検出細胞毒性アミロイド次感染症の肺による内皮細胞緑膿菌法

この方法は、院内感染肺炎を生き延びた患者がなぜこれほどまでに長期的な転帰が悪いのかなど、呼吸器医療分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の利点は、シンプルで信頼性が高いため、研究室に来た誰でも教えることができ、翌日には有用で再現性のあるデータを生成することができることです。これらの分析方法は、in vitroで培養細胞の感染に関する洞察を得るために適用できますが、動物モデルやヒト患者にも適用できます。

細胞傷害性上清を産生するには、150センチメートルの内皮細胞の皿をHBSSで洗浄し、緑膿菌コロニーを540ナノメートルで0.25の吸光度に希釈します。細菌細胞をさらに希釈して、HBSSの20ミリリットルに20〜1の感染の多様性を可能にし、内皮細胞のプレートに細菌を播種します。次に、感染した細胞を摂氏37度、5%CO2のインキュベーターに4〜5時間置きます。

細菌と内皮細胞のインキュベーションが適切な時間行われることが不可欠です。インキュベーションが短すぎると、アミロイドは上清に放出されません。インキュベーションが長すぎると、細胞は実際に溶解し、すべての内容物を上清に放出します。

適切なインキュベーション期間に使用する指標は、内皮単分子膜にギャップが形成されることです。光学顕微鏡で細胞単層にギャップが観察される場合は、遠心分離のために上清を採取し、細胞の破片を除去します。上清を0.2ミクロンフィルター付きのシリンジにデカントし、上清をフィルターに通して汚染菌を除去します。

次に、細胞毒性試験のために1.5ミリリットルの滅菌上清を確保し、残りのサンプルを摂氏マイナス80度で凍結します。採取した上清の細胞毒性を評価するには、1.5ミリリットルのフィルター滅菌上清を、コンフルエント肺微小血管内皮細胞培養物を含む6ウェルプレートの1ウェルウェルに加えます。プレートをCO2インキュベーターに21〜24時間置きます。

次に、処理された培養物と対照培養物の領域の画像を取得します。画像をカスタム imagej マクロにインポートし、コントラストを 15% 飽和ピクセルに調整します。コントラスト調整された画像を複製し、背景の減算を使用して、無傷のセルと視野内のギャップ領域の両方の高コントラスト画像を取得します。

この高コントラストの画像を元の画像から減算し、画像計算機と関数を使用して、結果の画像を元の画像と組み合わせます。しきい値関数を使用して、結合された画像をマスクに変換し、ギャップを黒で、そのままのセルを白で作成します。また、バイナリ侵食機能を使用して、画像からノイズを除去します。

次に、面積分率を使用して、結果の画像内の黒と白のピクセルの比率を測定します。また、各処理時点の小数部面積を、最大ギャップ面積のパーセントとしてプロットして表します。上清中のアミロイドを定量するには、1ミリリットルの分光光度計キュベットで1ミリリットルのPBSに、新たに調製してろ過した20マイクロリットルの50倍チオフラビンTストック溶液を加え、希釈したサンプルを分光蛍光光度計にロードします。

425ナノメートルの励起を使用してベースライン蛍光発光を測定します。450ナノメートルから575ナノメートルまでの蛍光発光を2ナノメートル刻みでスキャンします。次に、425ナノメートルの励起と482ナノメートルの発光を使用してタイムラプススキャンを実行し、0.2秒ごとに60秒間データを取得するように装置を設定します。

20秒後にスキャンを一時停止し、10マイクロリットルのフィルター滅菌上清をキュベットに注入します。反転して混合した後、キュベットを分光蛍光光度計にリロードし、最後の40秒間の時間ベースのスキャンを再開します。タイムラプスが完了したら、元のスキャン設定を使用して最終的な蛍光発光スペクトルスキャンを実行します。

肺微小血管内皮細胞のコンフルエント層に緑膿菌を添加すると、細胞間にギャップが形成されます。imagejを使用して、治療の最初の12時間に示された上清の細胞毒性を評価すると、まだ健康なコンフルエントセル単層を顕微鏡フィールド内のすべての白い領域として視覚化できます。しかし、PA 103に感染した培養物から採取した上清を添加してから18時間後までに、単層のギャップを検出することができ、細胞を欠く培養皿の領域は、処理の36時間まで直線的に増加し、その時点ではほとんど無傷の細胞が観察できなくなります。

同様の結果は、細胞毒性のマーカーとして乳酸デヒドロゲナーゼ放出を用いて得ることができる。乳酸デヒドロゲナーゼは、細胞傷害性上清の添加後18時間で最初に検出され、36時間で最大の細胞死が測定されるまで線形に増加します。上清は、イムノブロット分析によって、またはアミロイド結合によって誘発される確認変化によるチオフラビンT蛍光強度の変化を測定して、上清中の細胞傷害性アミロイドの存在を決定することによって評価することもできます。

このビデオを見た後、内皮細胞が緑膿菌に感染した後、細胞傷害性上清を生成する方法をよく理解できるはずです。さらに、これらの上清中に存在する細胞毒素の特性評価と分析に必要なアッセイの種類に精通している必要があります。