気孔テープ剥離: 細胞試料の調製法の改良

この実験の全体的な目標は、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクスなどの生理学的、生化学的、分子分析のための高品質の濃縮気孔ガード細胞を調製することです。こんにちは、私の名前はシェルドン・ローレンスです。私はフロリダ大学生物学部のチェン博士の研究室の大学院生です。

今日は、気孔の生理学と生物学の両方を研究するための有用な材料である植物の葉組織からガード細胞を分離する方法を紹介します。この方法は、ガード細胞を単離するための新しい方法と考えられています。特に、無傷のガード細胞の濃縮を可能にし、気孔細胞シグナル伝達プロセスの研究に信頼性の高いサンプルを提供します。

この方法の適用は、プロトコルにわずかな変更を加えるだけで、アブラナ科植物や他の植物種に拡張できます。ガード細胞を充実させるための主要なステップは困難であることが証明される可能性があるため、デモンストレーションは重要です。まず、生後5週間の成熟したシロイヌナズナ植物を選択します。

メスで葉を慎重に取り除き、根元で葉を切ります。スコッチテープを2枚取り、切除した葉をそれらの間に置きます。テープの端がくっつかないようにしながら、両面にやさしく圧力をかけます。

これは、それらの間に指を挿入することで実行できます。2枚のテープをそっと離し、葉の軸方向側から採取した皮をすぐに気孔開口部バッファーに浮かせます。すべての皮を集めたら、光の下に置きます。

それらを2時間そのままにしておきます。いくつかの皮を採取し、顕微鏡スライドに置きます。光学顕微鏡を使用して、レンズを調整してガードセルを表示し、ガードセルが開いていることを確認します。

皮を細胞壁消化酵素溶液50mlに入れます。浮かべて摂氏26度で孵化させます。20分後、酵素溶液から皮を取り出し、脱イオン水で2回短時間すすぎ、新鮮な気孔開口部緩衝液に入れます。

乳鉢で液体窒素と乳棒で皮を挽きます。次に、本文に記載されているようにフェノール抽出を行います。乳棒で乳鉢で皮を挽いた後、抽出物を皮と一緒にオークリッジ遠心分離管に移し、シェーカーで摂氏4度で1時間攪拌します。

100%メタノールに氷冷した0.1mol酢酸アンモニウムを5容量加えて、フェノール抽出タンパク質を沈殿させます。タンパク質を摂氏20度で一晩沈殿させた後、遠心分離によりタンパク質を回収し、本文に記載されているようにペレット洗浄を行います。ペレットを1ミリリットルの冷たいアセトンに再懸濁し、2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。

遠心分離後、アセトン上清を捨て、ペレットを10分間乾燥させます。タンパク質サンプルを溶解バッファーに溶解します。ボルテックスおよび遠心分離後、上清を回収し、タンパク質濃度を測定します。

SDS-PAGEゲルを泳動します。別々のタンパク質バンドを可視化し、相対的なタンパク質品質を観察します。シロイヌナズナガード細胞が葉肉細胞と表皮細胞の酵素消化前後の代表的な画像です。

葉肉細胞および表皮細胞の除去前後のガード細胞の生存率は、酵素活性と細胞膜の完全性を測定するフルオレセインジアセテートを使用して観察できます。ご覧の通り、ガード細胞はピーリングと酵素消化後も生存可能です。この例は、ABA治療に応答したシロイヌナズナの気孔の動きを示しています。

ガード細胞は治療に反応し、ABAによる治療の30分後に気孔の開口部が50%以上減少します。気孔の動きの時間経過をご紹介します。さらに、各時点における気孔開口部の代表的な画像が示されています。

タンパク質の検出、分離、および相対存在量は、SDS-PAGEによって観察されます。バンドは明確で明確です。この分析法からのタンパク質抽出の再現性を強調するために、4つの生物学的複製が含まれています。

この手法のアイデアが最初に浮かんだのは、ガード細胞の分子変化と気孔の動きをリアルタイムで関連付けようとしたときにでした。一度習得すると、気孔ガード細胞からのタンパク質サンプルは数時間以内に調製でき、複数の実験で使用できます。剥がしたり取り扱ったりする際にガードセルに大きなダメージを与えないように注意することが重要です。

この方法に続いて、正常条件およびストレス条件での植物のタンパク質のredux応答を研究するための等重体標識など、他の手法を適用してガード細胞シグナル伝達を調べることができます。このビデオを見れば、無傷で生存可能なガード細胞を単離して濃縮する方法、および下流の研究に適した高品質のタンパク質を抽出する方法について十分に理解できるはずです。