Name: マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 学ぶマウス卵母細胞を用いた減数分裂I期におけるヒト遺伝子機能評価法。母親由来非整倍体の遺伝的素因を解明し、生殖遺伝学研究の新たな枠組みを提供します。

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この作品は、アメリカ生殖医学会およびチャールズとラトガーズ大学でヨハンナ ブッシュ記念基金研究助成金によって支えられた、k. s. A.L.N. に NJ の州立大学は、N.I.H. (F31 HD0989597) からの助成金によって支えられました。

1. 分子クローニング
<ol><li>興味の遺伝子のフルレングスのコード配列を取得およびプラスミッドの in vitro転写 (pIVT) ベクトル11。 注: 完全長 cDNA クローンは、さまざまなベンダーから市販されているまたは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) を生成することができます。国立生物工学情報 (NCBI) オンライン リソース センターがヌクレオチドから遺伝子のトラン スクリプトのシーケンスを提供し、タグ付きの発現順序 (EST) データベース。蛋白質の容易にするため、可視化と表現のレベル、緑色蛍光タンパク質 (Gfp) の融合または別の適切な蛍光タグの解析クローニング法で必要があります。</li>
	<li>検証済みのクローニング法を使用して、pIVT の複数のクローン作成領域に興味の遺伝子のコーディングのシーケンスを挿入します。分子クローニングの詳細な説明と必要な手順は以前説明した12をされています。 注: 遺伝子融合製品を生成する場合は、クローニングが適切なリーディング ・ フレームであることを確認します。</li>
	<li>グロビンのプライマーを使用して正しい遺伝子挿入、適切なフレームの融合およびポリメラーゼ誘導点突然変異が作成されなかったことを確保するため、構成をシーケンスします。 注: サンガー DNA シークエンス装置が利用できない場合、多くの企業は、低コストの DNA シーケンス オプションを提供します。</li>
	<li>単一のヌクレオチドの多形 (SNPs) または挿入/削除 (オクターリピート) を生成する場合は、DNA を mutagenize します。DNA の変異は、以下手順 1.5 1.7 で説明されます。野生型のコンス トラクターに 1.7 の線形化手順に進みます。</li>
	<li>突然変異誘発のプライマーを設計し、製造元のプロトコルごとの変異の構造を生成する突然変異誘発 PCR の反作用を完了します。Pcr のサイト指示された突然変異誘発は前述の13をされています。さらに、多くの企業は、プロトコルを含むサイト指示された突然変異誘発キットを提供しています。</li>
	<li>人為の DNA を細菌のホストに変換します。分離し、プラスミドを浄化します。 注: 多くの企業は、簡単に分離し、プラスミド DNA を浄化するために使用できるキットを作る。に応じてメーカー プロトコルに従ってください。大腸菌などのグラム陰性細菌株を使用している場合は、エンドトキシンを除去するキットを使用することをお勧めします。</li>
	<li>目的の SNP または塩基の導入を確認する標準のサンガー DNA シーケンスを用いた細菌の形質転換体からの DNA の分離をシーケンスします。</li>
	<li>精製の DNA の単一の制限の酵素の消化力を使用して最終製品をリニア化します。 注: pIVT ベクトルには複数単一酵素プラスミド Addgene 14地図に記載されているサイトをカットが含まれています。</li>
	<li>製品は agarose のゲルの電気泳動による線形であることを確認します。Agarose のゲルの電気泳動の方法論は、定義された14を以前されて。 メモ: すべての残りの手順使用してバリア (フィルター) ピペット ヒントと RNase フリー材料安定かつ高品質な RNA の生産を確保するため。</li>
	<li>検証済みの DNA クリーンアップ プロトコルまたはキットを使用して消化製品を浄化し、30 μ L RNase/DNase 自由な水に溶出します。 注: シリカ マトリックス スピン列ベースのキットは高品質でお勧めは、DNA を精製しました。に応じてメーカー プロトコルに従ってください。</li>
	<li>
体外製造元のプロトコルに続く T7 ポリメラーゼを用いた DNA を転写します。</li>
	<li>浄化し、RNase/DNase 自由水製造元のプロトコルに続くシリカ マトリックス スピン列に基づく核酸精製キットを使用しての 30 μ L の RNA を溶出します。</li>
	<li>変性アガロース電気泳動ホルムアルデヒドを使用して最終的な RNA 製品サイズを確認するを実行します。1.13 1.22 手順14を参照してください。(図 1)。</li>
	<li>水、溶解するまで 72 mL に 1 g アガロースを加熱してゲルを準備し、60 ° C に冷却</li>
	<li>10 X モップ 0.4 M モップ (pH 7.0)、0.1 M 酢酸ナトリウム、0.01 M EDTA を追加して連続したバッファーを準備します。</li>
	<li>10 X モップ冷却アガロース溶液をバッファー、および 37% ホルムアルデヒド (12.3 M) の 18 mL を実行しての 10 mL を追加します。</li>
	<li>カースト ゲル ゲル化コンテナーにアガロース溶液を注ぐことによって。10 μ L を収容できる大きさのくしを使用します。後ゲルを設定している、触れること会社、櫛を慎重に取り外します。</li>
	<li>ゲル電気泳動槽をアセンブルし、十分な 1 X モップ連続したバッファー、ゲルが完全に覆われていることを確認を追加します。</li>
	<li>RNA のサンプルを準備するには、ホルムアルデヒドを含むローディングの染料の 0.5 X ボリュームに RNA の 1 μ g を追加します。</li>
	<li>エチジウム ブロマイドを 10 μ G/ml の濃度で RNA ソリューションに追加します。</li>
	<li>70 ° C、5 分の RNA 試料溶液を変化させなさい。</li>
	<li>滅菌を使用して、10 の μ L フィルターのヒントについては、ロードの分子量マーカー 5 μ L、5 μ L の RNA のゲルの別の井戸に試料や、色素がゲルの長さの少なくとも 3 分の 2 を移行まで 5 V/cm で electrophorese。</li>
	<li>UV トランス照明のゲルで RNA を視覚化します。RNA は、分子量マーカーを比較することによって適切なサイズを確認します。</li>
	<li>濃度と RNA の純度を測定するには、紫外線分光光度計の上で滅菌 10 μ L フィルター チップを使用して浄化された RNA の 1.2 μ L を転送します。 高品質の RNA には A260/280 (1.8 2.2) ・ 260/230 の吸光度比は (> 1.7) それぞれ。</li>
	<li>滅菌 0.5 μ L 遠沈管 (3-5 μ L/チューブ) に 10 μ L フィルター ヒント、因数の残りの浄化された RNA を使用してください。マイクロインジェクションの準備ができるまで-80 ° c チューブを格納します。 注: 500 ng/μ L の最終注入濃度は最適な出発点です。1:2 で RNase フリー H20 マイクロインジェクション マイクロインジェクション ピペットで RNA の粘着性を減らすために前に RNA を希釈することをお勧めします。</li>
</ol>2 動原体微小管添付ファイルの分析
<ol><li>卵母細胞をマイクロインジェクションの等しいグループに分割します。 注: 採卵、転送、マイクロインジェクション、成熟の詳細に説明されてゼウスで以前15。</li>
	<li>実験的 mRNA に 1 つのグループと WT コントロールと PBS またはGfpとその他のグループを microinject mRNA。 注: 500 ng/μ L は10で始まるに推奨される注入濃度です。注入量を制御するために picoinjector を使用できます。5-10 pL の注入量は15をお勧め。</li>
	<li>胚品質鉱物油で卵 (100-150 μ m)、シャーレでの培養液のミルリノン無料 100 μ L ドロップに転送卵子の直径より大きいカバーの手またはガラス ピペットのオープニング式分注装置は少し口を使用して卵母細胞の減数分裂中期に十分な成熟を許可する 5% C02の 37 ° C で 7 時間孵化させなさいと私 (私に会った) 15。</li>
	<li>上記のように、同じピペット装置を用いた培養後転送中古冷蔵最低限不可欠なメディア (MEM) コレクション中よくセンターの 700 μ L と 500 μ L H20 外リングを含むセンターよく器官培養皿に卵と場所は 7 分間氷の上の皿。 注: 事前 MEM メディアをリラックスして卵子の治療前に少なくとも 20 分-20 ° C で臓器の培養皿でセンターもそれをお勧めします。</li>
	<li>室温で 20 分間 1x PBS で 2% パラホルムアルデヒドの 400 μ L を含む透明なガラス スポット プレートのウェルにピペットの装置を使用してそれらを移すことによって卵子を修正します。</li>
	<li>同じを使用して装置のピペット、400 μ L ブロッキング液 (PBS + 0.3 %bsa + 0.01% Tween 20 + 0.02% ナン3) とストアを含むスポット プレートに別のウェルに卵子を転送免疫染色を処理する準備ができるまで 4 ° c。 注: の 4 ° C、カバーガラス スポット板パラフィルム蒸発を防ぐために、卵を保存します。</li>
	<li>同じピペットなどの器具を使用して、スポットの新しい井戸に転送を卵母細胞含んでいる 400 μ L 透過ソリューション (PBS + 0.3 %bsa + 0.1% TritonX 100 + 0.02% ナン3) をプレートし、3 つを素早く転送卵子で 20 分間室温でインキュベート滴 400 μ L の任意の残留洗剤を削除する解決を妨げます。 注: 9 も透明なガラス スポット プレートは単一の皿 (ステップ 2.4 2.5) 複数の治療を通じてグループを移動に適しています。</li>
	<li>室温で光から保護加湿チャンバーで残りの各種手順を実行します。中型のプラスチック容器の使用は、湿気があるペーパー タオルとアルミ箔でカバーが並んでいます。</li>
	<li>卵母細胞を 30 μ L ピペット装置を使用して、転送 96 ウェル プレートと 10 分加湿チャンバ内の場所の蓋の解決を妨げます。 注: 滴板に円形のインデントに配置されます。</li>
	<li>セントロメアとスピンドル、ピペットなどの器具を使用してラベルを付け、卵を 30 μ に転送する (ACA、クレスト) 抗セントロメア抗原を含む溶液をブロック (1:30) と抗アセチル化チューブリン (1: 1000) し、少なくとも 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>10 分解決を妨げる 3 つの 30 μ L 滴を介して転送することによって卵子をすすいでください。</li>
	<li>ピペット装置、転送卵子を用いて 30 μ L にブロッキング溶液で二次抗体抗体 (抗ひと IgG 1: 200、1: 200 抗マウス IgG) 上で使用する無料のドロップし、1 時間孵化させなさい。</li>
	<li>3、30 μ L の 10 分洗浄手順を繰り返します手順 2.11 で説明したソリューションをブロックします。</li>
	<li>3-5 μ L 中含む DAPI をマウントにピペットの装置を使用して、卵を転送 (5.9 μ g/μ L) ガラス顕微鏡スライドの上。</li>
	<li>卵母細胞の破砕を防ぐためカバー スリップのコーナーにワセリンの 4 小滴 (ピンの頭のサイズ) を配置します。</li>
	<li>ダウン スライドにカバー スリップ石油ゼリー側をそっと置きます。</li>
	<li>シールの coverslip のエッジ マニキュアをオフにし 5 分間乾かします。</li>
	<li>共焦点顕微鏡による処理まで、光から保護されて、4 ° C でスライドを保存します。 注: は、取り付け中、coverslip、マッチの屈折を利用されている顕微鏡の対物レンズを確認します。材料は以前されている推奨の取り付けは、 15をについて説明します。</li>
	<li>画像の小さなステップをキャプチャ、共焦点顕微鏡による 40 63 × 対物卵母細胞 (≤ 1 μ m) 作業目的とイメージ中期スピンドルの地域全体の最適化された z 平面で。 注: 2.11 のステップで使用される特定の二次抗体に基づくすべての 3 チャンネルのイメージを確認します。≥ 4 と 3 のズーム画像は十分な解像度に最適です。1 μ m のステップ サイズは、微小管と体マウス卵母細胞で明確に可視化を提供します。イメージをキャプチャするための手順は、顕微鏡から異なります。顕微鏡設定の構成方法の手順については特定メーカー共焦点のユーザーズ ガイドを参照してください。</li>
	<li>次の以下の手順による 2.21 2.23 イメージング ソフトウェアを使用して動原体微小管の添付の状態を識別します。 注: 次の手順説明画像 J (NIH) 無料ダウンロード可能なソフトウェアを使用してこの手順は、ただし、代替のイメージング ソフトウェアを使用できます。されていた種類の添付の状態は、 16を定義されています。</li>
	<li>画像 J ツール バーにファイルをドラッグすると、画像を開く。</li>
	<li>開設の z シリーズを全チャンネル表示 (DNA、動原体、及びスピンドル) [サブ] タブで「色」「チャンネル統合を」、「イメージ」のドロップ ダウン メニューで利用可能なをクリックして。</li>
	<li>切り替えを使用すると、画像の下部に、各 z スライスを移動し、動原体微小管添付ファイルを決定します。以前の説明はされている詳細な添付ファイル説明16
</li>
</ol>3. 染色体配置の課題分析
<ol><li>2.3 の手順で説明されているようにピペットの装置を使用して、ミルリノン無料文化中油滴 100 μ L に卵子を転送し、卵母細胞の減数分裂中期に十分な成熟を許可するように 7 時間孵化させなさい私 (私に会った) 2.3 17 の手順で前述のよう. 注: 卵母細胞成熟、マイクロインジェクション、コレクションの手順を概説した15。手順 2.1 2.2 コントロール、および RNA マイクロインジェクション濃度で添付ファイルの試金のプロトコルを参照してください。</li>
	<li>同じピペットなどの器具を使用して、転送センターよく器官培養卵母細胞でセンターも、400 μ L H20 周囲のリングである [100 μ M] を含む含む 700 μ L 培養液中の料理し、37 ° C 2 時間インキュベートします。</li>
	<li>モナス トロール 100 μ CZB 培地の 3 つの滴を上記としてピペット装置を用いて卵を移すことによって洗い落として、700 μ L 培養培地 + MG132 を含む新しいセンターも器官培養皿に卵を転送 [5 μ M] 中心の 3 時間リング。外リングに 400 μ L H20 を追加します。</li>
	<li>室温で 20 分間 PBS で 400 μ L 2% パラホルムアルデヒドを含む透明なガラス スポット プレートのウェルにピペットの装置を使用して、それらを転送することによって卵子を修正します。</li>
	<li>転送の卵母細胞を固定後、400 μ L を含む、透明なガラスのスポット プレートの新しい井戸にピペットの装置を使用してブロッキング液およびストアまで 4 ° C での免疫染色の処理します。 注: の 4 ° C、カバーガラス スポット板パラフィルム蒸発を防ぐために、卵を保存します。</li>
	<li>Permeabilize し、免疫細胞化学を介して卵母細胞 2.6 2.16 の手順で説明するようにラベルを付けます。</li>
	<li>卵母細胞を共焦点顕微鏡 40 63 x 目的を使用して、キャプチャを画像 < 中期紡錘体の全体の地域をイメージを確かめて z 平面の 1 μ m のステップします。</li>
	<li>染色体の整列を識別するためには、状態は、イメージング ソフトウェアを使用してイメージ ファイルを開きます。 注: 次の手順説明画像 J (NIH) 無料ダウンロード可能なソフトウェアを使用してこの手順は、ただし、代替のイメージング ソフトウェアを使用できます。</li>
	<li>イメージをイメージ J コントロール パネルにドラッグします。</li>
	<li>開設の z シリーズ (コントロール バーで画像 J ポイント ツール アイコンをクリックして利用可能な) ポイント ツールを使用してイメージをクリックすると画像でスピンドル極上にツールを置く彼らのそれぞれの z スライスで各スピンドル極端ポイントをマークします。キーボードのコマンド + t を押すことによって利益 (率 ROI) マネージャーの地域にこれらのポイントを追加します。</li>
	<li>各 ROI マネージャーの特定のポイントを強調表示し、測定ボタンをクリックすると手順 3.10 で設定位置の特定の座標を決定します。これは、結果を提供するテーブルを含む x と各ポイントの y 座標。これらそれぞれ X1、Y1、および Y2、X1 のポイントになります。</li>
	<li>次に、true Z 座標を決定します。これはスピンドル極が識別された z スタックで特定の z スライスのスライス数を乗算することによって (すなわち6 スライス #2) 個々 の各ポイントは、スタックの厚さ (すなわち1 μ m) を (例: スライス 2 x 1 μ m = 2)。これらそれぞれ Z1 と Z2 のポイントになります。</li>
	<li>ピタゴラスの定理の式を使ってスピンドル長さを決定 (2 + b2 = c の2) 以前に定義したを使用して x、y、および z 座標を 3.11 3.13 の手順から。最終的な長さは、各スピンドルに等しい。 √((X1-X2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2)</li>
	<li>スピンドル midzone を決定します。これはスピンドルの長さの 1 つの半分として計算されます。画像 J ツール バーの線アイコンをクリックして画像 J で [線] ツールを使用して、主軸 midzone は、1 つのスピンドル極から線を引きます。長さは、イメージ J ツール バーに表示されます。</li>
	<li>ライン計測ツールを使用スピンドル midzone から染色体の距離を評価することによって染色体位置揃えの状態を決定します。画像 J ツール ・ バーの線アイコンをクリックして利用できる [線] ツールを使用して、染色体にスピンドル midzone から線を引きます。長さは、イメージ J ツール バーに表示されます。スピンドル midzone から 4 μ m より大きい染色体は、不整列18と見なされます。</li>
</ol>

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著者が明らかに何もありません。

病気に関連付けられている人間の遺伝的変異の迅速かつ増加の識別のための生物学的意義を評価するシステムが確立されているが不可欠です。人間の卵子は貴重なまれな、人間の精子で遺伝子操作を受けやすいので人間減数分裂ポーズ特定課題におけるタンパク質の機能を理解します。マウス卵母細胞は減数分裂遺伝子機能10,23を評価する貴重な哺乳類モデル システムです。このモデルは、女性に影響を与える可能性がありますどのように遺伝的変異を理解するために有用である一方、減数分裂ひと生殖細胞に類似したを受ける低コストで操作可能の卵子の容易に利用可能なソースを提供しながら人間の卵を使用しての impracticalities をバイパスします。不妊です。
これらのメソッドは、マイクロインジェクションを介してマウス卵母細胞の人間蛋白質の異所性発現を採用して、ので、最初コントロール、成熟は変わりません野生型 RNA 濃度を確立する重要です。成熟速度があることをお勧めしますがベースライン パラメーター、お...

不妊症は、生殖年齢の1、そこからほぼ半分を求める医療2人の人口の 10-15% に影響を与える条件です。不妊症の病因は多様であるが、多因子の多くの場合、人間の最も一般的な遺伝的異常は異数性胚3です。異数性は、細胞内の染色体の正しい数の偏差 (ゲインまたはロス) として定義されます。ヒト胎芽における異数性の現象は、一般的な高齢出産4、5と増加します。この戦略の結果、増加注入率、流産率の低下と時間の短縮のため子宮の転送の唯一の染色体正常 (欠) 胚の選択の利点を強調している 4 つのランダム化比較試験妊娠6,7,8,9を達成します。したがって、人間の異数性の病因を理解すること、生殖補助医療に重要な意味を持つことができます。
染色体異常で着床前遺伝子検査は不妊治療に有益であるが、染色体異常の発生の理解はまだ欠けています。減数分裂期の染色体異常 (配偶子生産の間に由来) と母親の年齢、しかし、いくつか女性存在異数性胚率の恵まれた時代4の平均レートを逸脱した正の相関関係があることを広く受け入れられています。これらのケースは、年齢だけが常に異数性胚を生成するリスクの予測ではないことをお勧めします。他の要因は遺伝子変異など胎児の異数性のリスクを増加させる役割を果たす可能性があります。
卵母細胞の減数分裂の間に異数性の遺伝子の変形の潜在的な貢献の調査の重要な側面は、減数分裂遺伝子機能を迅速に評価するシステムを設計することです。倫理的な制約と制限付きアクセスのため、卵子を使用してこれらのテストを実行する実用的ではありません。マウス卵母細胞を使用して、これらの問題を回避ことができます、ここで減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために試金のシリーズ私は説明しました。マウス卵人間蛋白質の局在化の可視化し、野生型および変異人間蛋白質の異所性発現結果いずれかのかどうかを判断するために使用によって興味の遺伝子の変形のためメッセンジャー RNA (mRNA) のコーディングを microinjecting、異数性につながることができる表現型の変化。これらの表現型は、動原体と重要な減数分裂 i 中期の染色体の整列をサポートすることができない妹に不適切に接続する微小管の増加、利得と機能の損失を調査するこのプロトコルを使用することができます。よう卵母細胞の減数分裂のキー イベントに挑戦する実験的条件を確立することによって遺伝的変異は、建物と染色体の整列10 をスピンドルします。

<table><tbody><tr><td>0.2 mL Seal-Rite PCR tube</td><td>USA Scientific</td><td>1602-4300</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0313</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0243</td><td></td></tr><tr><td>6X DNA loading Dye</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>9-well glass spot plate</td><td>Thomas Scientific</td><td>7812G17</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清由来アルブミン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A3294&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-fluor-568 抱合型抗マウスIgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21050</td><td>1:200 希釈</td></tr><tr><td>Alexa-fluor-633 抱合型抗ヒトIgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21091</td><td>1:200 希釈</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>VWR</td><td>AA0356</td><td></td></tr><tr><td>防振テーブル</td><td>Technical Manufacturing Corp</td><td></td><td>任意の標準モデル</td></tr><tr><td>抗アセチル化チューブリン抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7451</td><td>1:100 diution</td></tr><tr><td>抗セントロメア(CREST)抗体</td><td>抗体 Incorportated</td><td>15-234</td><td>1:30 希釈&nbsp;</td></tr><tr><td>バリア(フィルター)ピペットチップ</td><td>Thermo Scientific</td><td>のAM12635</td><td>お使いのピペッターのブランドと互換性があることを確認してください。これらはEppendorfブランドのピペッターと互換性があります。</td></tr><tr><td>BD Difco 脱水培養液: LB 寒天、Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0445-07-6</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco 脱水培養液: LB Broth, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>毛細管</td><td>チューブ Sutter</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Center Well 臓器培養皿</td><td>VWR</td><td>25381-141</td><td></td></tr><tr><td>CO2 タンク</td><td></td><td></td><td>インキュベーター</td></tr><tr><td>用 共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td>任意の標準モデル</td></tr><tr><td>遠心分離機 (冷却能力付き)</td><td>トーマス・サイエンティフィック</td><td></td><td>任意の標準モデル&nbsp;</td></tr><tr><td>カバーガラス 11 x 22 mm</td><td>トーマス・サイエンティフィック</td><td>6663F10</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>トーマス・サイエンティフィック</td><td>6663-F10</td><td>厚さは特定の顕微鏡によって異なります</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DEPC H20</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ AM9922</td><td></td></tr><tr><td>デジタルドライバス</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>888700001</td><td></td></tr><tr><td>イージー A ハイフィデリティクローニング酵素</td><td>Agilent</td><td>600400</td><td>DNAクローニング用&nbsp;</td></tr><tr><td>pIVTを直鎖化するための酵素</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>NdeIまたはKasIを使用できます</td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>Thermo Scientific</td><td>155585011</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡&nbsp;</td><td></td><td></td><td>任意の蛍光顕微鏡を使用することができます</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド (37%)</td> <td>サーモフィッシャーサイエンティフ</td><td>9311</td><td></td></tr>ホル<tr><td>ムアルデヒドRNAローディング色素</td><td>アンビオン</td><td>8552</td><td></td></tr><tr><td>つや消し顕微鏡スライド(未充電) 25X75 mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>全長cDNAクローン</td><td></td><td></td><td>オープンリーディングを提供する任意のベンダーから入手できますフレームクローン</td></tr><tr><td>ゲル電気泳動装置</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td>任意の標準モデル</td></tr><tr><td>ガラス パスツール ピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>pIVTコンストラクト</td><td></td><td></td>用グロビンフォワードプライマー <td>5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'.&nbsp;カスタムオリゴヌセロチドを生成する任意の会社から購入することができます</td></tr><tr><td>pIVTコンストラクト</td><td></td><td></td><td>5 '-ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3 'は、カスタムオリゴヌセロチドを生成する任意の会社から購入することができます</td></tr><tr><td>ピペットを保持している</td><td>エッペンドルフ</td><td>930001015</td><td>Vacutip</td></tr><tr><td>加湿チャンバー</td><td></td><td></td><td>タッパーウェアは、</td></tr><tr><td>Illustra Ready-To-Goを使用することができますRT-PCRビーズ</td><td>GEライフサイエンス</td><td>27925901</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td></td><td></td><td>CO2およびウォータージャケット技術を搭載した任意の標準モデル</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ニコン製機器</td><td></td><td>任意の標準モデル</td></tr><tr><td>画像J(NIH) ソフトウェア</td><td>NIH</td><td></td><td>画像解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>96ウェルプレートの蓋</td><td>Nalgene Nunc International</td><td>263339</td><td></td></tr><tr><td>低接着性0.5mL微量遠心チューブ</td>USA <td>Scientific</td><td>1405-2600</td><td></td></tr><tr><td>MacVector&nbsp;</td><td>MacVector</td><td></td><td>シーケンス解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>MG132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ミレニアムRNAマーカー-ホルムアルデヒド&nbsp;</td><td>アンビオン</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>ミルリノン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>M4659</td><td>DMSO at 2.5mM</td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>使用済み 胚試験済み、滅菌ろ過済み</td></tr><tr><td>Monastrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8515</td><td>DMSO at 100 mM</td></tr><tr><td>マウスピース</td><td>Biodiseno</td><td>MP-001-Y</td><td></td></tr><tr><td>N2 タンク</td><td></td><td></td><td>防振テーブル</td></tr><tr><td>用マニキュア;クリア</td><td></td><td></td><td>任意のクリアマニキュアを使用することができます</td></tr><tr><td>ナノドロップ マイクロボリューム UV-Vis分光光度計</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td>任意の標準モデル</td></tr><tr><td>NorthernMax 10X 変性ゲルバッファー</td><td>ライフテクノロジー</td><td>AM8676</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax 10X ランニングバッファー</td><td>ライフテクノロジー</td><td>AM8671</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS ランニングバッファー</td><td>サーモ Scnentific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>オルガン培養皿 60x15mm</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>08-772-12</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>ポリサイエンシズ&nbsp;</td><td></td><td></td>577773</tr><tr><td>PCR サーマルサイクラー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>ペトリディッシュ 139 mm</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフ</td><td>501V</td><td></td></tr><tr><td>ペトリディッシュ 35 mm</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフ</td><td>121V</td><td></td></tr><tr><td>ペトリディッシュ 60 mm</td><td>ファルコン BD</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>ピコインジェクター</td><td>XenoWorks デジタルマイクロインジェクター</td><td></td><td>任意の標準モデル</td></tr><tr><td>ピペットプーラー</td><td>Flaming-Brown マイクロピペットプーラー</td><td>モデルP-1000</td><td></td></tr><tr><td>pIVTプラスミド</td><td>AddGene</td><td>32374</td><td>卵子の発現に適した空のベクターです。</td></tr><tr><td>妊娠中の牝馬血清ゴナドトロピン</td><td>Lee BioSolutions</td><td>493-10</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep スピン Miniprep キット</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>最大20 uLのプラスミドDNAの精製</td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Quikchange II部位指向突然変異誘発キット</td><td>Agilent&nbsp;</td><td></td><td>挿入および欠失のための200523突然変異導入キット</td></tr><tr><td>Quikchange lightning マルチサイト指向性突然変異導入キット</td><td>Agilent&nbsp;</td><td></td><td>単一サイト変更のための210512突然変異導入キット</td></tr> は<tr><td>さみ(ファインポイント)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>はさみ(ミディアムポイント)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>WP114225</td><td></td></tr><tr><td>シールライト 1.5 mL マイクロ遠心チューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>スライドウォーマー</td><td></td><td></td><td>任意の標準モデル</td></tr><tr><td>分光光度計 (ナノドロップ)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td></td><td></td><td>任意の標準モデル</td></tr><tr><td>サブクローニング 効率 DH5a コンピテントセル サー</td><td>モフィッシャーサイエンティフ</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>309623</td><td>1 ml, 27G(1/2)</td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T7 mMessage マシン 高収率キャップ付きRNA転写キット</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>x-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274348</td><td></td></tr><tr><td>Tweezer (細点-サイズ5)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>SN.743.12.1</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>UVP UV/White Lite トランスイルミネーター</td><td>Fisher Scientific</td><td>UV95041501</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

異数性胚は人間の不妊の主要な遺伝的原因です。これらのイベントのほとんどが女性の減数分裂の間としています、時代だけでが常に異数性胚の生成の危険性の予測ではないとはいえ、母親の年齢との相関します。したがって、遺伝子変異は卵形成中に不適切な染色体分配を考慮可能性があります。人間の卵子へのアクセスが研究目的に限られていることを考える私マウス卵母細胞減数分裂の間人間遺伝子の働きを研究するアッセイのシリーズが開発されました。まず、興味の遺伝子の変異と遺伝子のメッセンジャー RNA (mRNA)、前期私逮捕マウス卵母細胞に microinjected します。式のための時間を許可すると後、卵子は同期的に成熟減数分裂を完了するために放出される私。緑色蛍光タンパク質 (Gfp) などの蛍光レポーターのシーケンスを持つ mRNA をタグによって表現型の変化に加えて人間蛋白質のローカリゼーションを評価できます。たとえば、ゲインまたは機能の損失は、減数分裂エラーを修正する遺伝子プロダクトを挑戦実験の条件を確立することによって調べることができます。蛋白質の表現は内因性のレベルでないことを考えると、(すなわちノック制御しない限り、結果の適切な解釈を行わなければならないこのシステムはとりこませた人間蛋白質機能の調査に有利であるが、うち上下)、マウスのホモログがシステムに存在も。

培養後、A260/A280 率 (1.8 2.2) と分光光度計を使用して測定したとき A260/A230 比 ≥1.7 高品質 RNA があります。図1 図の試験管内での移行-変化の agarose のゲルの電気泳動後 RNA を生産します。パターンやサイズの複数のバンドを持つサンプルで塗られるバンドが汚染またはサンプルの劣化のことを示します。また、複数のバンドは、mRNA を完全に変性していないか、開始のプラスミッドは完全に線形補間されるのではないを示す可能性があります。MRNA は、mRNA体外の安定した表現を可能にする pIVT に組み込まれているポリ adenylated テールのため予想より大きな実行されます。マイクロインジェクションの後は、均一な注入量と蛍光発現レベルを確保することをお勧めします。図 2の写真は、前期Gfpを均一に注入した私逮捕卵母細胞を示しています。一...

人間の病気に関連する遺伝子の変異は明らかになるを開始するにつれて急速に識別された亜種の生物学的意義を評価するシステムの開発がますます重要になっております。このプロトコルでは、私はマウス卵母細胞を使用して女性の減数分裂の間人間遺伝子の働きを評価する方法について説明します。

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

この一連のアッセイの全体的な目標は、マウス卵子を使用して減数分裂I中のヒト遺伝子機能を調査することです。これらの方法は、母親の異数性の遺伝的素因があるかどうかなど、人間の生殖分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、マウスの卵子を哺乳類の減数分裂のモデルとして使用することであり、これは遺伝子機能研究のためにヒトの卵子にアクセスできないことを考えると有用です。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、体外受精治療を受けた女性で、母体年齢では胚の異数性率を説明できない女性のエクソームの配列を決定したときでした。画像解析のステップを学ぶのは難しく、厳密な解析パラメータを定義することが厳密性と再現性の鍵となるため、この手法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。バリデーションされたクローニング戦略を使用して、目的遺伝子の完全長コード配列をin vitro転写ベクターのマルチクローニング領域に挿入します。テキストプロトコルに記載されているように、一塩基多型または挿入および欠失を生成する場合は、DNAを変異化します。次に、変異原性DNAを細菌宿主に変換します。キットを使用してプラスミドを分離および精製するには、製造元の指示に従ってください。次に、精製されたDNAの単一制限酵素消化を使用して最終生成物を直鎖化します。検証済みのDNAクリーンアッププロトコルまたはキットを使用して消化産物を精製します。そして、30マイクロリットルのRNase/DNaseフリー水で溶出します。In vitroでは、製造元のプロトコルに従ってT7ポリメラーゼを使用してDNAを転写します。最後に、メーカーのプロトコルに従って、シリカマトリックススピンカラムベースの核酸精製キットを使用して、30 μリットルのRNase/DNaseフリー水でRNAを精製および溶出します。マイクロインジェクションのために卵子を等しいグループに分けます。一方のグループに実験的なmRNAをマイクロインジェクし、もう一方のグループに野生型コントロールNPBまたはGFP mRNAをマイクロインジェクします。ガラスピペットの開口部が卵子の直径よりわずかに大きい手または口で操作するピペッティング装置を使用して、卵子を胚品質の鉱物油で覆われたペトリ皿内の100マイクロリットル滴のミルリノンフリー培地に移します。次に、卵子を摂氏37度で5%CO2中で7時間インキュベートし、減数分裂Iの中期まで十分に成熟させます。インキュベーション後、同じピペット装置を使用して、卵子をセンターウェルに700マイクロリットルの予冷MEM収集培地、外側リングに500マイクロリットルの水を含むセンターウェル臓器培養皿に移します。皿を氷の上に7分間置きます。卵子を1x PBS中に400マイクロリットルの2%パラホルムアルデヒドを含む透明なガラススポットプレートのウェルに移すことにより、卵子を固定します。室温で20分間インキュベートします。免疫染色後、テキストプロトコルに記載されているように、共焦点顕微鏡で40〜63倍の対物レンズを使用して卵子を画像化します。作業目的に最適化されたZ平面で小さなステップをキャプチャし、中期スピンドルの全領域を画像化します。動原体微小管の付着状態を特定するには、まずファイルをImageJツールバーにドラッグして画像を開きます。開いたZシリーズで、画像のドロップダウンメニューに移動し、[色]サブタブで[チャネルの結合]をクリックして、すべてのチャネルを表示します。分析者は、マウスの卵子で動原体へのどのような種類の付着が可能であるかに精通していることが重要です。画像の品質は、これらのデータを適切に分析する能力に大きく影響します。画像下部のトグルを使用して、各Zスライスを移動し、動原体微小管の付着を確認します。同じピペット装置を使用して、卵子をオイル下で100マイクロリットル滴のミルリノンフリー培地に移します。卵子を7時間インキュベートして、以前と同様に減数分裂Iの中期に十分な成熟を確保します。次に、卵子をセンターウェルに700マイクロリットルのモナストロールを含む培地、周囲のリングに400マイクロリットルの水を含むセンターウェル臓器培養皿に移します。摂氏37度で2時間インキュベートします。CZB培地の100マイクロリットルの3滴を通して卵子を移すことにより、モナストロールを洗い流します。次に、卵子を、センターリングに700マイクロリットルの培養培地とプロテアソーム阻害剤を含む新しいセンターウェル臓器培養皿に移します。外側のリングに400マイクロリットルの水を加え、3時間インキュベートします。次に、卵子をPBS中の2%パラホルムアルデヒド400マイクロリットルを含む透明なガラススポットプレートのウェルに移し、室温で20分間卵子を固定します。共焦点顕微鏡で40〜63倍の対物レンズを使用して卵子を画像化し、Z平面で1ミクロン未満のステップをキャプチャし、中期紡錘体の全領域を画像化します。染色体のアラインメント状態を特定するには、イメージングソフトウェアを使用して画像ファイルを開きます。次に、画像をImageJコントロールパネルにドラッグします。オープンZシリーズでは、ポイントツールを使用して、画像内のスピンドルポールの上にツールを配置し、画像をクリックすることにより、各スピンドルポールの両端にあるポイントをそれぞれのZスライスでマークします。これらのポイントをROIマネージャーに追加するには、キーボードのコマンドボタンとTボタンを同時に押します。ROI マネージャーで特定のポイントを強調表示し、[測定] ボタンをクリックして、設定された各位置の特定の座標を決定します。これにより、各ポイントの X 座標と Y 座標 (それぞれ X1、Y1、X1、Y2 ポイント) を含む Results テーブルが提供されます。次に、真のZ座標を決定します。これは、スピンドルの極が特定されたZスタック内の特定のZスライスのスライス番号にスタックの厚さを掛けることによって行われます。これらはそれぞれ Z1 ポイントと Z2 ポイントになります。ピタゴラスの定理方程式と以前に定義されたX、Y、およびZ座標を使用して、スピンドルの長さを決定します。次に、スピンドルのミッドゾーンを決定します。これは、スピンドルの長さの1/2として計算されます。ImageJツールバーの線アイコンをクリックし、1つのスピンドルポールからスピンドルミッドゾーンまでの線を引きます。長さはImageJツールバーに表示されます。厳密な染色体アライメントパラメータを定義することで、データの再現性に重要な堅牢な定量分析が可能になります。ライン測定ツールを使用して紡錘体ミッドゾーンからの染色体距離を評価することにより、染色体の整列状態を判断します。ImageJツールバーの線アイコンをクリックし、紡錘体ミッドゾーンから染色体まで線を引きます。長さはImageJツールバーに表示されます。紡錘体ミッドゾーンから4ミクロンを超える染色体は、不整列と見なされます。卵子が免疫染色とイメージングを受けた後、正しい微小管動原体の付着を評価できます。通常のアタッチメントでは、二価の各姉妹動原体ペアは、反対の極から紡錘体微小管に付着します。最大3種類の異常な付着が観察される可能性があります。1つの例は、動原体に接触する微小管がない場合に発生します。あるいは、微小管が誤って結合し、シンテリックまたはメロテリックの付着を生成する可能性があります。シンテリックアタッチメントは、1つの極から発せられる微小管に付着した姉妹動原体の両方のペアで形成されます。メロテリックアタッチメントは、ペアの姉妹動原体が反対側の極に取り付けられているときに発生します。卵子が誘発されたミスアライメントから回復した後、染色体が再整列する能力がイメージングによって評価されます。この例では、1つの染色体の二価は、紡錘体ミッドゾーンから4ミクロン以上に位置しているため、不整列と見なされます。遺伝子変異の機能を評価するのに適したアッセイを選択する際には、研究対象のヒト遺伝子変異が過剰発現していること、および内因性マウスの相同体を同時に枯渇させる必要があることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、CRISPR-Cas9のようなヒト化マウスの系統を作成する他の方法を実行して、遺伝子変異が卵子や胚の品質にどのように影響するか、個体の生殖の健康に影響を与えるかどうかを理解するなどの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、生殖遺伝学の分野の研究者がヒトの母性異数性の他の原因因子を探求する道を開きました。遺伝子の同定は、強力な診断方法と異数性の矯正研究の基礎を提供する可能性があります。ご視聴いただきありがとうございました。あなたの実験に頑張ってください。

using-mouse-oocytes-to-assess-human-gene-function-during-meiosis-i

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

このプロトコルは、マウスの卵管から卵母細胞や初期段階の受精卵を抽出する手法を示しています。...

マウス卵母細胞の検索

卵母細胞が減数分裂成熟中に染色体の分離の誤差による異数性になりやすいです。異数体卵は不妊、流産やダウン症などの発達障害を引き起こす可能性があります。ここでは、卵母細胞と減数分裂成熟を研究し、倍数性を評価する方法に選択の材料を導入する方法を説明します。...

マウス卵母細胞のマイクロインジェクション、成熟および倍数性評価

ここでは、マウス卵母細胞で減数分裂スピンドルアセンブリと組織を評価するために、免疫蛍光分析に続いて、特定のsiRNA媒介mRNAの枯渇のためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、転写物のin vitroでの枯渇と異なるスピンドルおよび/ ​​または卵母細胞におけるMTOC関連因子の機能評価に適しています。...

siRNA媒介サイレンシングによるマウス卵母細胞における減数分裂紡錘体の評価

成熟したショウジョウバエ卵子の収集、調製、イメージングのためのプロトコールを提示します。これらの方法により、減数分裂中の染色体の挙動と紡錘体の組み立てと機能の視覚化が可能になります。...

固定における減数分裂Iのイメージング前中期および中期のための技術<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

哺乳類の卵形成がエラーを起こしやすい、染色体の紡錘のために特に知られています。この原稿は、マウス前期, クロマチンを広める準備方法をについて説明します中期私と卵母細胞の II...

クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備

近赤外フェムト秒レーザーを用いた中期I期にマウス卵母細胞の細胞質微小管組織化中心の枯渇を可能にする最適化されたプロトコルを提示します。...

マウス卵母細胞における細胞質微小管組織化中心の多光子レーザーアブレーション

染色体分配の誤りは、卵母細胞に共通する特徴です。したがって、紡錘体アセンブリのチェックポイントを研究することは、健康な卵を生産するために必要なメカニズムについての重要な手がかりを与えます。本プロトコルは、マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性を評価するための3つの相補的アッセイを記載する。...

マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性の評価

卵母細胞のゲノムの完全性を維持することは、結果として生じる胚の遺伝的忠実度を確保するために必要です。ここでは、哺乳類の雌生殖細胞におけるDNA二本鎖切断を検出するための正確なプロトコルを提示します。...

マウス卵母細胞におけるDNA二本鎖切断の検出

このプロトコルはマウス卵母細胞系の核形そして内部膜のない細胞小器官に対する細胞骨格の物理的な影響を文書化するために実験フレームワークを提供する。このフレームワークは、他の細胞タイプやコンテキストでの使用にも適合させることができます。...

マウス卵母細胞核の細胞骨格に基づく攪拌を空間スケールで捉える

シナプスと組換えの減数分裂エラーは、哺乳類の卵母細胞に共通しています。これらのプロセスに関与するタンパク質の厳密な分析は、卵子形成がどのように、そしてなぜしばしばうまくいかないのかを理解するために不可欠です。ここで紹介する技術により、組換えとシナプスを包括的にモニタリングし、マウスの卵子の質を評価することができます。...

シナプシスおよび組換えの評価のためのマウス卵母細胞からの減数分裂染色体スプレッドの調製

学ぶマウス卵母細胞を用いた減数分裂I期におけるヒト遺伝子機能評価法。母親由来非整倍体の遺伝的素因を解明し、生殖遺伝学研究の新たな枠組みを提供します。

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

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