Name: エクソソームおよび人間の血液からの分離を最適化するためにタンパク質の消化が、限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学ぶエクソソーム精製法。限外濾過、タンパク質分解、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて血液からエクソソームを分離し、非ベシクル性タンパク質汚染を低減する。疾患バイオマーカー発見やプロテオーム解析の精度向上に貢献する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、内部資金 (KMD) に CSU、ATCC 契約 #2016-0550-0002 (NIAID HHSN272201600013C の下請け)、ビルおよびメリンダ ・ ゲイツ財団 (OPP1039688) から (KMD/NKG) によって支えられました。追加のサポートのコロラド州立大学で大学生 (REU) 夏プログラムの NSF の研究経験に感謝いたします。

この作品は、すべてひと試料 Bioreclamation IVT biorepository から逆特定したサンプルとして得られた、最初の検討からコロラド州立大学制度検討委員会 (IRB)、人体実験をするのには決定されました。IRB 承認プロトコルの下で収集されました。
1. 粗試料 (血漿または血清) をペレット化大きい小胞および細胞残骸の準備
注:安全性に関する考察: 血漿、血清、および他の体液汚染物質、基本的な個人用保護具、手袋、白衣などを着用しながら、特別な注意と扱われなければなりません。バイオ セーフティ キャビネット; における生体試料が処理されることを強くお勧めしますそうでない場合は、目の保護の使用を推奨します。
<ol><li>4 ° C の冷蔵庫で一晩非振動条件下でチューブを配置することによって、血清または血漿サンプルを平衡 (か-20 からまたは-80 ° C での保存)。</li>
	<li>1,000 μ L ピペットを使用して微量遠心チューブにサンプルの分注 250 μ L。</li>
	<li>4 ° C で 30 分間 18,000 × g のサンプルを遠心分離します。</li>
	<li>200 μ L ピペットを使用して、消去した上清 200 μ L を取り外して新しい微量遠心チューブに追加。上清を転送中、ペレット材料を避けてください。ペレット材料を破棄します。</li>
	<li>ビシンコニン酸 (BCA) アッセイ、製造元のプロトコルを使用して、サンプルのタンパク質含有量を定量化します。アッセイを実行、サンプル 1:50 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x を希釈します。複製では、各サンプルをテストします。 注:特に明記しない限りは、プロトコル全体 1x PBS を使用します。平均では、明らかに血清または血漿 (18,000 × g) 後の 200 μ L 総蛋白の 15 mg になります。低い、または高いたんぱく、サンプル以外は、追加の BCA 希釈を必要があります。</li>
	<li>新しい微量遠心チューブにサンプルの分注 10 mg であります。手順 1.5 で得られた濃度を使用して、サンプルの対応するボリュームを計算します。200 μ L ピペットを使用してサンプルの約数。 注:-80 ° C で残りのサンプルを格納するは、勧め割り切れるように複数凍結融解サイクルを将来的にチューブあたり 10 mg で異なるチューブのサンプルを使用します。</li>
</ol>2. 非 exosomal 血液タンパク質の消化
注:消化手順は、共同のエクソソームの浄化ができる非 exosomal タンパク質を減らすために設計されています。エキソソーム表面蛋白質の保存は下流解析の必要がある場合は、この手順は、この分析を妨害する可能性考慮べき。Exosomal CD63、表面に露出した tetraspanin 蛋白質の検出はだったこのプロセスの大幅マイナスは影響されません。
<ol><li>PBS で 500 μ G/ml の濃度でプロテイナーゼ K 溶液を準備します。円錐管にプロティナーゼ K の対応する量を追加します。バッファーと 30 の渦を追加 s、室温で 3 倍。</li>
	<li>プロテイナーゼ K 溶液 50 μ L を分注 10 mg サンプルに追加、軽く 200 μ L ピペットを使用して上下ピペッティングで混ぜます。</li>
	<li>フロート管ラック チューブ 37 ° c 30 分場所の水風呂でサンプルをインキュベートし、潜在的なリークを避けるために風呂の水で管の完全な液浸を避けてください。</li>
	<li>10 分の 60 ° C の水浴に, プロテイナーゼ K を不活化するサンプルとフローティング チューブ ラックを転送します。</li>
</ol>3. 小さい蛋白質およびペプチッド遠心限外濾過法による除去
<ol><li>使用する前に PBS で 100 kDa 分子量カットオフ (MWCO) フィルターを含む限外濾過装置をすすいでください。500 μ L の PBS を 1,000 μ L ピペットを使用して、フィルターに追加することによってこれを行います。溶出液と同様に、任意の残りの未透過 3,700 x g で 5 分破棄のためのデバイスをスピンします。 注:限外ろ過装置のサンプル ボリュームの容量は、0.5 mL-4 mL 50 μ L の最終的な低下したサンプル量が達成可能なことを確認する必要があります。</li>
	<li>ステップ 2.4 からサンプルを取るし、PBS を追加して 500 μ L にボリュームを増やします。中古リンス限外濾過装置にサンプルをピペットします。 注:平均では、2.4 の段階から検体量は 185 μ L (120 に 150 μ L のサンプルとプロテイナーゼ K 溶液 50 μ L) は。</li>
	<li>サンプルが 50 μ L のボリュームを減らすまで 4 ° C で 3,700 x g で固定角度ベンチトップ遠心に限外濾過装置を配置します。 注意:デッド ストップで限外濾過装置を使用する場合ボリューム、ケア遠心分離の手順でフィルター膜の完全な乾燥を避けるために取られる必要があります。</li>
	<li>フィルター膜およびピペット 5 回上下に直接 500 μ L の PBS を追加します。ステップ 3.3 のように遠心分離機します。この洗浄ステップ合計 3 回を実行します。</li>
	<li>新しい微量遠心チューブに最終的な 50 μ L 未透過を転送します。</li>
	<li>200 μ L の PBS、上下に 10 回ピペッティング フィルター膜を洗浄し、ステップ 3.5 から洗浄をチューブに転送します。</li>
	<li>フィルター ホルダーを新しい管の逆の位置に配置します。膜から残りのサンプルを取得するために 2,000 x g で 5 分間逆スピン回復を実行します。プール ステップ 3.5 からサンプルとサンプル。</li>
</ol>4. サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) によるベシクルの浄化
<ol><li>700 kda、1,000 μ L ピペットを使用して空の場合、キャップの重力流列に MWCO を持つビーズ秒スラリーの 850 μ L を追加します。適切なラックが装備ドリップ トレイ サイズに列を配置します。</li>
	<li>列の下部の上限を取り除くし、5 分の液体を流し。排水、一度樹脂を洗浄する PBS の 10 mL を追加します。列から排出する洗浄のための 20 分を許可します。</li>
	<li>集中的に配置、プロテイナーゼ K 15 mL の円錐管にステップ 3.5 からサンプルを扱われ、5 mL の血清ピペットと PBS を追加するサンプル量を増加させます。ミックス チューブ 1 分のロッキングを優しくし、ゆっくりステップ 4.2 血清ピペットで準備の列にサンプルを適用します。 注:列のキャップを取り外したら、サンプル樹脂を介して重力によって流れる、;5 mL のサンプルは、10 分の列を完全に流れます。</li>
	<li>新しい 15 mL の円錐管に流れを収集します。</li>
	<li>血清ピペットを使用して、700 kDa 以下の任意の残りの材料を削除するもう一度ガレージに収集資料を適用します。</li>
	<li>新しい 15 mL の円錐管に流れを収集します。2 回追加 1 mL の PBS 樹脂を洗浄します。4.5; のステップからチューブ内を通しての流れを収集します。最終的な容量は 7 mL ではほぼなります。 注:サンプル手順 4.6 の後元のサンプル ボリュームから約 35 倍を希釈、次の手順は、ボリュームを削減し、精製エキソソーム サンプルを集中します。</li>
</ol>5. 精製エクソソームの総蛋白質定量濃度
<ol><li>3.1 の手順で説明するよう、使用する前に PBS で 3 kDa MWCO フィルターを用いた限外ろ過装置を洗い流してください。</li>
	<li>限外ろ過装置と 4 ° C で 3,700 x g でスイング バケツの回転子の遠心載荷ステップ 4.6 からサンプルに追加しますバッファーは、フィルターを通過して、破棄することができます。集中エクソソームはフィルター上に保持されます。(非透過) フィルター上の体積が 200 μ L になるまでサンプルを遠心します。</li>
	<li>新しい微量遠心チューブに、非透過を転送します。</li>
	<li>ピペッティング膜上 10 回で 200 μ L の PBS のフィルター膜を洗浄し、ステップ 5.3 から洗浄をチューブに転送します。これは残留エキソソーム サンプルのコレクションになります。</li>
	<li>PBS を追加することによって最大 500 μ L のサンプル量をもたらします。上下に 10 回ゆっくりとピペッティングで混ぜます。 注:プロトコルはここで一時停止することができます。サンプルは、4 ° C 夜間、または長期保管のため-20/80 ° C で保存する必要があります。</li>
	<li>BCA アッセイ、製造元のプロトコルを使用して、サンプルのタンパク質含有量を定量化します。サンプル 1:10 と 1:50 PBS で希釈します。複製では、各サンプルを実行します。 注:血清または血漿総蛋白の 10 mg から開始して、ステップ 5.6 から精製エクソソームの総蛋白質収量は、平均 150 μ g。 追加希釈血清または血漿以外のサンプルを使用する場合必要があります。収量は、サンプルの種類によって異なります。</li>
</ol>6. 定量化とナノ粒子追跡 (国税庁) の分析によってエクソソームのサイズの変更
<ol><li>1 mL の PBS と 15 の渦に精製エクソソームの 5 μ g を追加 (5.6 で定量化) と低中速の s。<ol>
<li>1 mL のシリンジにサンプルを配置します。利用可能な場合は、30 μ L/分の割合で希釈エキソソーム サンプルを注入する設定自動シリンジ ポンプで注射器を設定します。</li>
		<li>国税庁測定がビデオ キャプチャ設定: 12-13 の 3-4 とカメラのレベルのゲインを画面します。</li>
		<li>分析 3 技術的複製し 30 の最小値を実行するスクリプトを定義すべて複製の一定の流れを使って s。分析のためには、5 でキャプチャのしきい値を設定します。 注:ビデオ キャプチャの設定、自動注射器の使用についての詳細は参照13あります。NTA のキャプチャと分析の設定は比較可能性を確保するための異なるサンプル間で一貫性のあるである必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 可溶性蛋白の定量
<ol><li>SDS のサンプルバッファーに精製エクソソームの 1-10 μ g を追加し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) 4-12% ビス トリス ゲルを使用してを実行 1 x MES SDS 200 で 35 分のバッファーを実行する V. 転送解決電圧 o を適用することでニトロセルロース 0.2 μ m 膜タンパク質f 50 V 1 1.5 h. アルブミン, アポリポプロテイン A と B、および CD 63 エキソソーム マーカーの存在を評価する西部のしみの分析を実行する標準的な方法論に続きます。 注:7.1 メソッドについてプロトコル参照14; で見つけることができます。具体的には、SP007: ポリアクリルアミドゲルの SP011 を実行している: 西部のしみのプロトコル。</li>
	<li>手順 7.1 のようにページを使用して精製エクソソームの 10 μ g を分離し、蛋白質バンド coomassie 色素を用いたタンパク質変異とサンプル間の削減を視覚化するための次の標準的な推奨事項を染色します。 注:CD63 に固有の西部のしみのプロトコルに関する詳細については、ディアスらによって記述されます。15
</li>
</ol>

<ol><li>Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogenesis+and+functions+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The biogenesis and functions of exosomes.</a> Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Schorey, J. S., Harding, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+and+infectious+diseases%3A+new+complexity+to+an+old+story%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).</li>
<li>Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+platform+for+diagnosis+and+monitoring+of+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).</li>
<li>Nilsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+cancer-derived+urine+exosomes%3A+a+novel+approach+to+biomarkers+for+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer.</a> Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).</li>
<li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 4, 29509(2015).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).</li>
<li>Vergauwen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+of+ultrafiltration+and+protein+analysis+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2704(2017).</li>
<li>Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ready-made+chromatography+columns+for+extracellular+vesicle+isolation+from+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27269(2015).</li>
<li>Sódar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Sci Rep. 6, 24316(2016).</li>
<li>de Menezes-Neto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography+as+a+stand-alone+methodology+identifies+novel+markers+in+mass+spectrometry+analyses+of+plasma-derived+vesicles+from+healthy+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27378(2015).</li>
<li>Corso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+and+scalable+purification+of+extracellular+vesicles+using+combined+bind-elute+and+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11561(2017).</li>
<li>Nanosight Ltd. NanoSight NTA 2.1 Analytical Software, Operating Manual. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://nanobio.physics.ucsb.edu/pdfs/equipment/Nanosight%20NTA2.1%20software%20manual.pdf">http://nanobio.physics.ucsb.edu/pdfs/equipment/Nanosight%20NTA2.1%20software%20manual.pdf</a> (2010).</li>
<li>Dobos, K. Production Manuals & SOPs. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://csu-cvmbs.colostate.edu/academics/mip/research/Pages/dobos-lab-production-manuals-sops.aspx">http://csu-cvmbs.colostate.edu/academics/mip/research/Pages/dobos-lab-production-manuals-sops.aspx</a> (2017).</li>
<li>Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+Membrane-Associated+Proteins+of+Exosomes+Released+from+Human+Macrophages+after+Mycobacterium+tuberculosis+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection.</a> Sci Rep. 6, 37975(2016).</li>
<li>Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-isolation+of+extracellular+vesicles+and+high-density+lipoproteins+using+density+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).</li>
<li>Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically-active+exosomes+from+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically-active exosomes from human plasma.</a> J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).</li>
<li>Böing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Sweeney, P. J., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase+K+%28EC+3.4.21.14%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteinase K (EC 3.4.21.14).</a> Methods Mol Biol. 16, 305-311 (1993).</li>
<li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Exosomes+from+Blood+Plasma%3A+Qualitative+and+Quantitative+Comparison+of+Ultracentrifugation+and+Size+Exclusion+Chromatography+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods.</a> PLoS One. 10 (12), e0145686(2015).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

純度と血液からエクソソームの収量を高めるために最適化されたメソッドがいくつかの疾患のための biomarkers の源として細胞小胞を正確に私に能力を増加します。標準的な方法、エクソソームを具体的には、分離する現在使用されている遠心とエキソソーム集計の可溶性タンパク質7,17、ペレットなどいくつかの欠点を持っている沈殿物メソッド 18。秒の使用がエキソソーム分離、集約からエクソソームを保護し、一般的な汚染物質非 exosomal 蛋白質9,11,18の除去を改善で重要な改善を示しているも,19します。 しかし、アポリポタンパク10、大きい小胞、タンパク...

エクソソームは nanovesicles (30 サイズに至るまで 150 nm nm) 細胞間コミュニケーションを促進する1,2を処理する人間の体のほぼすべてのセルが発表しました。興味深いことに、エクソソームの組成は、起源の細胞だけでなく、個々 の3,4、5の状態に応じて変更します。また、エクソソームから取得できるいくつかの生物学的流体など: 唾液、尿、血2。これらの機能によりエクソソームは病のバイオ マーカーの良い情報源と見なされます。残念ながら、エクソソームの隔離のための標準的な方法はありません。いくつかの研究所では、多段遠心、エキソソーム分離法のゴールド スタンダードとしての密度勾配を使用して 100,000 × g で最後の高速ステップを検討してください。しかし、最近の研究はその遠心水溶性タンパク質とエクソソームとエキソソーム整合性、どちらが下位アプリケーション6,7 を妨げる可能性がありますに影響を与えるだけでなく、他のエクソソームの凝集を誘導する示されています。.エキソソーム分離の他の一般的な方法に限定されない: 商業ポリエチレング リコール (PEG) 沈殿物ベースの試薬、遠心限外濾過法、サイズ排除クロマトグラフィー (SEC)。ポリエチレング リコール (PEG) 高分子を用いた市販の試薬に沈殿し、ペレットを形成させることによりエクソソームを豊か。このポリマーを使用して制限は、残留ペグ ポリマーと最終製品に可溶性の非 exosomal 蛋白質の豊富な汚染です。限外濾過を利用して浄化し、セルロース膜を使用して小胞を集中する遠心分離小さい不純物や他のタンパク質が膜7、8を通過中、エクソソームはフィルター上保持されます。他の方法と同様遠心限外濾過法非 exosomal 蛋白質、タンパク質凝集体などの高レベルの保持のためエクソソームを浄化するために限られた能力があります。最後に、SEC の浄化は、サイズによって分子を分離するのに多孔質樹脂を使用します。SEC は有望な結果を示している汚染タンパク質の大部分をキャプチャして以来、分離のに基づいて重力または低圧システム7、exosomal の整合性を維持する他の方法で直面している問題のほとんどを克服します。 9。ただし、秒の中に大きいタンパク質凝集体とリポタンパク質10の共同分離最終エキソソーム準備の純度に影響します。エキソソーム浄化のみプラズマ9,11やプラズマ7、細胞培養上清からのいくつかのメソッドがテストされている間血を直接比較するメソッドのパフォーマンスに関する情報がないです。プラズマと同じ個人からの血清。
ここでは、様々 な小胞濃縮技術はプラズマと血清の翻訳可能なかどうかを決定するためのワークフローを比較することによって血中エクソソームの浄化に着目します。ナノ粒子追跡分析および西部のしみは、最終製品におけるエキソソーム濃度、純度、およびタンパク質組成の違いを定量化する使用されました。最後のメソッドは、このプロトコルの詳細は小胞の数の増加し、非 exosomal 蛋白質のレベルを減らします。重要なは、一般的な共同沈降蛋白質アルブミンやアポ蛋白などの大幅な削減が示されています。血と、彼ら共同浄化エクソソームと原因矛盾下流解析の傾斜「浄化」のサンプル周波数でこれら 2 つのタンパク質の高い豊富。このプロトコルを含む市販秒樹脂;樹脂多孔質ビーズ 700 kDa より小さい蛋白質がビーズを入力することができますで構成されます。一度中、蛋白質は octylamine リガンドによって保持されます。溶出液はエクソソームと 700 kDa12よりも大きい分子から成る。また、タンパク質凝集体とビーズのトラップを回避するとアポリポタンパクを減らすために、我々 はワークフローのプロテアーゼ消化手順を含めます。現在がない単一の技術共同浄化非 exosomal 蛋白質を削減しながらエキソソーム収量を最大化することができます。本研究を示しますエキソソーム収量および血清および血漿から純度を高めるため複数の回復そして浄化の方法がプロテアーゼ消化前処理を組み合わせた浄化のプロトコルが使えます。

<table><tbody><tr><td>Nanosight</td><td>Malvern</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>卓上型微量遠心分離機&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>Legend Mico21</td><td></td></tr><tr><td>卓上型遠心分離機&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td>アレグラ 6R</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス&nbsp;</td><td>ベンチマーク</td><td>B2000-4</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>BIOTEK</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>THERMO</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Protein Assay Kit</td><td>THERMO</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>15705-066</td><td></td></tr><tr><td>アミコンウルトラ0.5遠心フィルターユニット、ウルトラセル-100メンブレン</td>付き <td>EMD-ミリポア</td><td>UFC510096</td><td></td></tr><tr><td>アミコンウルトラ-4遠心フィルターユニット</td><td>EMD-ミリポア</td><td>UFC800324</td><td></td></tr><tr><td>Capto Core 700</td><td>GE Healthcare</td><td>17548103</td><td></td></tr><tr><td>ポリプレップ&nbsp;クロマトグラフィーカラム</td><td>BIORAD</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>THERMO</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 &micro;m</td><td>バイオラッド</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK,&nbsp;Tritirachium album</td><td>EMD-Millipore</td><td>539480</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>THERMO</td><td>LC6065</td><td></td></tr><tr><td>SIGMAFAST&nbsp;BCIP/NBT</td><td>Millipore-SIGMA</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>4-Chloro-1-naphthol</td><td>Millipore-SIGMA</td><td>C6788</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD63 抗体 (rabbit-anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody</td><td>SYSTEM BIOSCIENCES</td><td>EXOAB-CD63A-1</td><td>Primary and secondary antibodies</td></tr><tr><td>ALB 抗体 (F-10)</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td><td>sc-271605</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>apoB 抗体 (C1.4)</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td><td>sc-13538</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>apoA-I 抗体 (B-10)</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td><td>sc-376818</td><td>一次抗体</td></tr></tbody></table>

エクソソームおよび人間の血液からの分離を最適化するためにタンパク質の消化が、限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

エクソソーム、nanovesicle すべての細胞型からリリースの種類は、任意の体液から分離できます。などのタンパク質と Rna、エクソソームの内容は、そこから派生し、病の指標として使用することができます細胞に固有です。遠心を含む、いくつかの一般的な濃縮プロトコルは、可溶性蛋白質の汚染物を積んだエクソソームを得られます。具体的には、我々 を発見した血液内の最も豊富な蛋白質はしばしば共同エクソソームの浄化し、下流プロテオーム研究を混同することができます低豊富なバイオ マーカー候補の同定を阻止します。更なる懸念エキソソーム タンパク質定量非 exosomal タンパク質レベルの矛盾した表現のための irreproducibility です。エキソソーム精製プロセスに厳しさを追加するエクソソームと共に共同浄化非 exosomal 蛋白質を削除するここで詳細なプロトコルが開発されました。5 つのメソッドは、ペアの血血しょうおよび 5 つのドナーからの血清を使用して比較しました。トラッキング解析とマイクロ ビシンコニン酸蛋白質の試金ナノ粒子を用いた解析では、限外ろ過とサイズ排除クロマトグラフィーを利用した複合的なプロトコルが最適な小胞の濃縮と可溶性タンパク質を除去をもたらしたことを明らかにしました。西部にしみが付くことは、予想される豊富な血蛋白質、アルブミンやアポ蛋白などが枯渇したことを確認する使用されました。

以下に示すデータは、5 つの健康な血液ドナーから対血しょう及び血清サンプルを使用して得られました。各処理ステップの効果を決定する提案するプロトコルの 5 つのバリエーションを行ったとエキソソームの回復と非エキソソーム タンパク質を除去.含まれているメソッドの試験的: 1) 秒 700 kDa + 限外ろ過 3 kDa;2) 限外ろ過 100 kDa;3) プロティナーゼ K + 限外ろ過 100 kDa;4) 秒 700 kDa + 限外ろ過 100 kDa と 5) 限外ろ過 3 kDa 秒 700 kDa + 限外ろ過 100 kDa プロティナーゼ K。
総称して、秒 700 kDa (1、4、および 5) を含むすべてのメソッドはサンプル, 血清と血漿 (図 1 a・B) の両方のタイプの蛋白質の 1 マイクログラムあたり小胞の有意に高い数を作り出した...

ここでは、プラズマと非 exosomal 血蛋白質の減らされた共同浄化と血清の両方からエクソソームを浄化するためのプロトコルを提案する.最適化されたプロトコルには、限外ろ過には、プロテアーゼ処理, サイズ排除クロマトグラフィーが含まれます。小胞とプロテオーム解析のより正確な定量化を含むエクソソーム利点下流解析の強化された浄化。

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

この手順の全体的な目標は、ナノ粒子の追跡やプロテオミクスなどの下流の分析を妨げる可能性のある共精製タンパク質や複合体を減らしながら、血液から小胞を精製することです。この方法は、健康な状態と比較して、疾患状態中の血清または血漿小胞のプロテオミクス変化は何かなどの重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、小胞の列挙の精度が向上することです。豊富な非小胞汚染物質を除去することで、存在量の少ないタンパク質や疾患の潜在的なバイオマーカーの同定を促進します。この方法の意味は、新規の診断バイオマーカーの発見にまで及びます。これにより、血液などの複雑なマトリックス中の細胞外小胞のプロテオミクス組成をより正確に測定することができます。一般的に、小胞精製に不慣れな人は、多くの公開技術があるため、苦労するでしょう。ダウンストリームプロテオミクス解析の再現性は、豊富な血清タンパク質の共精製によって影響を受けます。血清または血漿サンプルを平衡化するには、チューブを振とうしない条件下で摂氏4度の冷蔵庫に一晩置きます。翌日、1, 000マイクロリットルのピペットを使用して、250マイクロリットルのサンプルをマイクロ遠心チューブに分注します。サンプルを18, 000倍Gで摂氏4度で30分間遠心分離します。200マイクロリットルのピペットを使用して、クリアされた上清の200マイクロリットルを取り出し、新しいマイクロ遠心チューブに追加します。上清を移すときは、ペレット状の材料を避けてください。サンプルのタンパク質含有量を、製造元のプロトコルを使用したBCAアッセイにより定量します。アッセイを行うには、サンプルを1つのXリン酸緩衝生理食塩水で1〜50に希釈します。各サンプルを重複してテストします。PBS中に50マイクログラム/ミリリットルの濃度のプロテイナーゼK溶液を調製するには、まず対応する量のプロテイナーゼKを円錐管に加えます。次に、バッファーとボルテックスを室温で3回30秒間加えます。次に、10ミリグラムのサンプルアリコートに50マイクロリットルのプロテイナーゼK溶液を加え、200マイクロリットルのピペットを使用してピペッティングで上下させて穏やかに混合します。サンプルを摂氏37度のウォーターバスで30分間インキュベートし、チューブをフロートチューブラックに入れます。潜在的な漏れを防ぐために、チューブをウォーターバスに完全に浸さないでください。インキュベーション後、サンプルとラックを摂氏60度のウォーターバスに10分間移し、プロテイナーゼKを不活性化します。次に、100キロダルトンの分子量カットオフフィルターを含む限外ろ過装置をPBSで洗い流してから使用してください。1, 000マイクロリットルのピペットを使用して、500マイクロリットルのPBSをフィルターに追加します。装置を G の 3,700 倍で 5 分間回転させた後、残りの残留物と溶出液を廃棄します。PBSを添加して、サンプルの量を500マイクロリットルに増やします。次に、サンプルを事前にすすぎた限外ろ過装置にピペットで移します。固定角度の卓上遠心分離機で限外ろ過装置を3、700倍G、摂氏4度で遠心分離し、サンプルが50マイクロリットルの容量に減少するまで遠心分離します。次に、500マイクロリットルのPBSをフィルターメンブレンに直接加えます。そして、ピペットを5回上下させてから、前と同じように再び遠心分離します。最終的な50マイクロリットルの保持液を新しいマイクロ遠心チューブに移します。フィルターメンブレンを200マイクロリットルのPBSですすぎ、ピペッティングで10回上下します。そして、洗浄液をチューブに移します。次に、フィルターホルダーを新しいチューブの逆の位置に置きます。2, 000倍Gで5分間逆スピン回収を実行し、メンブレンから残りのサンプルを回収します。列をサイズに適したラックに配置します。1, 000マイクロリットルのピペットを使用して、分子量カットオフが700キロダルトンのビーズを含む850マイクロリットルのSECスラリーを追加します。カラムの底のキャップを外し、液体を廃棄物容器に5分間排出します。水気を切ったら、10マイクロリットルのPBSを加えてレジンを洗います。洗浄液がカラムから排出されるまで20分待ちます。濃縮されたプロテイナーゼK処理サンプルを15ミリリットルの円錐管に入れます。また、血清ピペットでPBSを追加することで、サンプル量を5ミリリットルに増やします。チューブを1分間揺らして優しく混ぜます。次に、血清学的ピペットで調製したカラムにサンプルをゆっくりと適用します。新しい15ミリリットルの円錐管にフロースルーを収集します。収集した材料を再び樹脂の上にピペットで移動して、700キロダルトン未満の残りの材料を取り除き、フロースルーを新しい15ミリリットルの円錐管に収集します。レジンは、1回につき1ミリリットルのPBSを加えて2回洗います。フロースルーをチューブに集めます。最終的な総容量は約7ミリリットルです。以前と同様に、3キロダルトンの分子量フィルターで限外ろ過装置をすすぎます。スイングバケットローターでGの3,700倍、摂氏4度で遠心分離します。バッファはフィルタを通過し、破棄できます。濃縮されたエキソソームはフィルターの上に保持されます。フィルターの上の体積が200マイクロリットルに減少するまで、サンプルを遠心分離します。サンプルのタンパク質含有量を、製造元のプロトコルを使用したBCAアッセイにより定量します。1ミリリットルのPBSに5マイクログラムの精製エクソソームを加えます。そして、低速中速で15秒間渦を巻きます。サンプルを1ミリリットルの使い捨てシリンジに入れます。可能な場合は、シリンジを自動シリンジポンプセットにセットして、希釈したエキソソームサンプルを毎分30マイクロリットルの速度で注入します。分析用のスクリプトを定義して、各反復の一定のフローを使用して、3 回のテクニカル反復を最小 30 秒間実行します。分析では、キャプチャしきい値を 5 に設定します。最後に、テキストプロトコールに記載されているように可溶性タンパク質の還元を決定します。精製血清小胞のナノ粒子追跡分析の代表的な結果を示します。小胞のサイズは予想通り約100ナノメートルです。ここに示されているのは、粗血清、SEC前およびSEC後の画分を比較したクマシー染色タンパク質ゲルで、卵白およびその他の非小胞汚染物質の減少を示しています。ウェスタンブロットは、プロテイナーゼKの処理および精製後の特徴的なエキソソームタンパク質であるCD63の保持を示します。プロテイナーゼKステップは、可溶性タンパク質を消化するように設計されています。CD63は膜貫通タンパク質であり、決定された濃度とインキュベーション長ではプロテイナーゼKの影響を受けにくくなります。ここでは、ウェスタンブロットは、血液中に最も豊富に存在するタンパク質であり、精製後に一般的な共精製タンパク質である卵白の枯渇を示しています。一度習得すれば、このテクニックは6時間で完了します。このビデオを見れば、遠心分離機の限外ろ過、プロテアーゼ消化、およびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して体液から小胞を得る方法について十分に理解できるはずです。クロマトグラフィーおよびナノ粒子の追跡に先立って、BCAまたは同等の技術によるタンパク質定量を行うことが重要です。タンパク質濃度がこのプロトコルに記載されている濃度を超えると、結果は異なります。体液の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、手袋、白衣、安全メガネなどの個人用保護具を着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。この手順に続いて、精製された小胞に含まれる正確なタンパク質を決定するために、液体クロマトグラフィー質量分析などの他の方法を実行できます。この方法は、血液小胞の組成に関する洞察を得ることができますが、尿、CSF、細胞培養上清などの他のサンプルタイプにも適用できます。

protein-digestion-ultrafiltration-size-exclusion-chromatography-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

&gt;jove_content&lt;この記事では、全血からエキソソームを分離する方法と、半自動装置を使用したナノ粒子追跡によるさらなる分析方法を紹介しています。提示された技術は、液体懸濁液中の粒子を視覚化および分析するための非常に高感度な方法を提供します。...

エキソソームの定量化とサイズの測定のための革新的方法

胆汁液は、潜在的に重要なバイオマーカーを含む細胞外小胞/エクソソームの貴重な供給源です。このプロトコルは、miRNAプロファイリングを含むさらなる分析のために、ヒトの胆汁からエキソソームを単離するための堅牢な方法を表しています。...

ヒト胆汁からマイクロRNA含有エキソソームの単離とプロファイリング

マイクロRNAは、重要な調節的役割を果たし、様々なヒト疾患のための新規治療標的として浮上しています。 miRNAが、高密度リポタンパク質に運ばれることが示されています。私たちは、急速にヒト血漿からのmiRNA解析に適した精製されたHDLを分離するために簡略化された方法を開発しました。...

高度に精製された高密度リポタンパク質からのmiRNAのハイスループット分離のための高速かつ簡便法

このプロトコルは、高密度リポタンパク質の小さなRNAの単離と定量化を説明しています。...

非コード小型RNA定量化のための高密度リポタンパク質の単離

細菌は、生理活性のある生体分子を運ぶナノメートルサイズの細胞外小胞(EV)を分泌します。EVの研究は、それらの生合成、微生物-微生物および宿主-微生物の相互作用および疾患における役割、ならびにそれらの潜在的な治療用途を理解することに焦点を当てています。EV研究の標準化を促進するために、さまざまな細菌からEVをスケーラブルに分離するためのワークフローが提示されます。...

大腸菌およびその他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離および精製(英語)

ここでのプロトコルは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、細胞外小胞を馴化細胞培養培地から適切に分離できることを示しています。...

馴化細胞培養培地から細胞外小胞を分離するためのサイズ排除クロマトグラフィー(英語)

本プロトコルは、機能化された磁気ビーズを利用して尿中細胞外小胞を効率的に隔離するための詳細な説明を提供します。さらに、ウェスタンブロッティング、プロテオミクス、リン酸化プロテオミクスなどのその後の分析も網羅しています。...

プロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析のための生体液からの細胞外小胞の化学的親和性に基づく単離(英語)

この記事では、ヒト血漿由来の細胞外小胞(EV)の単離、特性評価、定量の方法論について説明し、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)を使用した EV...

心血管バイオマーカー探索のための血漿由来細胞外小胞の単離、特性評価、およびプロテオミクス解析

このプロトコルは、酵素的消化およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、マウスの骨格筋および骨髄から小さな細胞外小胞を分離し、構造的に複雑で収量の少ない組織から小胞富集部分を再現可能にして下流の分子解析を可能にします。...

サイズ排除クロマトグラフィーによるマウス骨格筋および骨髄からの小さな細胞外小胞の単離

ここでは、極低温固体ミリングによって、哺乳動物細胞を破壊し、得られた細胞粉末から細胞抽出物を生成し、そして抗体結合ミクロンスケールの常磁性ビーズ上にアフィニティー捕捉により、目的のタンパク質複合体を単離するためのプロトコルを説明します。...

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

学ぶエクソソーム精製法。限外濾過、タンパク質分解、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて血液からエクソソームを分離し、非ベシクル性タンパク質汚染を低減する。疾患バイオマーカー発見やプロテオーム解析の精度向上に貢献する。

エクソソームおよび人間の血液からの分離を最適化するためにタンパク質の消化が、限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー

さらに動画を探す