磁気活性化細胞を分離し、滑膜液由来間葉系幹細胞が家兎モデルからの浄化戦略を並べ替え

この方法は、滑液から直接間葉系幹細胞を精製する手順を提供することにより、幹細胞分野のソーティングプロトコルにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ウサギ滑液からのMACSの単離と精製のためのシンプルで経済的なプロトコルを確立したことです。一般的に研究では、この方法により、細胞集団のプルー化が単一細胞懸濁液の産生に依存するため、多大な努力を払っています。

この方法を最初に思いついたのは、現在、FDAによって臨床応用が承認されているのは磁気活性化セルソーティング法のみであることに気付いたときでした。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、動物麻酔で開始します。ウサギの膝から関節滑液を採取するには、膝の周りのサイズが約5 x 5センチメートルの領域を選択します。

安全電気シェーバーを使用して、この領域の周りからウサギの毛を剃ります。または、ポビドンヨード溶液と75%エタノールで処置部位を3回消毒します。次に、領域が完全に乾いた後、滅菌ドレープを適用します。

滅菌皮下注射器を使用して、1〜2ミリリットルの等張生理食塩水を外側関節腔から膝関節腔に注入します。.膝を3〜4回動かしてから、室温ですべての滑液を吸引します。滑液を40ミクロンのナイロンセルストレーナーでろ過し、4時間以内に破片を取り除きます。

ウサギSF-MSCを培養するには、ろ過した液体を50ミリリットルの遠心分離管に集め、室温で1,500rpmで10分間遠心分離します。遠心分離後は上清を捨て、ペレットをPBSで洗浄します。ペレットを完全培地で再懸濁した後、培地を100ミリリットルの皿にプレートします。

%の二酸化炭素を含む加湿された雰囲気で摂氏37度で皿をインキュベートします。48時間後、新鮮な培地を皿に補充して、付着していない細胞を取り除きます。媒体を週に2回、2週間、通過ゼロとして交換します。

最初のメッキから14日後、培養皿には多くのコロニーが形成されているはずです。直径2ミリメートルより大きいコロニーを選択します。選択したコロニーがどこにあるかをマークします。これは、皿の底でコロニーの周囲をなぞることによります。

幅が2ミリメートル未満のコロニーは、セルスクレーパーを使用して廃棄します。クローニングシリンダーを使用して、選択したコロニーを約5マイクロリットルの0.25%トリプシンで消化し、コロニーを新しいディッシュに移して通過させます。細胞が約80%のコンフルエントに達したら、培地を吸引します。

次に、各皿に0.25%トリプシンEDTAの1〜2ミリリットルを追加します。細胞の剥離を可能にするために、皿を2〜3分間インキュベートします。細胞が剥離したら、トリプシンを不活性化するために等量の培地を追加します。

細胞懸濁液を40ミクロンの細胞ストレーナーに通し、濾液を15ミリリットルのチューブに集めます。次に、細胞をGの600倍で室温で10分間スピンダウンします。細胞ペレットをMACS Running Bufferに再懸濁します。

磁気標識を行うには、血球計算盤を使用して細胞数を決定します。細胞懸濁液をGの300倍で摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を完全に吸引した後、総細胞数1,000万個あたり80マイクロリットルの再懸濁緩衝液を添加します。

合計1,000万個の細胞について、モノクローナル抗ウサギCD90抗体と結合した20マイクロリットルのマイクロビーズを添加します。チューブ内で磁気ビーズとセルを均等に混合します。次に、暗闇の中で摂氏4度で15分間それらをインキュベートします。

1,000万個の細胞あたり1ミリリットルの緩衝液をチューブに加え、その後、Gの300倍で摂氏4度で10分間遠心分離し、細胞を洗浄します。遠心分離後、上清を捨ててください。ペレットを1,000万細胞あたり500マイクロリットルの緩衝液に再懸濁します。

カラムの翼を前にして、カラムを磁気セパレーターの磁場に配置します。磁気セパレーターカラムを1,000万細胞あたり500マイクロリットルのバッファーですすいでください。シングルセル懸濁液をカラムに移します。

ネガティブセルを磁場に通して、これらのラベルのないセルを廃棄します。1,000万細胞あたり500マイクロリットルのバッファーでカラムを1〜2回洗浄し、流れを捨てます。カラムを15ミリリットルの遠心分離管に移します。

1,000万個の細胞あたり1ミリリットルのバッファーをカラムに加えます。次に、すぐにプランジャーをカラムに押し込み、磁気的に標識された細胞を洗い流します。2つ目の磁気セパレーターカラムで前述の手順を繰り返し、CD90陽性細胞の純度を高め、溶出画分を濃縮します。

細胞懸濁液を300倍Gで10分間遠心分離した後、上清を吸引し、ペレットを培地で再懸濁します。磁気活性化細胞選別後、100ミリリットルの皿に細胞を接種します。5%二酸化炭素を含む加湿細胞インキュベーターで摂氏37度で皿をインキュベートします。

初代培養物の80〜90%のコンフルエンスが達成されたら、約7〜10日で、接着細胞を0.25%トリプシンEDTAで消化し、1〜2希釈で継代して継代を2にします。同じ方法を使用して細胞を継代3に渡し、これはin-vitroアッセイに使用できます。ここには、MACS前後の単層培養ウサギSF-MSCの倒立顕微鏡下での形態を示します。

選別前に、付着したウサギ滑液細胞集団は不均一性を示します。それらには、楕円形、長紡錘体、短紡錘体、星状形態など、さまざまな細胞タイプとサイズが含まれています。通路2と通路6の主な形態は、紡錘体形態です。

MACsとCD90の併用後、細胞集団は均質な形態を示します。亜培養では、細胞数が増加します。フローサイトメトリー解析により、ウサギSF-MSC細胞はMSCマーカーCD44およびCD105に対して陽性であることが示されました。

内皮細胞マーカーCD34、および造血細胞マーカーCD45については陰性である。その結果、MACS以前のウサギSF-MSC集団は、約40%のMSC細胞で構成されていたことが示された。MACS後、濃縮された集団には99%を超えるMSC細胞が含まれていました。

ここに示されているのは、MACソーティング前後のCD90陽性マーカーのフローサイトメトリー解析です。Alizarin Red染色は、3週間の骨形成誘導下で石灰化結節が形成されることを示しました。脂肪形成誘導の3週間後、細胞内Oil Red O染色により、脂質に富む液胞の蓄積が検出されました。

数週間の軟骨誘発の後、細胞ペレットをトルイジンブルー染色で組織学的にアッセイしました。陽性酸性プロテオグリカンは、軟骨細胞様細胞を特徴付けました。導入の3週間後、骨芽細胞マーカー、脂肪形成マーカー、および軟骨形成マーカーの相対的なmRNA発現が検出されました。

一度習得すれば、このテクニックは2〜4時間で完了します。このビデオを見れば、ニュージーランドの白ウサギ滑液からの間葉系幹細胞の簡単な単離と精製についてよく理解できるはずです。この手順を試みるときは、直径が2ミリリットルを超えるコロニーを選択することを忘れないでください。

また、標識細胞に付着した不要な細胞は磁気ビーズ上に残るため、免疫磁気選別の前に単一細胞懸濁液を産生します。この手順に続いて、間葉系幹細胞の精製の安全性と有効性に対処する追加の質問に答えるために、蛍光活性化細胞ソーティングなどの他の方法を実行できます。開発後、この技術は、関節軟骨再生の分野の研究者が関節軟骨修復における理想的なCD細胞を探求する道を開きました。

操作はアーチ冷却ベンチで行われ、この手順を実行するときは手袋などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。滑液由来のMASCは関節軟骨再生の有望な候補であるため、この技術の意味は関節軟骨損傷の治療にまで及びます。