検出細胞毒性アミロイド次感染症の肺による内皮細胞緑膿菌法
2018年7月12日
簡単な方法は、緑膿菌による肺血管内皮細胞の感染細胞傷害性のアミロイドの生産の「論証の説明します。
この方法は、院内感染肺炎を生き延びた患者がなぜこれほどまでに長期的な転帰が悪いのかなど、呼吸器医療分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の利点は、シンプルで信頼性が高いため、研究室に来た誰でも教えることができ、翌日には有用で再現性のあるデータを生成することができることです。これらの分析方法は、in vitroで培養細胞の感染に関する洞察を得るために適用できますが、動物モデルやヒト患者にも適用できます。
細胞傷害性上清を産生するには、150センチメートルの内皮細胞の皿をHBSSで洗浄し、緑膿菌コロニーを540ナノメートルで0.25の吸光度に希釈します。細菌細胞をさらに希釈して、HBSSの20ミリリットルに20〜1の感染の多様性を可能にし、内皮細胞のプレートに細菌を播種します。次に、感染した細胞を摂氏37度、5%CO2のインキュベーターに4〜5時間置きます。
細菌と内皮細胞のインキュベーションが適切な時間行われることが不可欠です。インキュベーションが短すぎると、アミロイドは上清に放出されません。インキュベーションが長すぎると、細胞は実際に溶解し、すべての内容物を上清に放出します。
適切なインキュベーション期間に使用する指標は、内皮単分子膜にギャップが形成されることです。光学顕微鏡で細胞単層にギャップが観察される場合は、遠心分離のために上清を採取し、細胞の破片を除去します。上清を0.2ミクロンフィルター付きのシリンジにデカントし、上清をフィルターに通して汚染菌を除去します。
次に、細胞毒性試験のために1.5ミリリットルの滅菌上清を確保し、残りのサンプルを摂氏マイナス80度で凍結します。採取した上清の細胞毒性を評価するには、1.5ミリリットルのフィルター滅菌上清を、コンフルエント肺微小血管内皮細胞培養物を含む6ウェルプレートの1ウェルウェルに加えます。プレートをCO2インキュベーターに21〜24時間置きます。
次に、処理された培養物と対照培養物の領域の画像を取得します。画像をカスタム imagej マクロにインポートし、コントラストを 15% 飽和ピクセルに調整します。コントラスト調整された画像を複製し、背景の減算を使用して、無傷のセルと視野内のギャップ領域の両方の高コントラスト画像を取得します。
この高コントラストの画像を元の画像から減算し、画像計算機と関数を使用して、結果の画像を元の画像と組み合わせます。しきい値関数を使用して、結合された画像をマスクに変換し、ギャップを黒で、そのままのセルを白で作成します。また、バイナリ侵食機能を使用して、画像からノイズを除去します。
次に、面積分率を使用して、結果の画像内の黒と白のピクセルの比率を測定します。また、各処理時点の小数部面積を、最大ギャップ面積のパーセントとしてプロットして表します。上清中のアミロイドを定量するには、1ミリリットルの分光光度計キュベットで1ミリリットルのPBSに、新たに調製してろ過した20マイクロリットルの50倍チオフラビンTストック溶液を加え、希釈したサンプルを分光蛍光光度計にロードします。
425ナノメートルの励起を使用してベースライン蛍光発光を測定します。450ナノメートルから575ナノメートルまでの蛍光発光を2ナノメートル刻みでスキャンします。次に、425ナノメートルの励起と482ナノメートルの発光を使用してタイムラプススキャンを実行し、0.2秒ごとに60秒間データを取得するように装置を設定します。
20秒後にスキャンを一時停止し、10マイクロリットルのフィルター滅菌上清をキュベットに注入します。反転して混合した後、キュベットを分光蛍光光度計にリロードし、最後の40秒間の時間ベースのスキャンを再開します。タイムラプスが完了したら、元のスキャン設定を使用して最終的な蛍光発光スペクトルスキャンを実行します。
肺微小血管内皮細胞のコンフルエント層に緑膿菌を添加すると、細胞間にギャップが形成されます。imagejを使用して、治療の最初の12時間に示された上清の細胞毒性を評価すると、まだ健康なコンフルエントセル単層を顕微鏡フィールド内のすべての白い領域として視覚化できます。しかし、PA 103に感染した培養物から採取した上清を添加してから18時間後までに、単層のギャップを検出することができ、細胞を欠く培養皿の領域は、処理の36時間まで直線的に増加し、その時点ではほとんど無傷の細胞が観察できなくなります。
同様の結果は、細胞毒性のマーカーとして乳酸デヒドロゲナーゼ放出を用いて得ることができる。乳酸デヒドロゲナーゼは、細胞傷害性上清の添加後18時間で最初に検出され、36時間で最大の細胞死が測定されるまで線形に増加します。上清は、イムノブロット分析によって、またはアミロイド結合によって誘発される確認変化によるチオフラビンT蛍光強度の変化を測定して、上清中の細胞傷害性アミロイドの存在を決定することによって評価することもできます。
このビデオを見た後、内皮細胞が緑膿菌に感染した後、細胞傷害性上清を生成する方法をよく理解できるはずです。さらに、これらの上清中に存在する細胞毒素の特性評価と分析に必要なアッセイの種類に精通している必要があります。
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概要
本記事では、Pseudomonas aeruginosaによる肺内皮への感染後に、細胞毒性アミロイドが産生されることを実証するための簡便な手法について解説します。この手法は信頼性が高く、有用で再現性のあるデータを取得するための教育的な指導に容易に活用できます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 感染症
- 細胞生物学
背景
- Pseudomonas aeruginosaは、重症感染症を引き起こすことが知られています。
- 肺内皮への影響を理解することは、患者の転帰にとって極めて重要です。
- 院内肺炎は、長期的な健康問題につながる可能性があります。
- 効果的なデータ生成のためには、研究手法が利用可能である必要があります。
研究目的
- Pseudomonas aeruginosaが内皮細胞に及ぼす細胞毒性影響を調査すること。
- 肺炎生存者における長期的な予後不良の背後にあるメカニズムについての知見を提供すること。
- これらの影響をin vitroおよびin vivoで研究するための信頼性の高い手法を開発すること。
使用方法
- HBSSを用いて血管内皮細胞を洗浄する。
- Pseudomonas aeruginosaのコロニーを特定の吸光度まで希釈する。
- 規定の感染多重度で、血管内皮細胞に細菌を播種する。
- 制御された条件下で感染細胞をインキュベートする。
主な結果
- 細胞毒性アミロイド産生の実証。
- 今後の研究に向けた信頼性の高いプロトコルの確立。
- 肺内皮の感染プロセスの解明。
- 患者の転帰を理解するための潜在的な示唆。
結論
- この手法は、Pseudomonas aeruginosa 感染の研究に有効です。
- in vitro および in vivo の両方のモデルに適用可能です。
- さらなる研究により、肺炎に関連する合併症への理解が深まる可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
本手法により、肺内皮感染時に産生される細胞毒性アミロイドの検出が可能となり、急性感染と慢性的な臓器不全との間のメカニズム的な関連性を明らかにすることができます。チオフラビンTの蛍光およびLDH細胞毒性を用いてアミロイドの放出量を定量化することで、抗感染薬および神経保護薬の開発パイプラインにおけるターゲットのデリスキング（リスク低減）に向けた再現性のあるin vitroモデルを提供します。このアプローチは、肺炎の後遺症に関連する細胞毒素介在性病理の早期仮説検証を支援します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： Pseudomonas aeruginosa 感染により、血管内皮機能不全を誘導するアミロイド形成性細胞毒素が誘導されるかどうかを検証する。
- 運用の価値： LDH放出試験およびImageJを用いたギャップ解析により、技術的なばらつきを最小限に抑えつつ細胞毒性効果を定量化する。
- 予測的価値： 感染後のアミロイド形成を抑制する化合物や、血管内皮単層を保護する化合物のスクリーニングを可能にする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備：上清のろ過、細胞毒性イメージング、およびチオフラビンT結合を組み合わせ、直交的なアミロイド検出を行います。
- 定量的な出力：時間経過に伴う分数的ギャップ面積と蛍光キネティクスを測定し、用量反応関係を確立します。
- スケールアップの可能性：本プロトコルは標準的な細胞培養および分光蛍光光度計を使用しており、化合物スクリーニングに向けたマルチウェル形式への適応が可能です。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：肺炎生存者に認められる内皮アミロイド放出をモデル化しており、翻訳バイオマーカーの探索を支援します。
- メカニズムの検証：オリゴマー化したtauおよびAβの産生を確認し、感染と神経変性経路を関連付けます。
- 前臨床における連続性：上清を凍結保存して再利用できるため、試験群全体で一貫した毒性物質への曝露が可能です。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、感染チャレンジ後の抗アミロイド剤または血管内皮保護剤のターゲットエンゲージメントを評価するための初期探索段階に適しています。
- 探索生物学：病原体によって誘導されるアミロイドが内皮バリアの破綻に寄与するという仮説を検証します。
- スクリーニング：化合物有効性プロファイリングのための標準化された毒性物質として、細胞毒性上清を調製します。
- 分析：チオフラビンTを用いたタイムラプスおよびエンドポイントイメージングにより、アミロイド負荷と細胞損傷を定量化します。
- トランスレーショナルリサーチ：in vitroでのアミロイド検出を、肺炎後コホートにおける血漿またはBALFの潜在的なバイオマーカーへと結びつけます。
- 企業での再利用：上清バッチの品質管理（QC）を行い、チーム間での縦断的アッセイ標準化のために保存することが可能です。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 感染によって誘発されるアミロイド形成および内皮細胞損傷のメカニズムに関する洞察を提供します。
- 運用の価値： シンプルで教育的なプロトコルにより、再現性のあるLDHおよび蛍光読み取り値が得られます。
- 戦略的価値： アミロイド放出または内皮細胞のレジリエンスを調節するターゲットに関するゴー/ノーゴー判断に寄与します。
- ポートフォリオへの影響： 感染に伴う長期的な組織損傷を軽減する候補物質の優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- 内皮細胞単層の完全性を維持し、ギャップ形成を評価するために、細胞培養の専門知識が必要です。
- 蛍光顕微鏡、分光蛍光光度計、および画像処理用のImageJマクロを使用します。
- 溶菌によるシグナルとアミロイド放出によるシグナルの誤認を避けるため、MOIとインキュベーション時間の標準化が必要です。
- ヒト細胞または初代組織に適応させる場合、感染条件および細胞毒性閾値の最適化が必要になる場合があります。
- アミロイド形成能を持つ細胞毒素の検出に限定されており、非アミロイド毒素には別の直交的なアッセイが必要です。
