Name: 気孔テープ剥離: 細胞試料の調製法の改良 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学ぶ 気孔ガード細胞の分離と濃縮法。植物葉組織から高品質な試料を調製し、生理学的・生化学的・分子生物学的解析に活用します。この手法は転写組解析やタンパク質組解析など、多様な研究への応用が可能です。

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ダニエル陳からデジタル ビデオ生産チームのブッフホルツ高校編集ビデオで支援に感謝いたします。この気孔細胞・ プロテオミクス ・ メタボロミクス陳の実験室での研究は、米国国立科学財団 (0818051、1158000、1412547) からの補助金によってサポートされています。Wenwen 香港は中国公費によってサポートされます。博士 Qiuying パンをサポートするには、中国の奨学金委員会と国家自然科学基金、中国の (31570396)。

1. 成長する植物
<ol><li>Potting の混合物の種を発芽させます。植物を育てる成長室 140 µmol 光子 m− 2の− 1の光強度と光速で 8 h 22 ° C で 16 時間日長で暗い、18 ° C で 2 週間。</li>
	<li>4"直径の鍋土を含むに個別に類似サイズの苗を移植し、手順 1.1 で説明した追加同じ条件で 3 週間の成長します。 注: は、湿った土壌を維持する週 2 回水道水で植物を水します。</li>
</ol>2. 豊かな気孔の準備
<ol><li>5 週間の古いシロイヌナズナ植物メスと個々 の葉を削除します。</li>
	<li>裏面 (下側) に付着したワンピースと葉の向軸 (上) 側に付着した他の作品と明確スコッチ テープの 2 つの部分に各葉を取り付けます。5 葉のテープを残す s。</li>
	<li>優しい皮をむく離れて舗装と細胞と葉肉細胞の向軸側背軸側を別々 にそれぞれの手の人差し指と親指を使用してテープの 2 つの部分。</li>
	<li>気孔を開くの 60 mL に葉の背軸側から皮バッファー (50 mM KCl、10 mM MES 島、pH 6.2 1 M コに調整) 40 × 12 mm サイズ ペトリネットの場所は、収集された料理します。<ol>
<li>すべてのサンプルの皮が収集されるまでは、上記の手順を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>手順 1.1 で述べた光の条件下で生育室に皮シャーレを配置します。気孔が全開に 2 h の光の下で皮を残します。</li>
	<li>場所は、150 mm × 20 mm にペトリ皿細胞壁の消化酵素の混合 (0.7% セルラーゼ R-10、0.025% macerozyme R-10、0.1% (w/v) ポリビニルピロリドン-40、および 55% 基本的なソリューション (0.55 M ソルビトール、0.5 mM で 0.25% (w/v) ウシ血清アルブミン 50 mL を含む皮します。CaCl2, 0.5 mM MgCl2、0.5 mM アスコルビン酸, 10 μ M KH2PO4, 5 mM 4-morpholineethanesulfonic 酸 (MES) ph 5.7 1 M コで調整)。</li>
	<li>20 分間 50 rpm でシャーレに相互シェーカーで皮を振る。</li>
	<li>20 分は、50 mL の水を含む 150 × 20 mm サイズのシャーレに皮を転送した後、皮をピンセットで酵素液から削除します。</li>
	<li>15 の皮を洗う転送ピペットを使用して、任意の残留酵素液を削除する水 10 mL で 2 回 s。</li>
	<li>手順 2.4 で使用されるバッファーを開いて新鮮な気孔の 50 mL の 150 mm × 20 mm サイズのシャーレに皮を配置するのにピンセットを使用します。手順を回復する気孔を許可する 1.1 で述べた光の条件で 1 時間インキュベートします。</li>
</ol>3. アブシジン酸 (ABA) 処理と気孔運動アッセイ
<ol><li>で 150 mm × 20 mm サイズ シャーレ。15 分 50 mL の気孔開口バッファーまたは適切な治療時間の 10 μ M の ABA の最終濃度と気孔開口バッファーの 50 mL 30 ° C で豊かな気孔皮を孵化させなさい。</li>
	<li>5, 15, 30 分間で 50 rpm シェーカーに皮を配置します。各時間間隔後ピンセットで皮を削除、手順 3.3 で画像処理の手順に従います。</li>
	<li>ABA 処理後光学顕微鏡で気孔 ABA 処理前に、と様々 な時点での画像を取る。<ol>
<li>皮を取るし、ガラス顕微鏡スライド上に置きます。</li>
		<li>顕微鏡ステージにスライドを配置し、皮のイメージを視覚化できるので、ステージを調整します。</li>
		<li>罰金を調整し、ガード細胞の鮮明な画像を得るために、顕微鏡の焦点をコースします。</li>
		<li>40 倍の倍率で複数の気孔のいくつかの画像を取る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ImageJ8を使用して 60 の気孔開口部を測定します。</li>
	<li>標準のエラーおよび p 値 < 0.05 60 の気孔開度測定の意義を計算します。</li>
</ol>4. 蛋白質の抽出および SDS ページの分離
<ol><li>15 の皮を挽くチルド乳鉢と乳棒を使用して皮をカバーする十分な液体窒素で s。</li>
	<li>50 皮ごと Tris 飽和フェノール (pH 8.8) の 3 mL を加えると 3 mL タンパク質抽出バッファー (0.9 M ショ糖 0.1 M トリス-HCl、0.01 M EDTA, 0.4 %2-メルカプトエタノール、プロテアーゼ、ホスファターゼ阻害剤は 1 mM の 10 μ L)、モルタルにピペットで 5 エディーの皮を挽くとヒューム フードに至り分。</li>
	<li>ピペットを使用して抽出を転送し、皮、オークリッジに金属製のピンセットを使用してチューブを遠心し、4 ° C で 1 時間を 50 rpm でシェーカーの扇動</li>
	<li>オークリッジ遠心管から皮を外し、5,000 × g で 10 分間で抽出物を遠心分離します。ピペットを使用して新しいきれいなマイクロ遠心チューブ トップのフェノール相を転送します。</li>
	<li>フェノールの沈殿物は 100% メタノールで冷たい 0.1 M 酢酸アンモニウム 5 ボリュームを追加することによってタンパク質を抽出しました。渦を簡潔にし、-20 ° C で一晩インキュベート</li>
	<li>4 ° C、20 分で 20,000 × g で遠心分離機、ゆっくりとチューブからそれを注ぐことによって、上清をデカントし、管内の蛋白ペレットを保持します。</li>
	<li>メタノール、酢酸アンモニウム 0.1 M で二回蛋白質餌を洗浄し、80% アセトンで 2 回と 100% 冷アセトン。 注: 洗浄は、タンパク質のチューブに指定された試薬 10 mL を追加することによって行われます。5 分、10 分の 4 ° C で 15,000 × g で遠心分離後 50 回転でシェーカーを揺り動かしなさい。その後、蛋白ペレットのみを保持チューブから試薬を注ぐ。</li>
	<li>ペレットに 100% 冷アセトン 1 mL を追加し、上下にゆっくりとピペッティングによって再サスペンドします。</li>
	<li>タンパク質サスペンション ピペット 2 mL マイクロ遠心チューブに転送し、5 分のための 4 ° C で 20,000 × g で遠心分離機します。</li>
	<li>チューブからデカントでアセトンを削除し、10 分の発煙のフードでペレットを乾燥します。</li>
	<li>溶解バッファー (8 M 尿素、0.5 %sds、ph 8.5 30 mM トリス-HCl) の 200 μ L マイクロ遠心チューブにタンパク質を溶解とで 30 分間遠心 15 ° C 20 分、収集新しい管の上澄みで 20,000 × g、渦。</li>
	<li>次のタンパク質定量プロトコル9タンパク質濃度を定量化します。</li>
	<li>プロトコル10次ゲル電気泳動蛋白質の分離のための蛋白質のサンプルを使用します。</li>
</ol>

<ol><li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+interactions+in+stomatal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li>
<li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.arplant.52.1.627">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li>
<li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li>
<li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1046/j.0028-646X.2001.00329.x">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li>
<li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+Dependence+Of+K%2B+Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li>
<li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10(2009).</li>
<li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll%2C+epidermal+and+vascular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li>
<li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents%2C+chaotropes%2C+dyes%2C+and+reducing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e80">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li>
<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac0262560">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li>
<li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+labeling+by+iTRAQ%3A+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li>
</ol>

利害の対立が宣言されていません。

ガード細胞は植物におけるシグナル伝達機構を研究するためのモデル システムを研究で使用される試料の調製が生物的質問に答えるに最も適切なことを確認することが重要です。植物研究コミュニティの中で細胞の増加の関心にもかかわらずは普遍的な方法が気孔運動と生理の両方できるようになる細胞を準備する方法の 1 つで検討する分子レベルの変化だけでなく、システム。それらを分離する挑戦は、その小型サイズ、低豊かさとそれをもっとまたはより少なく全体の葉からそれらを削除することは困難ことができるユニークな構造に大部分の帰することが。
このプロトコルでは、分離開発テープ皮メソッドを使用して、これらの障害を克服する方法のメソッドを提供します。このプロトコルでメソッドは、生理学的刺激に対する応答性を維持そのまま気孔ガード細胞を分離する方法を提供します。タンデム質量タグ (TMT) と定圧のまたはタグを利用した定量的プロテオミクス解析などの詳細なプロテオーム研究の出発材料として役立つことができる細胞蛋白質の抽出が可能なこれらのサンプルの準備相対パスと絶対定量 (iTRAQ)11<...

気孔は、全体の生理学と植物のフィットネスに重要な役割を果たします。これらの小さな植物の特定の構造、細胞として知られている 2 つの特殊な表皮細胞によって形成され、葉の切断面に最も豊富にあります。気孔は、蒸散による水損失の制御と同様、植物と大気間のガス交換の必要があります。細胞調節する異なる外部 (例えば光、湿度、病原体の接触、二酸化炭素のレベル) の統合により気孔開口部および内部 (e.g。、内因性ホルモン) 刺激1,2。過去 20 年間で、この型のセルを勉強セルシグナ リング プロセス植物のためのモデル システムとなりました。これらの細胞は葉; 総細胞のごく一部を構成します。したがって、彼らのユニークな携帯を調べるためには、生化学的および分子プロパティ単一セルにそれ、他の葉の細胞型からそれらを分離する必要。過去には、そのガード細胞研究はしばしば細胞プロトプ ラスト (GCP)3,4、5の準備を関与しています。これは通常大量のブレンドによる機械的破壊や、細胞壁分解酵素の使用を必要とし、少し収量を倍のコストと時間のかかる一般的に GCP サンプルを頻繁に準備に多くの時間がかかるように証明されています。もっと重大に、細胞は、気孔開口を調節する完全なペアとして機能、GCP の使用は細胞シグナリングを勉強するための人工的なシステムとして見ることができます。
ここでは、気孔そのまま細胞が濃縮されているし、刺激に対する生理反応を維持を準備する方法を開発しました。このメソッドは、葉肉細胞プロトプ ラスト6,7を分離するために使用された方法に触発されました。本手法は, 気孔は、明確な舗装と細胞を含む裏面層から葉の向軸レイヤーに接続されている最初葉肉細胞の大半を分離するスコッチ テープを使用して用意しています。これは葉の両側にテープを貼付し、それらを離れて剥離です。裏面層から細胞が気孔開口部バッファー内の光の下で回復が許可されます。後残りの舗装の細胞が細胞壁分解酵素、テープに濃縮されているガード細胞を残しての少量を使用して削除されます。
このシンプルなメソッドで応答性の高い有効な気孔のガード細胞迅速かつ効率的に、最小限のコストで 50 の皮から濃縮細胞を取得するより少ない時間を取って準備します。ここにメソッドは、植物細胞のプロトプ ラストが用意されて、従来よりも以下のダメージを課しています。さらに、材料はこのメソッド収量の望ましい蛋白質量から収集されます。最も重要なは、葉がブレンドにさらされていないか、長い消化時間と細胞のまま、ための研究結果より密接にガード セルの自然な生物学に関連します。この方法では、気孔運動関連付けることができますリアルタイムで分子レベルで変更します。したがって、この製法を用いた研究から得られた知識は、ガード細胞シグナル伝達のより包括的な理解のため重要となります。
モデルとして植物のシロイヌナズナを用いてください。ただしこのプロトコルは消化時間の若干の修正をナタネなど他の植物の気孔のガード細胞の濃縮に適用できます。概念の証拠として、このメソッドを介して濃縮細胞は、実行可能なフルオレセイン ・ ジアセテート (FDA) 試金および植物ホルモンのアブシジン酸 (ABA) をそれぞれ活用研究に示すように刺激に反応しました。さらに、高品質のタンパク質がこれらのガードの細胞から分離することができますを確認しました。ここでは、このプロセスの詳細なプロトコルについて述べる。

<table><tbody><tr><td>ステンレス鋼外科用メス</td><td>の羽&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td></td>NC9999403</tr><tr><td>スコッチテープ (3M)</td><td>ULINE</td><td>S-9781</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>Σ-アルドリッチ</td><td>BR455701</td><td></td></tr><tr><td>セルラーゼ (小野塚R-10)&nbsp;</td><td>ヤクルト製薬工業(株)</td><td>21560003-3</td><td></td></tr><tr><td>マセロザイム R-10</td><td>ヤクルト製薬工業株式会社</td><td>21560003-4</td><td></td></tr><tr><td>DM6000B顕微鏡&nbsp;</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td></td>PI78443</tr><tr><td>Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3119-0030</td><td></td></tr><tr><td>EZQ Protein Quantitation Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R33200</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Diacetate (FDA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1303</td><td></td></tr><tr><td>Abscisic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4906</td><td></td></tr><tr><td>Metro Mix 500</td><td>BWI Companies&nbsp;</td><td>TX-500</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Safe Comassie (G-250)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0786</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ (2mL)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>ImageJソフトウェア</td><td>国立衛生研究所</td><td></td><td></td></tr>用<tr><td>ピンセット&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4017-1EA</td><td></td></tr><tr><td>12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1043</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr></tbody></table>

気孔テープ剥離: 細胞試料の調製法の改良

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

細胞の研究は、植物の全体的な機能にこのセルの型の特定の貢献の知識に不可欠です。多くの場合分離することは困難だし、挑戦を提供する従ってそれらをもっと勉強します。
本研究では、細胞濃縮法を確立します。プロトコルは、スコッチ ガードのセルを隔離し、セルからの蛋白質の抽出を採用しています。このメソッドは、分離中に整合性と細胞の収量を向上し、細胞シグナリング プロセスと気孔の表現型の関連性の研究に信頼性の高いサンプルを提供します。この方法では植物の葉はテープの 2 つの部分間で分割され背軸側を削除するには、離れて皮をむいた。このプロトコルは、シロイヌナズナ葉の組織細胞を分離するために適用されました。セルは、フルオレセイン ・ ジアセテートの生存率を決定する (FDA) とアブシジン酸 (ABA) ABA に気孔運動を評価するために扱われました。結論としては、このプロトコルは蛋白質の分離と濃縮細胞を準備するため有用証明します。有効にする生理学的およびその他の生物学的研究とタンパク質・細胞の品質はここで得られました。

シロイヌナズナの代表的なイメージは前に、と後、葉肉細胞や表皮細胞の消化は、図 1に示すセルをガードします。ガード セル実行可能性前に、と葉肉細胞と表皮細胞の除去後は、酵素活性と細胞膜の完全性 (図 1 bと1 D) を測定する FDA を使用して観察できます。図 2は、ABA の処置への応答でシロイヌナズナの気孔を示しています。気孔は、ABA 処理での 30 分後に 50% 以上が減少します。図 2 aは、気孔運動の時間のコースです。さまざまな時点での写真は光学顕微鏡で撮影されました。ImageJ で気孔を測定し、60 ~ 80 口径測定値 ± 標準誤差平均値が示されました。各時点で気孔開口部の代表的な画像を図 2 bに示します。蛋白質の検出、...

このプロトコルでは、生理学的およびその他の生物学的研究に役立つ濃縮細胞を準備する方法について説明します。

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

この実験の全体的な目標は、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクスなどの生理学的、生化学的、分子分析のための高品質の濃縮気孔ガード細胞を調製することです。こんにちは、私の名前はシェルドン・ローレンスです。私はフロリダ大学生物学部のチェン博士の研究室の大学院生です。今日は、気孔の生理学と生物学の両方を研究するための有用な材料である植物の葉組織からガード細胞を分離する方法を紹介します。この方法は、ガード細胞を単離するための新しい方法と考えられています。特に、無傷のガード細胞の濃縮を可能にし、気孔細胞シグナル伝達プロセスの研究に信頼性の高いサンプルを提供します。この方法の適用は、プロトコルにわずかな変更を加えるだけで、アブラナ科植物や他の植物種に拡張できます。ガード細胞を充実させるための主要なステップは困難であることが証明される可能性があるため、デモンストレーションは重要です。まず、生後5週間の成熟したシロイヌナズナ植物を選択します。メスで葉を慎重に取り除き、根元で葉を切ります。スコッチテープを2枚取り、切除した葉をそれらの間に置きます。テープの端がくっつかないようにしながら、両面にやさしく圧力をかけます。これは、それらの間に指を挿入することで実行できます。2枚のテープをそっと離し、葉の軸方向側から採取した皮をすぐに気孔開口部バッファーに浮かせます。すべての皮を集めたら、光の下に置きます。それらを2時間そのままにしておきます。いくつかの皮を採取し、顕微鏡スライドに置きます。光学顕微鏡を使用して、レンズを調整してガードセルを表示し、ガードセルが開いていることを確認します。皮を細胞壁消化酵素溶液50mlに入れます。浮かべて摂氏26度で孵化させます。20分後、酵素溶液から皮を取り出し、脱イオン水で2回短時間すすぎ、新鮮な気孔開口部緩衝液に入れます。乳鉢で液体窒素と乳棒で皮を挽きます。次に、本文に記載されているようにフェノール抽出を行います。乳棒で乳鉢で皮を挽いた後、抽出物を皮と一緒にオークリッジ遠心分離管に移し、シェーカーで摂氏4度で1時間攪拌します。100%メタノールに氷冷した0.1mol酢酸アンモニウムを5容量加えて、フェノール抽出タンパク質を沈殿させます。タンパク質を摂氏20度で一晩沈殿させた後、遠心分離によりタンパク質を回収し、本文に記載されているようにペレット洗浄を行います。ペレットを1ミリリットルの冷たいアセトンに再懸濁し、2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。遠心分離後、アセトン上清を捨て、ペレットを10分間乾燥させます。タンパク質サンプルを溶解バッファーに溶解します。ボルテックスおよび遠心分離後、上清を回収し、タンパク質濃度を測定します。SDS-PAGEゲルを泳動します。別々のタンパク質バンドを可視化し、相対的なタンパク質品質を観察します。シロイヌナズナガード細胞が葉肉細胞と表皮細胞の酵素消化前後の代表的な画像です。葉肉細胞および表皮細胞の除去前後のガード細胞の生存率は、酵素活性と細胞膜の完全性を測定するフルオレセインジアセテートを使用して観察できます。ご覧の通り、ガード細胞はピーリングと酵素消化後も生存可能です。この例は、ABA治療に応答したシロイヌナズナの気孔の動きを示しています。ガード細胞は治療に反応し、ABAによる治療の30分後に気孔の開口部が50%以上減少します。気孔の動きの時間経過をご紹介します。さらに、各時点における気孔開口部の代表的な画像が示されています。タンパク質の検出、分離、および相対存在量は、SDS-PAGEによって観察されます。バンドは明確で明確です。この分析法からのタンパク質抽出の再現性を強調するために、4つの生物学的複製が含まれています。この手法のアイデアが最初に浮かんだのは、ガード細胞の分子変化と気孔の動きをリアルタイムで関連付けようとしたときにでした。一度習得すると、気孔ガード細胞からのタンパク質サンプルは数時間以内に調製でき、複数の実験で使用できます。剥がしたり取り扱ったりする際にガードセルに大きなダメージを与えないように注意することが重要です。この方法に続いて、正常条件およびストレス条件での植物のタンパク質のredux応答を研究するための等重体標識など、他の手法を適用してガード細胞シグナル伝達を調べることができます。このビデオを見れば、無傷で生存可能なガード細胞を単離して濃縮する方法、および下流の研究に適した高品質のタンパク質を抽出する方法について十分に理解できるはずです。

stomata-tape-peel-an-improved-method-for-guard-cell-sample-preparation

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

空間固有のフィトクロム応答の分子基盤は、組織および器官特異的フィトクロムの欠陥を示すトランスジェニック植物を用いて検討されている。マイクロアレイ解析に続いてソート蛍光活性化細胞により誘導されるフィトクロム発色団の枯渇を示す特定の細胞の単離は、空間的な固有のフィトクロム反応に関与する遺伝子を同定するために活用されています。...

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ</em

我々は、生菌に対する気孔の応答にアクセスするためのシンプルで再現性のプロトコルを開発しました。表皮皮の使用と比較して、この方法では、葉の傷や操作を最小限に抑えることが以前に報告した。...

全葉のイメージングを使用して細菌細胞をライブに気孔反応を評価する

この記事では、指向性応答の間にplasmodesmal透過性、ひいてはオーキシン勾配を制御する遺伝子をスクリーニングするための方法を説明します。これは、胚軸における向性応答の程度の測定を含みます  シロイヌナズナおよび8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸（HPTS）ロードし、最終的にカロースレベルの評価によりplasmodesmal透過性を確認します。...

トロピック応答におけるカロース媒介Plasmodesmalゲーティングの役割を検証するための戦略

概日時計は、シロイヌナズナのトランスクリプトームの約3分の規制が、計時にフィードバックされる遺伝子の割合は不明のまま。ここでは、急速に一過プロトプラスト内で発現の概日レポーターの発光イメージングを使用して、シロイヌナズナのいずれかの変異体のラインに概日表現型を評価するための方法を視覚化します。...

発光時計レポーターとシロイヌナズナプロトプラストトランスフェにおける概日表現型の迅速分析

既存の植物改変の方法は適用性が限られています。ここで提案されている新しいペプチド由来の技術は、無傷の植物の目的の細胞内コンパートメントへの外因性タンパク質または遺伝子の導入における簡便性と効率性の両方を約束します。...

植物の細胞や細胞小器官の壁を越え遺伝子やタンパク質を輸送するために、ペプチド由来方法

ここでは、 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストに適用されるインタラクトームキャプチャプロトコールを紹介する 。この方法は生体内での UV架橋に批判的に依存し、生理学的環境からの植物mRNA結合タンパク質の単離および同定を可能にする。...

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

このプロトコルでは、シロイヌナズナの花と...

全体マウント クリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色

このプロトコルの目的は葉緑体などの細胞内構造の観察の方法と糖含有培地溶液浸漬処理によるシロイヌナズナの幼植物の子葉におけるクラスター化された気孔を誘導する方法を示します、共焦点を使用してクラスター化されたガード細胞における微小管レーザー顕微鏡。...

シロイヌナズナの幼苗における砂糖ソリューション浸漬処理による気孔のクラスター化の誘導システム

この論文では、気孔の発達を制御する遺伝子を特徴付けるために、表皮剥離を使用しない2つの表現型法について説明します。最初の方法は、トルイジンブルーO染色植物表皮を使用して気孔表現型を分析する方法を示しています。2番目の方法は、気孔リガンドを同定し、それらの生物学的活性を監視する方法を説明する。...

表皮表現型スコアリング による 気孔発生に関与する遺伝子の同定

ここでは、 シロイヌナズナの細菌侵入に対する気孔応答の直接観察と自動測定のための簡単な方法を紹介します。この方法では、ポータブル気孔イメージングデバイスと、デバイスによってキャプチャされた葉の画像用に設計された画像解析パイプラインを活用します。...

Pseudomonas syringae pvに対する気孔応答の直接観察と自動測定。トマトシロイヌナズナのDC3000

本プロトコルは、表皮ピーリング、クリアリング技術、AI支援画像解析を用いて、2つの異なる種の気孔および表皮形質を比較評価する方法を提示します。この目的は、農業応用および広範な植物研究において、気孔機能の基盤となる細胞構造を高スループットかつ再現性のある定量化を可能にすることです。...

ピーリング、クリアリング、AI画像解析を用いた気孔および表皮の特徴の特徴づけ

学ぶ 気孔ガード細胞の分離と濃縮法。植物葉組織から高品質な試料を調製し、生理学的・生化学的・分子生物学的解析に活用します。この手法は転写組解析やタンパク質組解析など、多様な研究への応用が可能です。

気孔テープ剥離: 細胞試料の調製法の改良

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