Name: 磁気活性化細胞を分離し、滑膜液由来間葉系幹細胞が家兎モデルからの浄化戦略を並べ替え (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 学ぶ磁気活性化細胞分離法により、家兎滑膜液由来間葉系幹細胞を簡便かつ経済的に浄化する手法です。単一細胞懸濁液の調製とCD90抗体標識による高純度分画取得が可能で、再生医療研究に有用です。

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この研究は次の補助金によって財政上支えられる: 中国の自然科学基礎 (号 81572198;81772394 号)深セン大学 (第 2016031638); の高レベルの医療分野建設のための基金広東省、中国 (号の医学研究の基礎A2016314);深センの科学と技術のプロジェクト (No.JCYJ20170306092215436;違います。JCYJ20170412150609690;違います。JCYJ20170413161800287;違います。SGLH20161209105517753;違います。JCYJ20160301111338144)。

地域倫理委員会ガイドラインに従ってすべての動物実験を行い、動物のすべてのプロシージャは、機関動物ケアおよび使用委員会の深セン第二人民病院、深セン大学によって承認されました。
1. 分離し、rbSF MSCs の文化
<ol><li>
動物のプロシージャのための準備
	<ol>
<li>RbSF のコレクションの骨格成熟女性ニュージーランド白ウサギを準備-MSCs。 1 日麻酔と穿刺のプロシージャ前にウサギの臨床検査を実行します。 注: 身体検査は、心拍数と呼吸数、体温 (女性) の性別 (2.0 〜 2.5 kg) の重量を含める必要があります。臨床的に健康なウサギのパラメーター間隔は 38-39 ° C の体温、心拍数 220-280 分呼吸率 30-50 分。</li>
		<li>麻酔の前に 6 時間動物を高速です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
薬品および動物の麻酔の手順
	<ol>
<li>ケージでウサギを抑制 (材料の表を参照)、し、全身麻酔のための 1 mL/kg の用量で耳静脈に 3% ペントバルビ タール ナトリウムを注入します。</li>
		<li>快適な背臥位でウサギを配置します。</li>
		<li>麻酔中に呼吸数、心拍数、ウサギの体の温度を監視します。</li>
		<li>麻酔中の乾燥を防ぐために、その目に眼科の軟膏を使用します。</li>
		<li>Guedel の分類14の後麻酔の深さを評価します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MSCs の分離と培養のための準備
	<ol>
<li>RbSF MSCs を育成する培地商業の 500 mL を準備 (材料の表を参照) を添加した商業 10% 補足 (材料の表を参照)、10% 牛胎児血清 (FBS)、および 1% ペニシリン-ストレプトマイシン。</li>
		<li>水お風呂で 37 ° C で培養液を孵化させなさい。</li>
		<li>電池隔離および細胞洗浄用リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) の 500 mL を準備します。</li>
		<li>膝窩洞穿刺プロシージャの等張生理食塩水液 100 mL を準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ウサギの膝関節の関節滑膜溝 uid のコレクション
	<ol>
<li>膝の周囲サイズが約 5 × 5 cm の領域を選択し、安全の電気シェーバーを使用してこのエリアからウサギの毛を剃る。</li>
		<li>また、消毒手順サイト 3 ポビドン ヨード ソリューションと 75% エタノールと x。そして、地域は完全に乾燥した後に滅菌ドレープを適用します。</li>
		<li>3-4 x 横関節領域から膝の関節腔に滅菌皮下注射器 (2 mL) を使用して、膝を移動、等張食塩水の 1-2 mL を注入し、室温ですべての滑液を吸います。</li>
		<li>4 時間以内の任意の残骸を削除する 40 μ m ナイロン携帯こし器を通って滑膜の気体をフィルターします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RbSF MSCs の文化
	<ol>
<li>50 mL 遠沈管、室温で 10 分間、1,500 rpm で遠心分離フィルターの気体を収集します。</li>
		<li>遠心分離後に上清を破棄、PBS でペレットを洗浄、完全な培養液中でペレットを再懸濁します、プレート 100 mm 料理中。</li>
		<li>37 ° c 5% CO2を含む加湿雰囲気で料理を孵化させなさい。</li>
		<li>48 時間後に、任意の非付着性細胞を除去する新鮮な培地で料理を補充します。0 (P0) の通路として 2 週間週 2 回、媒体を交換します。 注: 約 1 × 104付着性のセルが必要があります。実行可能なセル/平方フィートの ml は約 2 × 102/mL です。</li>
		<li>初期のめっきの後 14 日後の培養皿で多くの植民地を形成している必要があります。直径 2 mm 以上のコロニーを選択します。マーク選択したコロニーが皿の底に彼らのまわりを追跡することであります。</li>
		<li>< 2 mm 幅、セルのスクレーパーを使用してコロニーを破棄します。0.25% トリプシン、クローニング シリンダーを使用しての約 5 μ L で選択したコロニーを消化し、通路 1 (P1) として植民地を新しい料理に転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
術後の動物の世話
	<ol>
<li>術後監視と麻酔からの回復のための標準的な制度運用手順に従います。</li>
		<li>意識を取り戻したがそれまでウサギの 10 分ごとのバイタル サインを監視します。最終的に、理性的な動物を檻に転送します。それは完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けているウサギは返されません。</li>
		<li>術後、0.1% ポビドン ヨード、3 日間の日 x 2 とサイトを消毒します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CD90 正磁気活性化セルの並べ替え (MAC) rbSF MSCs と初代培養の
<ol><li>
サンプル準備
	<ol>
<li>セルの周りに達する場合 80% の confluency、培地を吸引、0.25% の 1-2 の mL を追加してそれぞれの皿にトリプシン-EDTA。</li>
		<li>細胞の剥離を許可するように 2 〜 3 分の料理を孵化させなさい。</li>
		<li>一度セルを取り外したら、トリプシンを不活化する培地の等しい量を追加します。</li>
		<li>細胞懸濁液を 40 μ m 細胞のストレーナー通過 15 mL チューブに濾液を収集し、後、スピンダウン 600 × g 10 分間室温でのセル。</li>
		<li>バッファーを実行する MAC で細胞ペレットを再懸濁します (PBS、pH 7.2, 0.5% ウシ血清アルブミン、2 ミリメートルの EDTA) のセル数をカウントすると。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
磁気ラベリング 注: は、列、スタンド、および区切り記号 (材料の表を参照) を含むキットを並べ替え磁気活性化細胞と rbSF MSCs を並べ替えます。<ol>
<li>診断を使用して細胞の数を決定します。</li>
		<li>4 ° C で 10 分間 300 × g の細胞懸濁液を遠心分離します。完全に上清を吸引します。</li>
		<li>10 の7の合計セルごと再懸濁バッファーの 80 μ L を追加します。</li>
		<li>10 総細胞、モノクローナル抗家兎 CD90 抗体の共役のマイクロ ビーズの 20 μ L を追加します。</li>
		<li>磁気ビーズと均等に管内細胞をミックスし、暗闇の中で 15 分間の 4 ° C でそれらを孵化させなさい。</li>
		<li>チューブに 1 mL の 10 の7セルごとのバッファーを追加し、セルを洗浄する 4 ° C で 10 分間 300 × g で遠心分離します。遠心分離後、上清を破棄します。</li>
		<li>500 μ L の 10 の7セルごとのバッファーでペレットを再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
磁気分離
	<ol>
<li>磁気分離装置の磁気フィールドに前面に列翼を持つ列を配置します。</li>
		<li>10 の7セルごとのバッファーの 500 μ L と磁気分離装置 (MS) 列をすすいでください。</li>
		<li>列に単一細胞懸濁液を転送します。これらのラベルのない細胞を破棄する磁場を通過する否定的な細胞ができます。</li>
		<li>列バッファーの 500 μ L で 1-2 x 10 の7セルごと洗って流れを破棄します。</li>
		<li>遠心分離機管 (15 mL) に列を転送します。</li>
		<li>列に 1 mL の 10 の7セルごとのバッファーを追加し、磁気標識細胞を洗い流すため列にプランジャーをすぐにプッシュします。</li>
		<li>CD90 の純度を高めるため MS 欄に前述の手順を繰り返して、+細胞は、溶出画分を豊かにすることができます。</li>
		<li>300 × g 10 分で細胞懸濁液を遠心、上清を吸引、培養培地でそれを再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
文化、CD90 の+ rbSF MSCs
	<ol>
<li>磁気活性化細胞選別後 100 mm の料理の細胞を接種します。</li>
		<li>37 ° c 5% CO2加湿セル インキュベーターで料理を孵化させなさい。</li>
		<li>初代培養の 80-90% の合流点を達成すると、約 7-10 日で消化 0.25% トリプシン-EDTA と通路付着性のセル 2 (P2) の通路に 1:2 の希釈でそれら。</li>
		<li>同じメソッドを使用して、細胞を通過通過 3 (P3)の in vitroアッセイに使用ことができます。 注: サブカルチャー、浄化後約 1 × 107 rbSF MSCs が取得されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. rbSF MSCs の同定
<ol><li>
フローサイトメトリーによる rbSF MSCs の表面マーカー確認
	<ol>
<li>MSCs が P3 で 80-90% の合流は、PBS のセルを洗浄し、0.25% の 1 mL とそれらを扱うトリプシン-EDTA。次に、セルを取り外すまで 2 〜 3 分の 37 ° C で MSCs をインキュベートします。</li>
		<li>10 mL の PBS を使用してセルを収穫、円錐管 (15 mL) にそれらを転送、室温で 5 分間 300 × g で遠心分離機のこと。</li>
		<li>培養上清を捨てます。500 μ L の PBS で細胞ペレットを再懸濁し、1.5 mL チューブにそれを転送します。</li>
		<li>FITC 結合し、PE 標識抗体 (アイソタイプ、FITC CD34/PE CD45、FITC CD105 PE CD44) 4 ° C で暗闇の中で 1 時間の 1: 100 希釈を孵化させなさい</li>
		<li>室温で 5 分間 300 × g でこの混合物を遠心し、各時間 5 分 300 × g で遠心分離によって PBS で 2 回細胞を洗浄します。培養上清を捨てます。</li>
		<li>500 μ L の PBS で細胞を再懸濁します、細胞懸濁液を丸底チューブ (5 mL) に転送し、流れの cytometer を使用してそれを分析します。 注: 2 つの蛍光チャンネル cytometer でデータの集録: 533/30 と 585/40。各アイソタイプ蛍光アイソタイプ コントロールを使用して、適切なレーザーの電圧を調整し、ピークの左と右の両方のエッジを表示する蛍光ヒストグラムを取得するために必要な最低の強度を設定します。統計解析 10,000 イベントの最小値を収集します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RbSF MSCs の multidifferentiation 注: 使用 P3 rbSF - multidifferentiationの in vitroアッセイの MSCs。<ol>
<li>
骨分化誘導
		<ol>
<li>骨誘導培地を準備: L-アスコルビン酸-2-リン酸、α-グリセロリン酸の 10 ミリメートルと 100 の 50 mM を含む DMEM basic (1 x) デキサメタゾンの nM。</li>
			<li>6 ウェル培養プレートの 10 の3セル/cm2で細胞を播くし、骨誘導培地でそれらを文化します。</li>
			<li>3 週間ごとに 3 日間誘導培地を変更します。</li>
			<li>分化が完了した後、室温で 30 分間 4% ホルムアルデヒドとセルを修正、セルの汚れ 1 %5 分洗いそれら 3 アリザリン赤と PBS15x。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
脂肪細胞分化
		<ol>
<li>脂肪分化誘導培地を準備: DMEM basic (1 x) インドメタシンの 100 mM、組換えヒトインスリンの 10 mg/mL、デキサメタゾン、1 mM と 0.5 mM 3-イソブチル-1 - メチルキサンチンから成る。</li>
			<li>P3 rbSF MSCs の脂肪分化誘導培地で 3 週間治療します。</li>
			<li>3 週間後オイル赤い O を使用して脂肪細胞の分化を確認する中性脂質液胞を染色します。常温で 30 分 4% ホルムアルデヒド溶液セルを修正し、洗い、そして PBS163 x。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
軟骨細胞分化
		<ol>
<li>軟骨細胞誘導培地を準備: DMEM basic (1 x)、サプリメント、L-プロリン、100 nM デキサメタゾンの, ピルビン酸ナトリウムの L-アスコルビン酸-2-リン酸と 1 mM の 50 mM の 0.35 mM TGFβ1、1% の 10 ng/mL から成る。</li>
			<li>ペレット培養軟骨細胞誘導を使用します。MSCs ではペレットを形成するポリプロピレン チューブ (15 mL) で 10 分間 1500 rpm - 5 × 105 P3 rbSF を遠心します。</li>
			<li>ペレットを培養軟骨細胞誘導培地で 3 週間。</li>
			<li>3 週間ごとに 3 日間媒体を変更します。</li>
			<li>3 週間誘導後パラフィン包埋細胞ペレットを埋め込む、4 mm スライスにセクションおよび 0.1% を使用してそれらを染色トルイジン ブルー17部屋の温度で 30 分間。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
総 RNA の抽出および量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (qRT PCR) による解析
	<ol>
<li>商業の RNA の抽出を使用して 3 週間分化誘導後細胞の総 RNA キット (材料の表を参照) を特定します。<ol>
<li>培養皿で培養液を削除し、分離試薬の 1 つの mL を追加します。</li>
			<li>ソリューションが均質になるまで繰り返しピペッティングにより細胞を溶解させます。それを 3 分間室温でインキュベートします。</li>
			<li>1.5 mL 遠心チューブに細胞ライセートを転送します。</li>
			<li>100 μ L のクロロホルムを加えて手 15 x でそれを振る 3 分間室温で混合物を孵化させなさい。</li>
			<li>4 ° C で 15 分間、12,000 × g でチューブを遠心分離します。培養上清を新しい 1.5 mL 遠心チューブに転送します。</li>
			<li>500 μ L のイソプロパノールを加えて室温で 10 分間の RNA の沈殿物します。</li>
			<li>12,000 × g で遠心する 10 minat 4 ° CRNA ペレットが管の下部に表示されます。</li>
			<li>上澄みを除去し、75% エタノール 500 μ L を追加します。RNA ペレットを洗浄するか、数秒間管を簡単にスピンします。4 ° C で 5 分間 7,500 × g で遠心分離します。</li>
			<li>残留エタノールを削除します。</li>
			<li>10 μ L の DEPC 水に RNA ペレットを溶かし、氷の上にチューブを配置します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>逆 DNA 合成と cDNA に総 RNA の転写キット (材料の表を参照してください)。 注: は、氷の上すべての次の手順を実行します。<ol>
<li>逆のトランスクリプションのマスター ミックスを準備します。</li>
			<li>RNA の 1 μ g と各チューブに DNase 処理 RNA の 25 μ L を追加します。</li>
			<li>PCR サーマルサイクラーを使用して以下の温度で混合物を孵化させなさい: 26 ° C (ランダムな hexamers をアニールする) 10 分で 42 ° C 45 分 (逆転写) と (逆転写酵素を不活性化) に 10 分間、75 ° C。</li>
			<li>すぐに量的なリアルタイム PCR によって生成される cDNA を分析したり、-20 ° C で保存</li>
		</ol>
</li>
		<li>定量的リアルタイム PCR システムと遺伝子発現解析を実行します。<ol>
<li>QRT PCR マスター ミックスを使用 (材料の表を参照) PCR を行う。Ppar γ、Agg、Runx2 GAPDH の PCR のプライマーは、表 1に表示されます。</li>
			<li>2−ΔΔCT法を用いた遺伝子発現を計算します。</li>
			<li>標準的な統計解析ソフトウェアを使用して統計分析を行います。独立したサンプルの t 検定を使用して、グループの平均を比較します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

滑液の MSCs の存在は、細胞ベースの治療のための代替を提供します。以前の研究では、受傷後の期間5と相関する可能性があります彼らの滑液で間葉系幹細胞の多量を含む傷害のサイトを示しています。滑液の MSCs は、負傷18,19後自然治癒を高めるための組織に有益な可能性があります。SF MSCs の臨床応用は主な理由は関節で SF MSCs の機構のまま未定義20ほとんど文献でカバーされています。・ ジョーンズら。21膝関節の hSF MSC 数大幅 7 増加することを報告した変形性関節症 (OA) の初期段階。彼らは増加の SF MSCs が関節の生理的恒常性を維持することに貢献できると思った。
理想的な動物モデルは、再生医療を利用した治療法の開発に欠かせないツールです。ウサギ、ウサギ人間間の明らかな違いは...

MSCs は、特に軟骨病変のための再生医療のための貴重な情報源として提案されています。MSCs では、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞と内臓の間質細胞を含む広くその高膨張率と多系統分化潜在的な1のための幹細胞移植の領域を展開します。MSCs は、骨格筋、滑膜、骨髄、脂肪2,3,4から分離できます。調査結果にも、あるビジョ滑液の MSCs の存在と前の研究が関節再生5,6の有望な候補として滑液由来 Msc (SF MSCs) を発見します。
しかし、研究と人間のサンプルの臨床実験は多くの倫理的な問題の対象となります。代わりに、ウサギはされているし、MSCs の移植が軟骨の損傷を修復することができますを示すために最も一般的に使用される動物種であり続けます。近年、研究者数の増加は、両方生体外でウサギ間葉系幹細胞 (rbMSCs) を研究しているし生体内で、これらの細胞は、細胞生物学、組織生理学におけると同様に人間の MSCs。同様に、rbMSCs は人間の MSCs のように軸線維芽細胞の形態を表示するプラスチックの表面に付着することがあります。さらに、ウサギ間葉系サンプル、シンプルで簡単に7を入手します。さらに、最も重要なポイントは、CD44、CD90, CD105 などの表面マーカーを rbMSCs に表現として MSC 集団の同定の基準に一致してである多系統分化の能力が維持されること細胞療法8,9国際社会によって定義されます。特に、滑膜液 chondroprogenitors、非肥大軟骨分化表現型関節軟骨再生10、11、適切な細胞源のため TGF-β 1 による場合の対応 12。
しかし、SF MSCs の分離は臍帯、脂肪組織、末梢血、骨髄など、他の組織から大きく異なる。現在、浄化および SF MSCs の並べ替えのための最も一般的なアプローチはフローサイトメトリー ・免疫ビーズに基づく並べ替え、フローサイトメトリー法には、特定の環境と非常に高価な楽器13が必要ですが。
この記事は、白ウサギ ニュージーランドから滑液のサンプル集のシンプルで低侵襲の手順を示します。中には、rbSF MSCs 安定拡大培養CD90 正磁気ビーズによるプロシージャで分離されたし。最後に、プロトコルは、高純度と収穫の細胞源から生存率 MSCs を取得する方法を示します。
このプロトコルでは、形態、特定のマーカーと幹細胞の多能性の式に基づいて分離 rbSF MSCs が特徴です。CD45 と CD34 の式が負の値に対し、流れの cytometry ベース診療は CD44 と CD105 の重要な肯定的な表現を明らかにします。最後に、rbSF mscsの in vitroアッセイは、これらの細胞の骨、軟骨、脂肪細胞の分化を示しています。

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MesenGro</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 1703</td><td>37°Cで温まる;使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>MesenGro Supplement</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 M1512</td><td>MSCs培地</td></tr><tr><td>の成分 DMEM基礎</td><td>Gibco Inc.</td><td></td><td>C11995500BT MSCs 分化培地</td></tr><tr><td>等張食塩水</td><td>Litai, China</td><td>5217080305</td><td>虫歯関節穿刺処置試薬</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>HyClone Inc.</td><td>SH30256.01B</td><td>PBS、Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>不使用Gibco Inc.</td><td>10099-141</td><td>MSCsの培養液</td></tr><tr><td>Povidoneヨウ素溶液</td><td>の成分広東省、中国</td><td>150605</td><td>滅菌剤</td></tr><tr><td>75%エタノール</td><td>Lircon、中国</td><td>170917</td><td>滅菌剤</td></tr><tr><td>0.25%トリプシン/ EDTA</td><td>Gibco Inc.</td><td>25200-056</td><td>細胞解離試薬</td></tr><tr><td>1% ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco Inc.</td><td>15140-122</td><td>MSCs 中</td></tr>型 <tr><td>MACS ランニングバッファー</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160112089</td><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、0.5% ウシ血清アルブミン (BSA)、および 2 mMEDTA</td></tr><tr><td>CD90 抗体標識マイクロビーズ</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160801456</td><td>磁気活性化細胞ソーティング用</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>MSC 軟骨形成性成分分化</td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td>MSCの成分 骨分化</td></tr><tr><td>ITS</td><td>BD</td><td></td><td>354352 1%、 MSCの成分 軟骨分化</td></tr><tr><td>L-プロリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5607</td><td>0.35 mM、 MSCの成分 軟骨分化</td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸-2-リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td>50 mM、MSCの軟骨分化成分3</td></tr><tr><td>-イソブチル-1-メチルキサンチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>0.5 mM、脂肪分化成分インド</td></tr><tr><td>メタシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td>100 mM、脂肪分化</td></tr><tr><td>TGF&βの成分;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>10 ng/mL、MSCの軟骨分化の成分</td></tr><tr><td>&α;-グリセロフスフェート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6751</td><td>MSCの骨分化の成分</td></tr><tr><td>CD34ポリクローナル抗体、FITC標識</td><td>Bioss</td><td>bs-0646R-FITC</td><td>造血幹細胞マーカー</td></tr>マウス<tr><td>抗ウサギCD44</td>バイオ<td>ラッド</td><td>MCA806GA</td><td>Thy-1メンブレン糖タンパク質 (MSCs マーカー)</td></tr><tr><td>CD45 (モノクローナル抗体)</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA808GA</td><td>造血幹細胞マーカー</td></tr><tr><td>CD105 抗体</td><td>Genetex</td><td>GTX11415</td><td>MSCs マーカー</td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030</td><td>沈殿物 RNA 抽出 有機相</td></tr><tr><td>トリクロロメタン</td><td>ウェンジ、中国</td><td>61553</td><td>抽出物 トータル RNA</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>単離全RNA</td></tr><tr><td>SYBR グリーンマスターミックス</td><td>宝バイオ</td><td>RR420A</td><td>PCR検査</td></tr><tr><td>cDNA合成キット</td><td>宝バイオ</td><td>RR047A</td><td>相補的DNAへの逆転写</td></tr><tr><td>アリザリン レッド</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>A5533</td><td>カルシウム化合物の染色</td></tr><tr><td>トルイジンブルー</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>89640</td><td>軟骨組織の染色</td></tr><tr><td>オイルレッドO溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1391L</td><td>脂質液胞染色</td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS セパレーター</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-102</td><td>磁気活性化細胞選別用</td></tr><tr><td>MultiStand</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-303</td><td>磁気活性化細胞選別用</td></tr><tr><td>MSカラム</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-201</td><td>磁気活性化セルソーティング用</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>FALCON Inc.</td><td>352340</td><td>40 &MU;m ナイロン</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>ISOLAB Inc.</td><td>075.03.001</td><td>細胞計数</td></tr><tr><td>ファルコン 100 mmディッシュ</td><td>コーニング</td><td>353003</td><td>細胞培養ディッシュ</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>RNA抽出およびPCR</td></tr><tr><td>遠心チューブ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91050</td><td>ガンマ滅菌高速</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>遠心分離細胞</td></tr><tr><td>二酸化炭素細胞インキュベーター</td><td>Thermo scientific</td><td>3111</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>リアルタイムPCR装置</td><td>Life Tech</td><td>QuantStudio</td><td>リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応</td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td>細胞分析装置</td></tr><tr><td>ピペットール</td><td>エッペンドルフ</td><td>O25456F</td><td>液体クロー</td></tr><tr><td>ニングシリンダー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3983-50EA</td><td>個々の細胞コロニーを分離し、選ぶ</td></tr><tr><td>滅菌済み皮下注射器</td><td>Double-Dove, China</td><td>131010</td><td>関節穿刺術</td></tr><tr><td>ウサギケージ</td><td>Zhike, China</td><td>ZC-TGD</td><td>ウサギを拘束する</td></tr></tbody></table>

磁気活性化細胞を分離し、滑膜液由来間葉系幹細胞が家兎モデルからの浄化戦略を並べ替え

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

間葉系幹細胞 (Msc) は、細胞ベースの治療の主要な細胞ソースです。MSCs 関節腔滑液から軟骨組織工学用をされる可能性があります可能性があります。滑液 (SF MSCs) から MSCs は関節の再生のための有望な候補と考えられてきたし、彼らの潜在的な治療効果は重要な研究課題の後半。ニュージーランド白ウサギの膝関節腔から SF MSCs は人間の再生医療を評価するために最適化された並進モデルとして用いることができます。CD90 ベース磁気活性化細胞 (MAC) 技術を並べ替え、このプロトコルこの家兎モデルからウサギが SF MSCs (rbSF-MSCs) 正常取得ならびにさらに完全に区別するためにそれらを誘導することによってこれらの細胞の MSC の表現型を示します骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞。したがって、このアプローチは、細胞生物学の研究と簡単な装置や手順を使用してティッシュ エンジニア リングで適用できます。

分離・精製・ rbSF MSCs の文化: このプロトコルは、rbSF-MSCs MSC 表面マーカー CD90 の式に基づいて分離するのに MAC を使用します。RbSF MSCs の分離・精製とキャラクタリゼーション ・体外培養のプロトコルのプロセス フロー図を図 1に示します。
磁気活性化細胞と CD90 (MAC) を並べ替え後細胞の形態: まずの MAC、CD90 磁気ビーズの MSCs immunolabel。遠心分離の後冷却並べ替えバッファーの 80 μ L の 10 の7セルの最大再懸濁します、続いてボルテックスと 4 ° c 15 分インキュベーション CD90 磁気ビーズの 20 μ L を追加します。その後、並べ替えバッファーの 1 mL の細胞を洗浄し...

この記事では、簡単な分離そしてニュージーランド白ウサギ滑液からの間葉系幹細胞の浄化のためのシンプルで経済的プロトコルを示します。

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

この方法は、滑液から直接間葉系幹細胞を精製する手順を提供することにより、幹細胞分野のソーティングプロトコルにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ウサギ滑液からのMACSの単離と精製のためのシンプルで経済的なプロトコルを確立したことです。一般的に研究では、この方法により、細胞集団のプルー化が単一細胞懸濁液の産生に依存するため、多大な努力を払っています。この方法を最初に思いついたのは、現在、FDAによって臨床応用が承認されているのは磁気活性化セルソーティング法のみであることに気付いたときでした。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、動物麻酔で開始します。ウサギの膝から関節滑液を採取するには、膝の周りのサイズが約5 x 5センチメートルの領域を選択します。安全電気シェーバーを使用して、この領域の周りからウサギの毛を剃ります。または、ポビドンヨード溶液と75%エタノールで処置部位を3回消毒します。次に、領域が完全に乾いた後、滅菌ドレープを適用します。滅菌皮下注射器を使用して、1〜2ミリリットルの等張生理食塩水を外側関節腔から膝関節腔に注入します。.膝を3〜4回動かしてから、室温ですべての滑液を吸引します。滑液を40ミクロンのナイロンセルストレーナーでろ過し、4時間以内に破片を取り除きます。ウサギSF-MSCを培養するには、ろ過した液体を50ミリリットルの遠心分離管に集め、室温で1,500rpmで10分間遠心分離します。遠心分離後は上清を捨て、ペレットをPBSで洗浄します。ペレットを完全培地で再懸濁した後、培地を100ミリリットルの皿にプレートします。5%の二酸化炭素を含む加湿された雰囲気で摂氏37度で皿をインキュベートします。48時間後、新鮮な培地を皿に補充して、付着していない細胞を取り除きます。媒体を週に2回、2週間、通過ゼロとして交換します。最初のメッキから14日後、培養皿には多くのコロニーが形成されているはずです。直径2ミリメートルより大きいコロニーを選択します。選択したコロニーがどこにあるかをマークします。これは、皿の底でコロニーの周囲をなぞることによります。幅が2ミリメートル未満のコロニーは、セルスクレーパーを使用して廃棄します。クローニングシリンダーを使用して、選択したコロニーを約5マイクロリットルの0.25%トリプシンで消化し、コロニーを新しいディッシュに移して通過させます。細胞が約80%のコンフルエントに達したら、培地を吸引します。次に、各皿に0.25%トリプシンEDTAの1〜2ミリリットルを追加します。細胞の剥離を可能にするために、皿を2〜3分間インキュベートします。細胞が剥離したら、トリプシンを不活性化するために等量の培地を追加します。細胞懸濁液を40ミクロンの細胞ストレーナーに通し、濾液を15ミリリット

magnetic-activated-cell-sorting-strategies-to-isolate-purify-synovial

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ラットMSCを、大腿骨と脛骨から分離し、磁気細胞ソーティングで濃縮した。ソートされた細胞はフローサイトメトリーによる表面マーカーの発現について確認した。これらの細胞はまた、単一のコロニーを形成するためにクローン密度で培養した後、これらのコロニーをクローニングシリンダーにより分離した。...

ラット間葉系幹細胞（MSC）とMSCを派生シングルコロニーの分離の分離と濃縮

ウサギの膝関節における骨軟骨欠損の治療のための実験技術が記載されている。骨軟骨欠損に同種間葉系幹細胞の移植は、組織工学の分野で有望な開発を提供しています。フィブリン細胞塊の準備...

フィブリン塊における同種間葉系幹細胞の注入によってウサギの膝関節における骨軟骨欠損の治療

このプロトコルは、酵素消化、密度勾配分離、プラスチック接着およびCD146 +磁気ビーズ選択を使用することにより、ラットから原発性肺常駐間葉系間質細胞を得るための分離技術について説明します。...

CD146の単離<sup&gt; +</supラット肺から&gt;常駐肺間葉系幹細胞

マウスの鼠径部(皮下)および性腺周囲(内臓)脂肪組織デポから間質血管画分(SVF)を分離し、それらの遺伝子発現とコラーゲン分解活性を評価するために必要な技術を紹介します。この方法には、免疫磁気細胞分離を用いたSca1高脂肪由来幹細胞(ASC)の濃縮が含まれます。...

脂肪デポ固有のSca1の免疫磁気分離<sup&gt;高</sup&gt;脂肪由来幹細胞（ASCに）

ミニブタの滑液と骨髄から分離され、注射器吸引を使用して非侵襲的に採取された間葉系幹細胞(MSC)を確立するプロトコルが提示されます。細胞表現型は、細胞単離後のフローサイトメトリーを使用し、MSCに由来する骨髄および滑液のin...

ミニブタの滑液および骨髄由来の間葉系幹細胞の単離および細胞表現型

幹細胞から軟骨形成は、培養条件の微調整が必​​要です。ここで、我々は、細胞を集光するための軟骨形成を開始するために不可欠なステップを磁気アプローチを提示します。また、当社は、バイオリアクター内の動的成熟は、細胞の構造に機械的刺激を適用し、軟骨細胞外マトリックスの産生を増強することを示しています。...

軟骨再生のための3次元磁気幹細胞凝集およびバイオリアクター成熟

ここでは、3Dバイオリアクターを用いて滑液間葉系幹細胞から多数のGMPグレードのエキソソームを作製するためのプロトコールを提示する。...

3次元バイオリアクター培養による滑液間葉系幹細胞由来エクソソームの大規模調製

本研究は、マウス炎症性関節炎組織から滑膜マクロファージおよび線維芽細胞を単離するための修正されたプロトコルを提供する。...

マウス関節炎組織からの初代滑膜マクロファージおよび線維芽細胞の単離と培養

この研究は、血管壁に常在するCD34+ 幹細胞(CD34+...

マウスからの血管壁常在型CD34+ 幹細胞の免疫磁気的単離

顎骨髄由来の間葉系幹細胞は、多様な分化、自己複製、免疫調節に重要な機能を持っています。それらは、遺伝子治療、組織工学、および再生医療における前駆細胞の重要な貯蔵庫として浮上しています。ここでは、ラットの顎骨髄間葉系幹細胞を単離する独自の方法を紹介します。...

ラット顎骨髄間葉系幹細胞の単離および培養技術

本プロトコルは、フィコエリスリン(PE)標識されたフローサイトメトリー抗体と抗PEマイクロビーズを用いて、高価な細胞選別機や標的特有のカスタムビーズを必要とせず、試験条件下で高い後選定標的マーカー陽性率とCCK-8ベースの増殖・代謝活性を維持する特定の間葉幹細胞サブポピュレーションを分離する磁気ビーズベースの選別法を説明しています。...

間接磁気ビーズ戦略を用いたポドプラニン陽性間葉質幹細胞サブポピュレーションの単離と検証

学ぶ磁気活性化細胞分離法により、家兎滑膜液由来間葉系幹細胞を簡便かつ経済的に浄化する手法です。単一細胞懸濁液の調製とCD90抗体標識による高純度分画取得が可能で、再生医療研究に有用です。

磁気活性化細胞を分離し、滑膜液由来間葉系幹細胞が家兎モデルからの浄化戦略を並べ替え

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