膠芽腫の異種移植片の生体内イメージング用蛍光分子トモグラフィー

この実験的手順の全体的な目標は、蛍光分子断層撮影法または FMT を使用して前臨床脳腫瘍イメージング モデルを確立することです。この方法は、脳腫瘍生物学、がん研究、および腫瘍の攻撃性、不均一性、および治療反応性に関する創薬の分野における主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、治療前、治療中、または治療後に、腫瘍を非侵襲的、縫合糸不要、定量的な方法でin vivoで監視できることです。

この技術の別の利点は、動物の異なる臓器に移植された他のタイプの異種移植モデルに適用できる可能性です。まず、5ミリリットルの培地に6番目の膠芽腫細胞を10〜10回播種し、10cmの皿に10cmの皿に入れ、細胞培養インキュベーターで24時間インキュベートします。翌朝、細胞にレンチウイルスを形質導入し、5回の感染の多重度で目的の適切な蛍光タンパク質を発現させ、細胞をインキュベーターに戻します。

24時間後、上清を5ミリリットルの新鮮な培地と交換し、さらに48時間培養物をインキュベートします。インキュベーションの最後に、培地を3〜5ミリリットルのトリプソンと37°Cで10〜15分間交換し、その後、慎重にピペッティングして分離した細胞を完全に解離させます。遠心分離により細胞を回収し、ペレットを500マイクロリットルの選別液に再懸濁します。

細胞を適切な数のファックス管に分割し、DAPIで細胞を共染色して死細胞を排除します。次に、チューブをフローサイトメーターにロードし、蛍光コンストラクトの発現に従って生細胞を新鮮なソーティング溶液を含む15ミリリットルの円錐形チューブにソーティングします。遠心分離後、コンストラクト陽性、DAPI陰性細胞を5ミリリットルの培養培地に再懸濁し、新しい10cm皿に播種して、摂氏37度で48〜72時間培養します。

インキュベーションの終了時に、播種用の細胞を複数の皿に分割し、その後のin vivo実験に使用します。注射当日、蛍光陽性グリオーマ細胞を単一細胞懸濁液に解離し、氷上の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに、動物1匹あたり1回の注射あたり2〜5マイクロリットルのPBS濃度あたり10〜6番目の細胞の0.5倍または1倍で再懸濁します。つま先のつま先つまみに対する反応の欠如を確認した後、免疫不全のAthymic Nudeレシピエントマウスの目に軟膏を塗布し、先端が鈍い針を備えた5マイクロリットルのハミルトン注射器に注射用の細胞をロードします。.

シリンジをプローブホルダーに取り付け、マウスを小さな動物性骨隆起性フレームに入れます。イヤーバーと切歯アダプターを使用して頭を固定し、70%エタノールとバタジン溶液で頭を消毒します。小さなメスを使用して、中央に切開を行い、皮膚と結合組織を分離します。

マイクロマニピュレータを使用して、ハミルトンシリンジをブレグマポイントに置き、プローブホルダーをブレグマポイントから前後1ミリメートル、横に2ミリメートル動かします。鉛筆で位置をマークした後、マイクロモーターハンドヘルドドリルを使用して頭蓋骨に慎重に穴を開け、血管が見えるまでわずかに下向きの圧力をかけます。ピアル表面から3mm下のバリ穴に針をインダプスし、1分間に1マイクロリットルの右流で細胞を注入します。

全実験細胞量を注入したら、1分間に1ミリメートルの上昇速度で針を徐々に取り外し、70%エタノールで注入部位を洗浄します。その後、標準的なプロトコルに従って皮膚の傷口を閉じ、動物が完全に回復するまでウォーミングパッドで動物を監視します。注入された細胞を画像化するには、麻酔を受けたレシピエント動物を蛍光分子断層撮影イメージャーのイメージングカセットに入れ、ヘッドアダプターを最初に腹臥位にし、ヘッドをカセットの中央に置きます。

カセットを閉じた状態で、調整ノブを17mmに締めます。動物が固定されたら、カセットを内部ドッキングステーションに挿入し、イメージャーとアナライザーソフトウェアを開きます。実験タブウィンドウで、適切なデータベースと研究グループを選択し、スキャンタブウィンドウを開きます。

[被写体を選択]をクリックして、画像化する被写体を選択し、レーザーチャンネルパネルでレーザーチャンネルを選択します。[キャプチャ]をクリックして画像を取得し、キャプチャした画像内のスキャンフィールドをクリックしてドラッグし、ソースの場所を特定します。「add to reconstruction que」オプションをオンにして、「scan」タブウィンドウで「scan」をクリックします。

スキャンが完了したら、ドッキングステーションからイメージングカセットを取り外し、完全に回復するまで監視しながら動物をケージに戻します。画像を分析するには、イメージャーとアナライザーソフトウェアで分析タブウィンドウを開き、データセット選択パネルのプラス記号ボタンをクリックして、分析用のデータセットと対象をロードします。次に、楕円体アイコンを使用して関心領域を選択し、しきい値列を右クリックして、統計データ パネルでしきい値を 0 に調整します。

近赤外蛍光タンパク質で標識された膠芽腫細胞は、先ほど示したように、注射後5日後まで蛍光分子断層撮影法で区別できる明確な蛍光プロファイルを示します。さらに、コンストラクト間にバックグラウンドシグナルがないため、目的のがん細胞集団のデュアルin vivoイメージングが容易になります。この実験では、死ドメイン関連タンパク質を標的とするSHRNAをコードするレンチウイルスと共形質導入した蛍光コンストラクトを標識した膠芽腫球体を、先ほど示したように、レシピエントの免疫不全Athymic Nudeマウスに注射しました。

逆転写定量的予備反応連鎖反応により、がん細胞株と蛍光分子断層撮影の両方でSHRNAターゲティングの有効性が確認され、SHRNA膠芽腫球を移植したマウスでは、SHコントロール形質導入細胞を移植した動物と比較して蛍光シグナルが減少することが明らかになりました。このビデオを見れば、蛍光分子断層撮影システムを使用して脳腫瘍研究のための前臨床データを生成する方法について十分に理解できるはずです。