRNA を吸収) を餌に昆虫は、5 日ですが 3 日後 dsRNA 治療緑ビーズの新鮮な食事を補充します。</li>
</ol>4. リアルタイム定量解析の式以下 RNAi 仲介におけるジーンサイレンシング BMSB (qPCR)
<ol><li>QPCR による RNAi の転写産物発現レベルに及ぼす影響を測定します。</li>
	<li>DsRNA 扱われる動物からの総 RNA を分離し、62の cDNA を合成します。</li>
	<li>リアルタイム PCR システムおよび表 1に示すプライマーを用いた qPCR 反応をセットアップします。次の qPCR サイクリング条件を使用: 95 ° C, 10 分後 40 サイクル 95 ° C の 15 s、95 ° C、15 を含む解離ステップと一緒に、1 分の 60 ° C s、60 ° C で 1 分、95 ° C、15 s、と 60 ° C で 15 秒。</li>
	<li>QPCR 基準を決定する: 定量化のための参照基準として通常の動物から分離された総 RNA からの cDNA のシリアル希薄を使用します。</li>
	<li>内部標準として BMSB 18 s RNA を使用して、組織の32から RNA 回復の違いを修正します。</li>
</ol>5 大きな鉢植えな柑橘類の木々 の苗葉面散布アプリケーション
注: カンキツ品種 'カリーゾ' トロイヤーシト (Citrus sinensis XPoncirus カラタチ、ミカン科) の植物は、自然光と温度、1.2 L の容器で栽培温室で維持されました。植物は、'フラッシュ' と呼ばれる葉新芽の生育を促進するために常に剪定。ACP はフィードと柑橘類64の新しい成長の産卵することを好みます。
<ol><li>植物または苗を選択し、土壌を乾燥湿気しますが、完全に乾燥していないように使用前に 2-3 日間それらを水はありません。</li>
	<li>(図 4 a) の下のキャノピーに dsRNA 液 (0.5 mg/mL) の 200 mL を適用手ポンプ スプレー ボトルを使用しています。 注: の上記準備 DNase/RNase 自由水の dsRNA ソリューションを言及しました。</li>
	<li>アプリケーションをスプレー後、葉が完全に吸収されるまで適用された dsRNA ソリューションを許可します。 注: 柑橘類の木の吸収応用 dsRNA と、いずれかの新しい成長、またはアプリケーションの前に覆われていた枝から葉が抽出されました。dsRNA は qPCR を使用して検出された、3-4 h44,45,46でツリーの一番上の天蓋の葉に全身の動きを示した。</li>
	<li>後 25-40 日を集めることによって 4 つの枝の先端から約 10 葉以前突破した木から新たな成長をサンプルします。総 RNA を抽出し、逆転写 PCR (RT-PCR) による分析と qPCR プライマーを用いた応用 dsRNA トリガーの有無を表 1 に示す、前述方法46。 注: サンプル コレクション、合計の RNA の隔離、RT-PCR 法と qPCR 行った前述46として。</li>
	<li>同様に、苗や小さな鉢植えのツリーの葉の下部の領域に局所的に 10 mL dsRNA をスプレーします。 注: 半翅目昆虫 (ACP および GWSS) 24 h で通常餌のアクセスを与えられた、新しい成長 (葉)、ない直接散布、または、育った数週間後、または全体の植物の治療法を掲載します。これは 3、6、および 10 日 dsRNA の正のテストするポスト餌昆虫を作り出した。</li>
</ol>6. 土/根施肥大規模なまたは小さな鉢植え柑橘類の木々 と苗
<ol><li>植物や苗を選択し、2-3 日はなく減衰させるため乾燥土壌をように使用する前にそれらを水は完全に乾燥 (これは適用する液を保持する空気スペースを作成します)。</li>
	<li>大きく鉢植えな植物 (約 2.5 m) の土に dsRNA 溶液 (0.2 mg/mL) 1 L、1 h 後 (チェイサー) 水 1 リットルを追加します。</li>
	<li>部分的に乾燥した土で鉢植え身長 1 m の土に dsRNA 溶液 (1.33 mg/mL) 100 mL 木を適用します。</li>
	<li>小苗の円錐形の土または裸の根 (図 4 b, C) dsRNA 溶液 (1 mg/mL) 10 mL を適用します。</li>
	<li>植物として 30 分間浸漬する土壌潅注の際適用 dsRNA ソリューションを受け取ることを許可します。大きな鉢なら > 1 ガロン (黄色の容器の植物のため 20 mL) または 100 mL の根によって吸収を支援するために普通の水の唯一の治療法を適用します。 注: 検出結果葉に局所的に適用される dsRNA 3 6 h 記事トリートメント、木を通して全身の動きを示す内枝のほとんどの遠位先端。60 〜 90 日のポスト処理で dsRNA の成長の新しい枝が陽性。挿し餌生物検定44dsRNA 昆虫 (ACP および GWSS) を提供しています。</li>
</ol>7 大きな鉢植えな柑橘類の木々 の苗幹タップ (木樹幹注入) アプリケーション
<ol><li>新しい、または約 3.5 年の古い植物幹細胞を用いた注入するためタップ (トランク注射) メソッドは、柑橘類の苗を選択します。</li>
	<li>ドリルと 2 cm 以上、幹の直径の約半分を超えないよう注意して取って、10 mm のドリルビットを使用して柑橘類の植物の穴をドリルします。</li>
	<li>4-6 回先端付近の漏れを防止するフィルム シールの 0.6 cm (1/4 インチ) 広いストリップと各インジェクターの銅の先端を包みます。</li>
	<li>DNase/RNase 自由水で希釈した dsRNA ソリューションの 6 mL (1.7 mg/mL) とツリー トランク インジェクターを埋める (示されるここでは着色溶液として)。</li>
	<li>木の幹に薬液を注入し、dsRNA ソリューションの吸収を許可する 6-10 h のトランクにインジェクターを残します。3、10、30 日後の治療で扱われた木から挿し木を餌に昆虫を許可します。 注: トランク注入法を用いた注入 dsRNA 木の 30-60 日41,42,44の期間の永続化。RNAi のため検証は qPCR表1 プライマーを使用して実行されます。</li>
</ol>8. dsRNA 昆虫を介して土壌への配信処理クレイ顆粒
<ol><li>地下鉄で 35 mL マーク (吸収性粘土の約 30 g) 50 mL コニカル チューブに吸収性の粘土を注ぐ。</li>
	<li>すべての吸収をウェットにチューブに DNase/RNase 自由水 (100 μ g/mL) で希釈した dsRNA 溶液 20 mL を注ぐ。キャップ円錐管、空気を除去するためにチューブをヒントし、チューブをキャップします。</li>
	<li>チューブを縦置きにして、ソリューションを吸収する粘土粒子の 1-2 分放置しましょう。</li>
	<li>1 ガロン ポットを埋めるため土壌ミックスに十分な dsRNA 浸漬の粘土を追加します。</li>
	<li>混合し、土壌に dsRNA 浸した粘土を徹底的にミックスに手で土を回します。</li>
	<li>DsRNA 治療選択の苗を植え替えることにこの土を使用します。</li>
	<li>水 dsRNA のない普通の水の 200 mL の土壌。1 時間 30 分後に普通の水 100 mL で従ってください。24 h 後通常水まきのスケジュールに植物を置きます。</li>
	<li>最も新しい植物成長の葉を集めることによって粘土の吸着剤と dsRNA 扱われた鉢植えの 4-6 葉 dsRNA の各 1 ヶ月後の治療をテストします。 注: 植物またはこれらの処理植物からの切断うんざりしている昆虫にいつでも 24 時間治療の記事し、昆虫 (未発表データ) への年まで配信の RNAi にできた後。</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

RNAi は、遺伝子生物学的機能と規制の害虫19,68,69,70,の管理のために利用するための大きな可能性を探索するための重要なツールであること証明されています71. デザインおよび特定の昆虫種の虫に対応する dsRNA(s) の配信方法を黙らせるための適切な遺伝子の選択が最も重要なの両方です。昆虫に dsRNA を配信する最適な方法は長所とその他の制限を提供するかもしれない特定のメソッドとして配信、相対的な線量の選択と共にの経験的に決定する必要があります。環境リリースに適して可能性があります最終的に分子 biopesticide の開発、実現可能な効率的で有利な配信方法が必要です。たとえば、局所的に適用される dsRNA は柑橘類に防虫のブドウ42,</...

半翅目の昆虫は、高い人口成長を達成し、植物の病気を広める能力を agriculturebecause の最も経済的に重要な害虫の一部を構成します。BMSB、 H. 越冬態は 1996年1で報告された最初の目撃にアジア (中国、台湾、韓国、および日本) からペンシルベニア州アレンタウンで西半球で偶然持ち込まれた外来の害虫です。導入以来、BMSB 43 の州で最高の人口だけでなく、カナダ、ヨーロッパ、大西洋 (デ、MD、ペンシルバニア、ニュージャージー州、バージニア、およびウェスト バージニア州) で検出されました、そして農業2へ潜在的な脅威を表します。食性の害虫として BMSB は、リンゴ、ブドウ、観賞植物、種子作物、大豆、トウモロコシなどの高付加価値の作物を含む約 300 の識別された植物ホストへの損傷をしかけることができ。主に動物と維管束組織2,3から栄養素にアクセスを得るために、針のようなスタイレット ホスト作物を貫き、裂くとフラッシュとして知られている餌のモードによる被害です。BMSB 学校など地域生活に住居を見つける可能性があります、また屋内害虫ではあり秋から冬2。化学物質やアレルゲン BMSB によってリリースは、果実収穫労働者の違法なアレルギー反応と報告されました。BMSB も接触性皮膚炎、結膜炎、および敏感な個人4,5で鼻炎をアレルギー疾患に貢献するかもしれない。他の半翅目昆虫、ACP、黒点桑山 (半翅目: Liviidae)、柑橘類の害虫である、師部限定細菌 (カンキツグリーニング病病原細菌うわさの花姫) カンキツグリーニング病 (HLB)、よく知られている原因を転送します。カンキツグリーニング病6,7。HLB は中国南部から最初に報告された、40 異なるアジア、アフリカ、オセアニア、南および北アメリカの国に7を広げています。柑橘類の緑化は柑橘系の果物の損失による経済・金融の損失の恐ろしい世界的な問題それ故に、ACP の管理は最も重要な予防と HLB のと見なされます。
これらの病害虫の効果的な管理のための措置は通常比較的短い化学農薬のアプリケーションが住んでいた必要があります。化学殺虫剤制御戦略頻繁に安全環境管理戦略の欠如や害虫個体群8,9の殺虫剤の抵抗のための感受性を減少しています。したがって、分子バイオ農薬での害虫の生物的防除は潜在的な代わりがその使用を世界的に控えめな、ままあり (例えば、 Trisolcus ミヤコグサ) 寄生蜂の様々 な種も自然な生物として有効かもしれない制御します。RNAi は潜在的な分子バイオ農薬10と侵襲的な害虫を管理するための技術を新興です。RNAi は mRNA 遺伝子表現の規制につながるシーケンス固有の方法で二本の侵入だけでなく、内因性の効果的な転写後の遺伝子サイレンシングを容易によく記載されている遺伝子調節機構レベル11,12。簡単に言えば、ダイサーは、ワーム、ハエ、植物、菌類、および哺乳類13,で保存されたと呼ばれる外因性 dsRNA は Sirna に二座ヌクレアーゼ RNase III スーパーファミリーのメンバーによって処理されるセルに内面化されます。14,15. これら 21-25 のヌクレオチド siRNA のデュプレックスがアンワインドし、Rna をガイドとして RNA によるサイレンシング複合体 (RISC) に統合します。この RISC RNA 複合体により、ワトソン Crick の基本組み合わせ補色ターゲット mRNA;これは最終的にアルゴノート蛋白質、対応する mRNA が低下し、それにより転写後遺伝子サイレンシングで16につながるタンパク質翻訳を減らす RNase H のようなドメインを含むマルチ ドメイン蛋白質による胸の谷間につながります,17,18。
害虫管理のための RNAi は、siRNA 経路活性化に至る dsRNA体内の興味の遺伝子の沈黙の導入を必要とします。全身 RNAi を誘導するために昆虫および昆虫細胞への dsRNA 配信に使用されている様々 な方法は、10、19,20,21, マイクロインジェクション22, キャリアを沈めるリポソームなどを餌23、および他の技術の24。RNAi は線虫で示されて最初の火災によるunc 22遺伝子発現を沈黙とメロ25キイロショウジョウバエ26で焦がした遺伝子の発現の打撃に続いてだった初期の機能研究活用セイヨウミツバチ22,27、エンドウヒゲナガアブラムシ28、29チャバネゴキブリなどの昆虫に dsRNA を提供するマイクロインジェクションH. 戦って30と鱗翅目昆虫 (Tereniusらによって再検討されました31). マイクロインジェクションは有利な昆虫に興味のあるサイトに正確かつ正確な線量を提供します。とはいえ、そのような敗血症の穿刺は、農業バイオ農薬開発にその実用性を排除するため外傷32, したがって、免疫関連遺伝子の発現を引き出す可能性があります。
生体内でdsRNA を提供する別の方法は、浸漬による摂取や dsRNA を含む細胞外媒体で一般に動物または細胞の懸濁液による dsRNA の吸収を含みます。浸漬は RNAi のショウジョウバエS2 ティッシュ文化セル下流 Raf1 (DSOR1) マイトジェン活性化タンパク質キナーゼのキナーゼ (MAPKK)20を阻害するだけでなく、の沈黙にc. の elegansを効率的に誘導するために使用されていますpos 1遺伝子33。ただし、浸漬使用して配信 dsRNA はマイクロインジェクション20に比べて RNAi を誘導するために非効率です。RNAi 仲介された咀嚼昆虫におけるサイレンシングは最初、人工寒天ダイエット10に dsRNA を注入することによって西部のトウモロコシ rootworm (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) に示されました。以前の報告書では、節足動物34に固有の自然な食事療法で注入された dsRNA を交付する方法をまとめています。これらの送付方法はさらに配信の人工的な手段に比較的有効であると判断されました。免疫関連遺伝子の等しいノックダウンが dsRNA の血液の食事または microinjected35に配信されたときが観察されたツェツェ バエ (体重) の場合。同様の光ライトブラウンアップル蛾 (Epiphyas postvittana)36(コナガ) コナガ幼虫37、蜂蜜ミツバチ38,39 で飛沫 dsRNA の配達効率的な RNAi を誘導します。ホスト植物の維管束組織を介して配信する必要がありますので、半翅目の昆虫における dsRNA の口頭配達は困難なので、翅の最も効果的な RNAi 実験は dsRNA40の注射を活用しています。効果的な RNAi も ACP ・ ガラス翼狙撃兵ツマグロヨコバイ (GWSS)、 Homalodisca vitripennisで観察された: dsRNA は柑橘類とルートの水薬、葉面散布による維管束組織に dsRNA を吸収したブドウを介して配信されました。スプレー、トランクの注射、あるいは挿し木41,42,43,44,45,46吸収。これはまた ACP (2016 年米国 20170211082 A1) に対して dsRNA の最初の特許になりました。SiRNA の dsRNA の微粒子やリポソームなどキャリアを使用して配信を与える安定性、および配信された dsRNA の有効性の増加が急速に台頭する23,47,48,49 ,50。体外と体内のその治療への応用は、適切な配信ベクトル51計り知れない潜在力を与えるかもしれないのために特別に要約された核酸ナノ粒子による配送車両の新しいクラスです。DsRNA の配信手段としてナノ粒子溶解性、疎水性、限られた濃縮52などの欠点がありますが、適したポリマー支援配信は、これらの欠点を補うこともあります。開発と自己実現のヌクレオチドの利用も浮上と呼ばれる 'アンチセンスオリゴヌクレオチド'、単一鎖 RNA/DNA 二重鎖46であるしています。
節足動物のキーである英領バージン諸島; 体脂肪合成のキーの誘導である複製を制御するプロセス、エクダイソンや幼若ホルモン (JH) による規制英領バージン諸島英領バージン諸島受容体を介したエンドサイトーシス53を介して発展途上卵母細胞によって最終的にとられます。英領バージン諸島はポリペプチドの合成 extraovarially、主要な卵卵黄タンパク質ビテリン54,55の開発のために不可欠である、したがって、再現性と加齢56が重要です。英領バージン諸島はミツバチ (セイヨウミツバチ) RNAi が英領バージン諸島の枯渇を介した成虫および卵の22で観察されたと同様、線虫57で正常に沈黙されています。その枯渇は観察可能な表現型効果につながるよう思って調べたの Vg を介した転写後遺伝子サイレンシング RNAi 減少不妊と多産、潜在的 BMSB コントロールを支援します。S-アデノシル-L-メチオニン (SAM) をエンコードする JHAMT 遺伝子-依存 JH 酸-o-メチルトランスフェラーゼ、58中学生合成経路の最終段階を触媒します。この経路ファルネシル、ファルネソールからは、ピロリン酸 (FPP) 順番に farnesoic 酸メチル farnesoate の JHAMT によって公団への変換後に変換されます。この経路は、昆虫や節足動物変身、ホルモン59,60,61によって規制されて発達プロセス用に保存されています。B. 森、JHAMT 遺伝子発現や、あらたに中学生合成活性は、 JHAMT遺伝子の転写抑制が中学生合成58の終了の重要な示唆されました。したがって、 JHAMT 英領バージン諸島の遺伝子は RNAi を用いた対象の枯渇のために選ばれました。RNAi は、ACP と GWSS の制御のための柑橘類の木でテストされています。ルートの水薬を dsRNA と扱われた柑橘類の木、昆虫の特定アルギニン キナーゼ (AK) 成績証明書42,44に対して二本の葉面散布だけでなく、タップ (トランク注射) を幹します。柑橘類の木々、植物の維管束組織を通じて効率的な配信を示す、ACP と GWSS41,42,の死亡率の増加の結果のキャノピー上すべて検出された dsRNA の塗布45。
現在の研究では、dsRNA など治療のための自然食配信方法を同定しました。この新しく開発された技術の JHAMT、英領バージン諸島を黙らせるために使用されました mRNA として BMSB ニンフの遺伝子特定の二本を使用して実証以前62。ここに示すこれらの新しい配信プロトコルには、外用スプレーまたは薬剤を使用する従来の RNA 配信システムが優先されます。野菜と果物、幹タップ、潅、・で粘土の吸着剤は、biopesticide 害虫や病原体の管理の継続的な発展に重要である dsRNA の配信のため使用する場合があります。

<table><tbody><tr><td>BMSB(H.ハリス)昆虫&nbsp;</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACP(D. citri)昆虫&nbsp;</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>有機インゲン</td>N <td>/ A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>柑橘類植物</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>次亜塩素酸ナトリウム溶液</td><td>JTベイカー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリーン食品着色料&nbsp;</td><td>McCormick & Co., Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サーモフォーマチャンバー&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マゼンタ容器(培養)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers&nbsp;</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiMix SYBR</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR ABI 7500</td><td>Applied Biosystems&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スプレーボトル</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>アメリカン缶会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

篩部と半翅目昆虫の植物 sap 供給の rna 干渉を誘発する二本鎖 rna の経口配信方法

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

師部と植物の sap 餌昆虫は侵入作物、食用作物の損傷プロセスの栄養素を取得するために果物の整合性です。半翅目の昆虫は、経済的に相当な害虫植物師管液を摂食による農作物の被害を引き起こす可能性の数を占めています。クサギカメムシ (BMSB)、クサギカメムシ越冬(カメムシ亜目: カメムシ科) と、ミカンキジラミ (ACP)、ミカンキジラミ桑山 (半翅目: Liviidae) が北アメリカに導入された半翅目害虫、彼ら屋内では、柑橘系の果物と主食行、付加価値の高い専門の侵襲性の農業害虫として不快害虫が。多くの種の殺虫剤抵抗性は害虫管理戦略の代替法の開発につながっています。二本鎖 RNA (dsRNA)-仲介された RNA 干渉 (RNAi) はジーンサイレンシングの害虫の管理のためのツールは、潜在的なアプリケーション機能ゲノム研究機構。外因合成 dsRNA または小さい干渉の RNA (siRNA) は、非常に効率的な遺伝子サイレンシング提示に相同である内因性 RNA の分解を介してトリガーできます。RNAi の半翅目昆虫の生物的防除のための分子バイオ農薬として効果的かつ環境使用を介して供給二本鎖 rna の生体内で配信が必要です。昆虫への dsRNA の配信方法を示す: 浸漬、緑の豆に dsRNA の読み込みと摂取を介して口頭配達と遺伝子特異的 dsRNA の吸収します。我々 はまた粘土顆粒と同様、葉面散布、根の水薬、トランク注射 dsRNA の徐放に不可欠なすべての可能性がありますを使用して非遺伝子組換え植物配信アプローチを概説しました。経口摂取の dsRNA によって効率的な配信は、ターゲット遺伝子"幼若ホルモン酸-o-メチルトランスフェラーゼ"(JHAMT) と (vg) の発現低下を誘導するために効果的な投与量として確認されました。これらの革新的な方法を表す作物保護で使用し、害虫管理のための環境の課題を克服する dsRNA の配達のための戦略。

BMSB 4th齢幼虫の摂食による野菜の仲介された dsRNA 配信は侵襲的な害虫の RNAi を用いた分子バイオ農薬の開発のテストされました。BMSBs フィードと呼ばれるメカニズムによって、針のようなスタイレットを使用して裂くし、フラッシュ、作物にかなりの被害が発生します。細長い有機緑豆、 P. 尋常性L、栄養素や dsRNA が体内BMSB を通じて届け餌3かをテストする使用されました。緑色の豆のセグメントは、DNase/RNase フリー水または BMSB (図 1 a) で配信をテストする緑の食品着色料と水の溶液に浸漬した.緑の食品着色料は、dsRNA を模倣する表示として使用されました。緑豆の維管束組織された毛細管62師部を通じて緑着色溶液の流れのため緑の食品着色料と飽和状態。BMSB ニンフは、緑豆 (図 ...

この記事では、RNA 干渉 (RNAi) 昆虫を摂食する師管液中の植物の維管束組織を通して二本鎖 RNA (dsRNA) の口頭配達のために開発する手法を示します。

篩部と半翅目昆虫の植物 sap 供給の RNA 干渉を誘発する二本鎖 RNA の経口配信方法

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

これらの手順の全体的な目標は、自然な経口投与方法を実証することです。遺伝子特異的dsRNAの場合、in vivoおよび害虫にRNA干渉を誘導します。この方法は、昆虫の内部に生体分子を送達する方法、RNAiベースの分子生物農薬の効果を解明する方法、および環境中の昆虫を制御する方法に関する主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、核酸を介した遺伝子サイレンシングによるこの送達が、植物の樹液摂食だけでなく、咀嚼昆虫にも適用できることです。しかし、ここでの方法は、茶色のカメムシ、ハーレクインバグ、アジアの柑橘類のオオバコなどの半翅目の害虫に二本鎖RNAを送達する方法を示しています。それらは他の昆虫に適用することができます。プロトコールを開始するには、卵塊から孵化した初期の4th Instar brown marmorated stink bugs、またはBMSB Nymphsを選択し、dsRNA摂食の24時間前にそれらを飢餓状態にします。次に、細身の認定有機インゲンを選択し、0.2%次亜塩素酸ナトリウム溶液で5分間洗います。続いて、H2Oを3回再蒸留し、豆を風乾させます。乾いたら、きれいなカミソリの刃を使って、インゲンをがくの端から全長7.5センチメートルまで切り取ります。洗浄してトリミングしたインゲンを、300マイクロリットルの制御溶液が入ったキャップレスの2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに浸します。in vitroで合成されたlac Z、JHAMT、またはVGDSRNAを希釈し、5マイクログラムまたは20マイクログラム、および300マイクロリットルのRNA、DNAフリー水を希釈して、それぞれ0.017マイクログラム/マイクロリットルまたは0.067マイクログラム/マイクロリットルの最終濃度を得る。洗浄してトリミングしたインゲンを、300マイクロリットルのdsRNA溶液を含むキャップレスの2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに浸します。マイクロ遠心チューブの端を包んで密封し、浸漬した豆を包み込み、dsRNA溶液の蒸発を防ぎ、動物がマイクロ遠心チューブに入るのを防ぎます。チューブを室温で3時間直立させて置き、毛細管現象によりdsRNA溶液がインゲン全体にロードされるようにします。チューブを清潔なポリプロピレン製の培養容器に入れ、飢餓状態の4番目のInstar BMSBニンフ3匹を培養容器に入れます。培養容器ごとに3匹の昆虫を扱います。それぞれに緑色の食品着色料、またはdsRNA溶液を含む3つのインゲンが含まれています。昆虫を摂氏25度、相対湿度72%、16L、8D未満に維持しますインキュベーター内の日長。昆虫がdsRNAに浸して吸収されたインゲンを5日間食べさせ、3日後にdsRNA処理されたインゲンの新鮮な食事を昆虫に補給します。植物や苗木を選択し、使用前の2〜3日間は水をやらないでください、土壌を乾かして湿らせますが、完全に乾くことはありません。手でポンプで送るスプレーボトルを使用して、200ミリリットルのdsRNA溶液を下部キャノピーに塗布します。25〜40日後に、4つの枝の先端から約10枚の葉を集めて、以前にトップにした木からの新しい成長をサンプリングします。全RNAを抽出し、RT-PCRおよびqPCRで、適用されたdsRNAトリガーの存在について分析します。同様に、10ミリリットルのdsRNAを苗の下部領域、または小さな鉢植えの木の葉に局所的にスプレーします。.植物や苗木を選択し、使用前の2〜3日間は水をやらないでください、土壌を乾かし、湿らせますが、完全に乾かないでください。次に、1リットルのdsRNA溶液を大型鉢植えの植物の土壌に加えます。1時間後に1リットルの水を追加します。部分的に乾燥した土壌の1メートルの高さの鉢植えの樹木の土壌に100ミリリットルのdsRNA溶液を適用します。dsRNA溶液を土壌浸漬剤として受け取った植物に、30分間浸します。次に、根による吸収を助けるために、普通の水のみの処理を適用します。柑橘類の苗木、新しい植物、または樹齢約3.5年の植物を選択して、幹の注射法としても知られるステムタップを使用してdsRNAを注入します。各インジェクターの銅チップを幅0.6cmの天井フィルムで4〜6回巻き付けて、チップ付近の漏れを防ぎます。次に、DNAで希釈した6ミリリットルのdsRNA溶液、RNAフリーの水で木の幹のインジェクターを満たします。10ミリリットルのドリルビットを使用して柑橘類の植物に穴を開け、茎の直径の約半分である2センチメートルを超えないように注意してください。次に、溶液を木の幹に注入し、インジェクターを幹に6〜10時間放置して、dsRNA溶液の吸収を可能にします。処理後3日、10日、30日で、処理された木からの挿し木を昆虫に食べさせます。30ミリリットルの円錐形チューブに30グラムの粘土吸収剤を注ぎ、35ミリリットルのマークまで注ぎます。DNAで希釈したdsRNA溶液20ミリリットルを注ぎ、RNAフリーの水をチューブに注ぎ、すべての吸収剤を濡らします。円錐形のチューブにキャップをし、チューブを傾けて空気を抜くのを助け、チューブを直立させ、粘土粒子が溶液を吸収するまで1〜2分間放置します。dsRNAを染み込ませた粘土を土壌混合物に十分加えて、1ガロンのポットを満たします。手で土を混ぜてひっくり返し、dsRNAに浸した粘土を土に完全に混ぜます。土壌を使用して、dsRNA処理用に選択された苗を再ポットします。30分から1時間後に、dsRNAを含まない200ミリリットルの普通の水で土壌に水をまきます。その後、100ミリリットルの普通の水が続きます。24時間後、植物を通常の散水スケジュールに置きます。処理された鉢植えの植物の4〜6枚の葉を粘土吸収剤とdsRNAで毎月テストし、dsRNAの処理後、新しい植物の成長の最も頂端の葉を収集します。インビトロで合成されたdsRNA(褐色カメムシに特異的)またはBMSB mRNAに浸漬したインゲンのセグメントのQPCRは、標的JHAMTおよびVgの発現がin vivoで有意に減少したため、RNAiの誘導が成功したことを示しました。この送達方法は、別の半翅目の害虫であるハーレクインバグにも効果的です。彼らの緑色の排泄物によって示されるように。これらの視覚的なデモンストレーションを見た後、in vivoでRNAi昆虫を誘導するための経口摂取を通じて二本鎖RNAを昆虫に送達する方法を十分に理解しているはずです。RNAiヌセロチド技術の進歩により、さまざまな生物のRNA、遺伝子発現、タンパク質レベルを調節する研究者の能力が拡大し続けています。これは植物から昆虫、そして最も困難な微生物にまで及びます。したがって、二本鎖RNAの作製コストは低下し続け、送達方法と安定性は向上し続けていますが、RNAi技術の未来は、新たな複雑な問題を解決するために引き続き使用されます。

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学ぶ 篩部と半翅目昆虫への経口dsRNA配信法。植物維管束を介したRNA干渉誘導技術で、害虫防除における遺伝子サイレンシングの効果と環境配慮型バイオ農薬の応用可能性を解明する。

篩部と半翅目昆虫の植物 sap 供給の RNA 干渉を誘発する二本鎖 RNA の経口配信方法

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