マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

この一連のアッセイの全体的な目標は、マウス卵子を使用して減数分裂I中のヒト遺伝子機能を調査することです。これらの方法は、母親の異数性の遺伝的素因があるかどうかなど、人間の生殖分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、マウスの卵子を哺乳類の減数分裂のモデルとして使用することであり、これは遺伝子機能研究のためにヒトの卵子にアクセスできないことを考えると有用です。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、体外受精治療を受けた女性で、母体年齢では胚の異数性率を説明できない女性のエクソームの配列を決定したときでした。画像解析のステップを学ぶのは難しく、厳密な解析パラメータを定義することが厳密性と再現性の鍵となるため、この手法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。バリデーションされたクローニング戦略を使用して、目的遺伝子の完全長コード配列をin vitro転写ベクターのマルチクローニング領域に挿入します。

テキストプロトコルに記載されているように、一塩基多型または挿入および欠失を生成する場合は、DNAを変異化します。次に、変異原性DNAを細菌宿主に変換します。キットを使用してプラスミドを分離および精製するには、製造元の指示に従ってください。

次に、精製されたDNAの単一制限酵素消化を使用して最終生成物を直鎖化します。検証済みのDNAクリーンアッププロトコルまたはキットを使用して消化産物を精製します。そして、30マイクロリットルのRNase/DNaseフリー水で溶出します。

In vitroでは、製造元のプロトコルに従ってT7ポリメラーゼを使用してDNAを転写します。最後に、メーカーのプロトコルに従って、シリカマトリックススピンカラムベースの核酸精製キットを使用して、30 μリットルのRNase/DNaseフリー水でRNAを精製および溶出します。マイクロインジェクションのために卵子を等しいグループに分けます。

一方のグループに実験的なmRNAをマイクロインジェクし、もう一方のグループに野生型コントロールNPBまたはGFP mRNAをマイクロインジェクします。ガラスピペットの開口部が卵子の直径よりわずかに大きい手または口で操作するピペッティング装置を使用して、卵子を胚品質の鉱物油で覆われたペトリ皿内の100マイクロリットル滴のミルリノンフリー培地に移します。次に、卵子を摂氏37度で5%CO2中で7時間インキュベートし、減数分裂Iの中期まで十分に成熟させます。インキュベーション後、同じピペット装置を使用して、卵子をセンターウェルに700マイクロリットルの予冷MEM収集培地、外側リングに500マイクロリットルの水を含むセンターウェル臓器培養皿に移します。

皿を氷の上に7分間置きます。卵子を1x PBS中に400マイクロリットルの2%パラホルムアルデヒドを含む透明なガラススポットプレートのウェルに移すことにより、卵子を固定します。室温で20分間インキュベートします。

免疫染色後、テキストプロトコルに記載されているように、共焦点顕微鏡で40〜63倍の対物レンズを使用して卵子を画像化します。作業目的に最適化されたZ平面で小さなステップをキャプチャし、中期スピンドルの全領域を画像化します。動原体微小管の付着状態を特定するには、まずファイルをImageJツールバーにドラッグして画像を開きます。

開いたZシリーズで、画像のドロップダウンメニューに移動し、[色]サブタブで[チャネルの結合]をクリックして、すべてのチャネルを表示します。分析者は、マウスの卵子で動原体へのどのような種類の付着が可能であるかに精通していることが重要です。画像の品質は、これらのデータを適切に分析する能力に大きく影響します。

画像下部のトグルを使用して、各Zスライスを移動し、動原体微小管の付着を確認します。同じピペット装置を使用して、卵子をオイル下で100マイクロリットル滴のミルリノンフリー培地に移します。卵子を7時間インキュベートして、以前と同様に減数分裂Iの中期に十分な成熟を確保します。

次に、卵子をセンターウェルに700マイクロリットルのモナストロールを含む培地、周囲のリングに400マイクロリットルの水を含むセンターウェル臓器培養皿に移します。摂氏37度で2時間インキュベートします。CZB培地の100マイクロリットルの3滴を通して卵子を移すことにより、モナストロールを洗い流します。

次に、卵子を、センターリングに700マイクロリットルの培養培地とプロテアソーム阻害剤を含む新しいセンターウェル臓器培養皿に移します。外側のリングに400マイクロリットルの水を加え、3時間インキュベートします。次に、卵子をPBS中の2%パラホルムアルデヒド400マイクロリットルを含む透明なガラススポットプレートのウェルに移し、室温で20分間卵子を固定します。

共焦点顕微鏡で40〜63倍の対物レンズを使用して卵子を画像化し、Z平面で1ミクロン未満のステップをキャプチャし、中期紡錘体の全領域を画像化します。染色体のアラインメント状態を特定するには、イメージングソフトウェアを使用して画像ファイルを開きます。次に、画像をImageJコントロールパネルにドラッグします。

オープンZシリーズでは、ポイントツールを使用して、画像内のスピンドルポールの上にツールを配置し、画像をクリックすることにより、各スピンドルポールの両端にあるポイントをそれぞれのZスライスでマークします。これらのポイントをROIマネージャーに追加するには、キーボードのコマンドボタンとTボタンを同時に押します。ROI マネージャーで特定のポイントを強調表示し、[測定] ボタンをクリックして、設定された各位置の特定の座標を決定します。

これにより、各ポイントの X 座標と Y 座標 (それぞれ X1、Y1、X1、Y2 ポイント) を含む Results テーブルが提供されます。次に、真のZ座標を決定します。これは、スピンドルの極が特定されたZスタック内の特定のZスライスのスライス番号にスタックの厚さを掛けることによって行われます。

これらはそれぞれ Z1 ポイントと Z2 ポイントになります。ピタゴラスの定理方程式と以前に定義されたX、Y、およびZ座標を使用して、スピンドルの長さを決定します。次に、スピンドルのミッドゾーンを決定します。

これは、スピンドルの長さの1/2として計算されます。ImageJツールバーの線アイコンをクリックし、1つのスピンドルポールからスピンドルミッドゾーンまでの線を引きます。長さはImageJツールバーに表示されます。

厳密な染色体アライメントパラメータを定義することで、データの再現性に重要な堅牢な定量分析が可能になります。ライン測定ツールを使用して紡錘体ミッドゾーンからの染色体距離を評価することにより、染色体の整列状態を判断します。ImageJツールバーの線アイコンをクリックし、紡錘体ミッドゾーンから染色体まで線を引きます。

長さはImageJツールバーに表示されます。紡錘体ミッドゾーンから4ミクロンを超える染色体は、不整列と見なされます。卵子が免疫染色とイメージングを受けた後、正しい微小管動原体の付着を評価できます。

通常のアタッチメントでは、二価の各姉妹動原体ペアは、反対の極から紡錘体微小管に付着します。最大3種類の異常な付着が観察される可能性があります。1つの例は、動原体に接触する微小管がない場合に発生します。

あるいは、微小管が誤って結合し、シンテリックまたはメロテリックの付着を生成する可能性があります。シンテリックアタッチメントは、1つの極から発せられる微小管に付着した姉妹動原体の両方のペアで形成されます。メロテリックアタッチメントは、ペアの姉妹動原体が反対側の極に取り付けられているときに発生します。

卵子が誘発されたミスアライメントから回復した後、染色体が再整列する能力がイメージングによって評価されます。この例では、1つの染色体の二価は、紡錘体ミッドゾーンから4ミクロン以上に位置しているため、不整列と見なされます。遺伝子変異の機能を評価するのに適したアッセイを選択する際には、研究対象のヒト遺伝子変異が過剰発現していること、および内因性マウスの相同体を同時に枯渇させる必要があることを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、CRISPR-Cas9のようなヒト化マウスの系統を作成する他の方法を実行して、遺伝子変異が卵子や胚の品質にどのように影響するか、個体の生殖の健康に影響を与えるかどうかを理解するなどの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、生殖遺伝学の分野の研究者がヒトの母性異数性の他の原因因子を探求する道を開きました。遺伝子の同定は、強力な診断方法と異数性の矯正研究の基礎を提供する可能性があります。

ご視聴いただきありがとうございました。あなたの実験に頑張ってください。