篩部と半翅目昆虫の植物 sap 供給の RNA 干渉を誘発する二本鎖 RNA の経口配信方法

これらの手順の全体的な目標は、自然な経口投与方法を実証することです。遺伝子特異的dsRNAの場合、in vivoおよび害虫にRNA干渉を誘導します。この方法は、昆虫の内部に生体分子を送達する方法、RNAiベースの分子生物農薬の効果を解明する方法、および環境中の昆虫を制御する方法に関する主要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、核酸を介した遺伝子サイレンシングによるこの送達が、植物の樹液摂食だけでなく、咀嚼昆虫にも適用できることです。しかし、ここでの方法は、茶色のカメムシ、ハーレクインバグ、アジアの柑橘類のオオバコなどの半翅目の害虫に二本鎖RNAを送達する方法を示しています。それらは他の昆虫に適用することができます。

プロトコールを開始するには、卵塊から孵化した初期の4th Instar brown marmorated stink bugs、またはBMSB Nymphsを選択し、dsRNA摂食の24時間前にそれらを飢餓状態にします。次に、細身の認定有機インゲンを選択し、0.2%次亜塩素酸ナトリウム溶液で5分間洗います。続いて、H2Oを3回再蒸留し、豆を風乾させます。

乾いたら、きれいなカミソリの刃を使って、インゲンをがくの端から全長7.5センチメートルまで切り取ります。洗浄してトリミングしたインゲンを、300マイクロリットルの制御溶液が入ったキャップレスの2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに浸します。in vitroで合成されたlac Z、JHAMT、またはVGDSRNAを希釈し、5マイクログラムまたは20マイクログラム、および300マイクロリットルのRNA、DNAフリー水を希釈して、それぞれ0.017マイクログラム/マイクロリットルまたは0.067マイクログラム/マイクロリットルの最終濃度を得る。

洗浄してトリミングしたインゲンを、300マイクロリットルのdsRNA溶液を含むキャップレスの2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに浸します。マイクロ遠心チューブの端を包んで密封し、浸漬した豆を包み込み、dsRNA溶液の蒸発を防ぎ、動物がマイクロ遠心チューブに入るのを防ぎます。チューブを室温で3時間直立させて置き、毛細管現象によりdsRNA溶液がインゲン全体にロード

チューブを清潔なポリプロピレン製の培養容器に入れ、飢餓状態の4番目のInstar BMSBニンフ3匹を培養容器に入れます。培養容器ごとに3匹の昆虫を扱います。それぞれに緑色の食品着色料、またはdsRNA溶液を含む3つのインゲンが含まれています。

昆虫を摂氏25度、相対湿度72%、16L、8D未満に維持しますインキュベーター内の日長。昆虫がdsRNAに浸して吸収されたインゲンを5日間食べさせ、3日後にdsRNA処理されたインゲンの新鮮な食事を昆虫に補給します。植物や苗木を選択し、使用前の2〜3日間は水をやらないでください、土壌を乾かして湿らせますが、完全に乾くことはありません。

手でポンプで送るスプレーボトルを使用して、200ミリリットルのdsRNA溶液を下部キャノピーに塗布します。25〜40日後に、4つの枝の先端から約10枚の葉を集めて、以前にトップにした木からの新しい成長をサンプリングします。全RNAを抽出し、RT-PCRおよびqPCRで、適用されたdsRNAトリガーの存在について分析します。

同様に、10ミリリットルのdsRNAを苗の下部領域、または小さな鉢植えの木の葉に局所的にスプレーします。.植物や苗木を選択し、使用前の2〜3日間は水をやらないでください、土壌を乾かし、湿らせますが、完全に乾かないでください。次に、1リットルのdsRNA溶液を大型鉢植えの植物の土壌に加えます。

1時間後に1リットルの水を追加します。部分的に乾燥した土壌の1メートルの高さの鉢植えの樹木の土壌に100ミリリットルのdsRNA溶液を適用します。dsRNA溶液を土壌浸漬剤として受け取った植物に、30分間浸します。

次に、根による吸収を助けるために、普通の水のみの処理を適用します。柑橘類の苗木、新しい植物、または樹齢約3.5年の植物を選択して、幹の注射法としても知られるステムタップを使用してdsRNAを注入します。各インジェクターの銅チップを幅0.6cmの天井フィルムで4〜6回巻き付けて、チップ付近の漏れを防ぎます。

次に、DNAで希釈した6ミリリットルのdsRNA溶液、RNAフリーの水で木の幹のインジェクターを満たします。10ミリリットルのドリルビットを使用して柑橘類の植物に穴を開け、茎の直径の約半分である2センチメートルを超えないように注意してください。次に、溶液を木の幹に注入し、インジェクターを幹に6〜10時間放置して、dsRNA溶液の吸収を可能にします。

処理後3日、10日、30日で、処理された木からの挿し木を昆虫に食べさせます。30ミリリットルの円錐形チューブに30グラムの粘土吸収剤を注ぎ、35ミリリットルのマークまで注ぎます。DNAで希釈したdsRNA溶液20ミリリットルを注ぎ、RNAフリーの水をチューブに注ぎ、すべての吸収剤を濡らします。

円錐形のチューブにキャップをし、チューブを傾けて空気を抜くのを助け、チューブを直立させ、粘土粒子が溶液を吸収するまで1〜2分間放置します。dsRNAを染み込ませた粘土を土壌混合物に十分加えて、1ガロンのポットを満たします。手で土を混ぜてひっくり返し、dsRNAに浸した粘土を土に完全に混ぜます。

土壌を使用して、dsRNA処理用に選択された苗を再ポットします。30分から1時間後に、dsRNAを含まない200ミリリットルの普通の水で土壌に水をまきます。その後、100ミリリットルの普通の水が続きます。

24時間後、植物を通常の散水スケジュールに置きます。処理された鉢植えの植物の4〜6枚の葉を粘土吸収剤とdsRNAで毎月テストし、dsRNAの処理後、新しい植物の成長の最も頂端の葉を収集します。インビトロで合成されたdsRNA(褐色カメムシに特異的)またはBMSB mRNAに浸漬したインゲンのセグメントのQPCRは、標的JHAMTおよびVgの発現がin vivoで有意に減少したため、RNAiの誘導が成功したことを示しました。

この送達方法は、別の半翅目の害虫であるハーレクインバグにも効果的です。彼らの緑色の排泄物によって示されるように。これらの視覚的なデモンストレーションを見た後、in vivoでRNAi昆虫を誘導するための経口摂取を通じて二本鎖RNAを昆虫に送達する方法を十分に理解しているはずです。

RNAiヌセロチド技術の進歩により、さまざまな生物のRNA、遺伝子発現、タンパク質レベルを調節する研究者の能力が拡大し続けています。これは植物から昆虫、そして最も困難な微生物にまで及びます。したがって、二本鎖RNAの作製コストは低下し続け、送達方法と安定性は向上し続けていますが、RNAi技術の未来は、新たな複雑な問題を解決するために引き続き使用されます。