Name: フローティング マウス腸凍結切片で腸内房細胞を可視化する抗リン girdin 抗体の使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 学ぶ マウス空腸凍結切片における房細胞の可視化法。pY1798抗体を用いた免疫蛍光染色で、寄生体感染時の細胞動態を解析できます。組織学的経験が少ない研究者も高品質な画像を3日間で取得可能です。

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名古屋大学直也浅井にありがとう浮遊空腸のセクションの低温抗原検索の開発のための有用な示唆を提供します。この作品は、2012 年 (JP25460493) に Scientific Research (KAKENHI) (C) の補助金によって支えられた、(B) 日本社会科学振興 (JSPS) から 2017 年に (JP17H04065)、A ステップから助成金 (AS251Z02522Q) 2014 年と 2015 年 (AS262Z00715Q) に、日本科学技術振興機構 (JST) と武田先見の明の研究 (修士) に武田科学振興財団から助成 2014 年。

ここで説明したすべてのメソッドは、動物愛護と愛知県発達障害研究所利用委員会によって承認された (出願番号: M-03)。
1. 準備
<ol><li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 10 L を準備: 32.27 g ナ2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O 4.5 g の 80.0 g 塩化ナトリウムの室温 (RT) で 10 l. のストア ソリューションの最終巻に純水に追加。</li>
	<li>手順 1.1 から PBS の最終濃度 0.05% (vol:vol) に polyoxyethylene(10) オクチルフェニル エーテルの 100 μ L との PBS t: 200 mL の 200 mL を準備します。室温ストア</li>
	<li>手袋、眼の保護を着て、ショ糖 15% を 10% 中性ホルマリン溶液 50 mL を準備: 7.5 g ショ糖 10% に追加の 50 mL の最終巻に中性ホルマリン (資材表) をバッファリングします。室温ストア 注意: バッファー 10% 中性ホルマリン中のホルムアルデヒドと吸入または皮膚/眼の接触は危険にできます。慎重に処理します。</li>
	<li>200 単位/ml ファロイジン蛍光染料共役ストック溶液 1.5 mL を準備: ファロイジン蛍光染料共役 (1 バイアル、凍結乾燥固体励起と放射の波長で 300 台: 581 nm と 609 nm、それぞれ) の 1.5 mL で中断メタノール。-20 ° C で暗闇の中のストア ソリューション</li>
	<li>準備 5 mg/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole、塩酸 (DAPI) 在庫ソリューション: N, N-ジメチルホルムアミド (DMF) の 2 mL の DAPI の 10 mg です。-20 ° C で暗闇の中のストア ソリューション</li>
	<li>5% ウシ血清アルブミン (BSA) PBS の準備: 10 mL の PBS の BSA の 0.5 g。4 ° C でのストア</li>
	<li>ニッパーを使わず、18 ゲージ ストレート針の斜めのヒントを削除し、針の内腔 (図 1 a1) を通過する液体を許可するように縦方向に nipped、ピンチャーで端をピンチします。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
</ol>2. 動物解剖と空腸の分離
<ol><li>マウスの灌流固定<ol>
<li>手袋を着用し、換気の良い場所で作業します。</li>
		<li>100 mL ガラス製ビーカーを準備、中性ホルマリン、手術用ツール (ハサミ、鉗子)、金属トレイに 10% がバッファリングされる、6-0 ナイロン切り取り縫合、1.7 のように 18 ゲージ ストレート針 22 g 翼針、20 mL の注射器。</li>
		<li>20 mL シリンジ、ガラス ビーカーから読み込むバッファー 10% 中性ホルマリン溶液 20 mL、22 g 翼針をコンセントに取り付けます。</li>
		<li>ゼラチン粉末 1 g を 20 mL の PBS (最後の 5% のゼラチン) 50 mL 遠心管中に追加することによって液体ゼラチンを準備します。15 分間漬常温を振ることがなく 50 ° C で 15 分間湯せんで孵化させなさい。</li>
		<li>簡単に渦とゼラチンが完全に溶けるまで別の 15 分は 50 ° C で孵化させなさい。RT でチューブを使用するまで残します。</li>
		<li>頚部転位によってアダルト マウスを安楽死させます。</li>
		<li>金属トレイをステップ 2.1.6 からマウスを置き、手術器具を用いて剣軟骨を介して皮膚に小切開を行います。</li>
		<li>胸部、腹部領域公開に両手で切開を展開します。</li>
		<li>横隔膜を公開する腹膜を開き、両側横隔膜を開きます。</li>
		<li>両側、前腋窩線に沿って胸郭をカット、中心部を公開する胸腺の位置で横方向の切削による胸壁を削除します。</li>
		<li>血を排出し、左の心室の頂点に 22 g 翼針を挿入する右のアトリウムの耳介の小切開を確認します。10% 中性ホルマリン溶液で組織を灌流してプランジャーを押してください。</li>
		<li>骨盤内の臓器を公開した後、肛門から直腸の端を切断し、腸間膜を切断することによって腸を本体と切り離します。</li>
		<li>空腸を分離するには、胃前庭部の肛門側から 4 cm で腸をカットします。残存小腸の肛門の半分を破棄します。</li>
		<li>洗浄手順を容易にするために半分に空腸をクリップします。負荷 10 %20 mL は、20 mL の注射器に中性ホルマリンをバッファー、コンセントに 1.7 の手順で準備 18 ゲージ ストレート針を取り付けます。</li>
		<li>切り取られた空腸腸の内容物を洗い流すため、腸内腔表面 (図 1 a2) を修正するための一方の端から 10% 中性ホルマリン溶液を注入します。</li>
		<li>2.1.15 の手順で説明するように、PBS を注入することにより腸の内腔を洗浄します。</li>
		<li>2.1.15 液体ゼラチンで PBS を置き換えるための手順の説明に従って、腸内腔に液体ゼラチンをフラッシュします。</li>
		<li>6-0 ナイロンを使用して縫合結紮によって切り取られた空腸のすぐ片方の端縫合糸をカット、液体ゼラチンで腸を埋めるし、縫合結紮 (図 1 a3) の反対側の端の近きます。</li>
		<li>Cryomold (図 1 a4) の落ち込んでいる部分にソーセージの形をした空腸のセクションに合わせて 4 つの縫合ノットを追加します。 注: 20 mm × 25 mm × 5 mm 落ち込んでセクションで cryomolds 〜 20 mm 空腸ソーセージのようなセクションは望ましいです。</li>
		<li>50 ml の 4 ° C で一晩 10% 中性ホルマリン溶液にショ糖 15% の組織を吸収します。 注: 手順は、ショ糖とタンパク質の固定によってゼラチンと組織のホルマリンによってに対する凍害保護作用をください。室温 4 ° C で非固定糊ゼラチンを溶かすに対し、常温では、ホルマリン ゲル化ゼラチンが溶融しません。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ゼラチン充填空腸組織の凍結をスナップします。
<ol><li>縫合ノットで腸を切断することによって両端の結紮とソーセージのような腸 3枚 (図 1 a4) を取得します。凍結組織標本作製化合物の埋め込みを追加するための cryomold のソーセージのような部分を合わせます。</li>
	<li>スナップは凍結液体窒素で冷却イソペンタンで cryomold です。-80 ° c 店 cryomolds 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
</ol>4 浮遊凍結切片を用いた細胞の房の蛍光
<ol><li>セクショニング<ol>
<li>クライオスタット チャンバー内温度 (CT) とオブジェクト温度 (OT) の両方を -22 ° c. に設定します。少なくとも 15 分クリオスタットチャンバー内 cryomold で場所、凍結するティッシュのブロックします。</li>
		<li>35 mm ディッシュに 3 mL の PBS を追加します。</li>
		<li>Cryomold から凍結するティッシュのブロックを外し、ブロックを空腸の横断を公開するかみそりの刃で半分にカットします。1 つをマウントしてかみそりの刃で切断面を断面チャック (クライオスタット アダプター) のブロックの半分。</li>
		<li>30 μ m 厚いセクションにゼラチン充填空腸をセクションします。優しく 4.1.2 (図 2 b、右) 準備した 35 mm ディッシュにセクションを転送するための鉗子を冷凍を使用。</li>
	</ol>
</li>
	<li>一次抗体のアプリケーション<ol>
<li>3 回に 3 ml の PBS T 相互シェーカーで穏やかな揺れで各 5 分 35 mm ディッシュの浮遊セクションを洗浄 (約 36 回/分)。</li>
		<li>抗原検索ソリューションを準備: 2.7 mL 純水に抗原検索ソリューション集中 (材料表) の 0.3 mL。浮遊セクションを含む 35 mm ディッシュに抗原検索ソリューションの 3 mL を追加します。</li>
		<li>ふたを閉じ、皿とビニール テープのストリップと蓋の間のギャップをシール、揺れなし 50 ° c 3 時間ハイブリダイゼーション インキュベーターで孵化させなさい。</li>
		<li>インキュベーターと 20 分間常温の涼しいから皿を削除します。ビニール テープを除去した後、5 分各 3 mL の PBS T と穏やかな揺れのための 3 回のセクションを洗います。</li>
		<li>PBS-T を吸引し、セクションにブロッキング液 (材料表) の 5 滴を追加します。RT で穏やかな揺れで 5 分間インキュベートします。</li>
		<li>一次抗体溶液を調製: リン Y1798 (pY1798) を girdin 抗体 (材料表) の 5 μ L の PBS で 5% BSA 495 μ L。(ブロック ソリューションでは、削除する必要はありません) セクションに一次抗体液 500 μ L を追加します。</li>
		<li>加湿インキュベーション室に皿を置き、穏やかな揺れで 4 ° C で一晩インキュベートします。 注: 一晩インキュベートは最大 3 泊まで拡張できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>二次抗体のアプリケーション<ol>
<li>3 回 5 分間各 3 mL で穏やかな揺れで PBS T のセクションを洗います。</li>
		<li>DAPI の希釈原液を準備: DAPI 原液 (ステップ 1.5) 998 μ L の PBS の 2 μ L。</li>
		<li>二次抗体溶液を作る: 476 μ L の PBS、DAPI 薄めた、ファロイジン蛍光染料共役原液の 12.5 μ、1 μ L ヤギ抗うさぎ IgG 蛍光色素共役の 10.5 μ で 5 %bsa (波長: 励起 496 nm、発光 520 nm)。</li>
		<li>PBS T 後、二次抗体溶液を適用し、穏やかな揺れで 30 分常温遮光インキュベーション室で孵化させなさい。</li>
		<li>5 分各 3 mL の PBS T と穏やかな揺れのための 3 回のセクションを洗います。</li>
		<li>最終的な洗浄後 PBS T を削除し、3 mL の PBS polyoxyethylene(10) オクチルフェニル エーテルを欠けているに置き換えます。実体顕微鏡に皿を転送します。</li>
		<li>白いガラスの MAS コート スライドと転送 1 つ腸セクション P200 ピペット先端部を用いた液滴に皿の中央に液滴の PBS の場所 200 μ。</li>
		<li>実体顕微鏡下のセクションの配置を調整した後に、セクションを囲むすべての残りの PBS を吸い出しなさい。</li>
		<li>水土台メディアの 20 μ L を追加し、メディアの上に 20 × 20 mm coverslip を置きます。</li>
		<li>すぐにキシレン ベース マウント メディアで coverslip エッジをシールします。木製・ マッペにスライドを配置でき、2-3 h の常温固化するキシレン ベース マウント メディア。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。2-3 週間室温光シールドのスライド ボックスにスライドを格納できるメディアをキシレン ベース マウントが固化した後</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 共焦点顕微鏡
<ol><li>共焦点顕微鏡の 63 × 対物にイマージョン オイルを置きます。Coverslip スライドを下げて、ステージにスライドを配置します。</li>
	<li>レーザー波長 405、488、555 nm で取得 TC の画像をデジタル化 (.tiff) tiff 形式で画像を保存します。 注: 蛍光染料の適切な検出フィルター セットを選択 (すなわち、励起/蛍光マキシマ: 358/461 nm、490/525 と 590/617)。</li>
</ol>

<ol><li>Kuga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+of+an+actin-binding+protein+Girdin+specifically+marks+tuft+cells+in+human+and+mouse+gut%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation of an actin-binding protein Girdin specifically marks tuft cells in human and mouse gut.</a> J Histochem Cytochem. 65 (6), 347-366 (2017).</li>
<li>Jarvi, O., Keyrilainen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+cellular+structures+of+the+epithelial+invasions+in+the+glandular+stomach+of+mice+caused+by+intramural+application+of+20-methylcholantren%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pathol+Microbiol+Scand+Suppl%22%5BJournal%5D)">On the cellular structures of the epithelial invasions in the glandular stomach of mice caused by intramural application of 20-methylcholantren.</a> Acta Pathol Microbiol Scand Suppl. 39 (Suppl 111), 72-73 (1956).</li>
<li>Enomoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt%2FPKB+regulates+actin+organization+and+cell+motility+via+Girdin%2FAPE%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Akt/PKB regulates actin organization and cell motility via Girdin/APE.</a> Dev Cell. 9 (3), 389-402 (2005).</li>
<li>Asai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+phenotypes+of+Girdin+germ-line+and+conditional+knockout+mice+indicate+a+crucial+role+for+Girdin+in+the+nestin+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Similar phenotypes of Girdin germ-line and conditional knockout mice indicate a crucial role for Girdin in the nestin lineage.</a> Biochem Biophys Res Commun. 426 (4), 533-538 (2012).</li>
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<li>Lin, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21954290">Tyrosine Phosphorylation of the G alpha-Interacting Protein GIV Promotes Activation of Phosphoinositide 3-Kinase During Cell Migration.</a> Science signaling. 4 (192), ra64(2011).</li>
<li>Omori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Girdin+is+phosphorylated+on+tyrosine+1798+when+associated+with+structures+required+for+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Girdin is phosphorylated on tyrosine 1798 when associated with structures required for migration.</a> Biochem Biophys Res Commun. 458 (4), 934-940 (2015).</li>
<li>Goto, H., Inagaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+site-+and+phosphorylation+state-specific+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production of a site- and phosphorylation state-specific antibody.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2574-2581 (2007).</li>
<li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+phallotoxin%2C+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li>
<li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+sensitive+antigen+retrieval+method+for+free-floating+and+slide-mounted+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections.</a> J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).</li>
<li>Feltkamp-Vroom, T. M., Boode, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+embedding+and+sectioning+technique+for+immunohistochemical+studies+of+minute+specimens+of+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">An embedding and sectioning technique for immunohistochemical studies of minute specimens of tissue.</a> J Clin Pathol. 23 (2), 188-189 (1970).</li>
<li>Ushida, K. <a target="_blank" href="http://www.nibb.ac.jp/pamtbr/?active_action=repository_view_main_item_detail&page_id=15&block_id=15&item_id=1787&item_no=1">Pre-embedding technique with low melting temperature gelatin for preparation of histological sections.</a> Proceeding of the Annual Meeting on Technologies in Biological Research. 36, 66-69 (2014).</li>
<li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft+cells%2C+taste-chemosensory+cells%2C+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li>
<li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).</li>
<li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).</li>
</ol>

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このプロトコルは、組織経験のない房細胞 (Tc) の信頼性の高い画像を取得する研究者を許可するように設計されました。このプロトコルは 3 つの重要な点: 1) サイトとリン酸化状態固有ウサギに対するポリクローナル抗体の人間 girdin リン酸化チロシン 1798 (pY1798 抗体) で特定の企業 (から得られた使用Immuno-Biological 研究所会社 X の =);空腸; 2) ゼラチン充填・ 3) 低温抗原検索。修飾特異抗体の翻訳後修飾 (リン酸化、メチル化、アセチル化など) の特定の種類を認識として広い意味でリン酸化状態特異的抗体を分類できる、特定のアミノ酸残基のタンパク質。大森らX 社は共同でリン酸化ペプチド、ウサギを免疫して後藤の方法9、に続く非リン酸化ペプチドを用いた固相クロマトグラフィーによる生じる抗体を浄化 pY1798 抗体を生成し、10. pY1798 抗体はチロシン 17989点突然変異の有無によるフルレングス人間 girdin の表現のベクトルを用いたリン酸化アッセイの in vitroで集中的に検証されました。その後、久我らは、会社 X から pY1798 抗体が腸内の TCs1の特定および敏感なマーカーであることを発見しました。したがって、会社 X から pY1798 抗体の包含は、このプロトコルでは重要なポイントです。
ゼラチンは、動物組織から抽出したコラーゲンが含まれているし、長い凍結切片13を使用して組織化学的研究組織標本を埋め込むに使用されています。4 ° C でゲル化、室内温度で溶ける低融点ゼラチンは14を埋め込み中に液体状態でゼラチンを維持するために必要な熱の悪影響を避けるために適用し始めた。このプロトコルでは 4 ° C で、抱水力、RT で溶けるゼラチン パウダーから作られた低融点ゼラチンはマウスの腸の横断凍結切片の形態を維持するために使用されました。このゼラチンは、空腸を完全に埋めるに使用されたときのサンプルが、ホルマリン固定不可逆的な糊化を達成するために。熱による抗原検索は、定着剤のアルデヒドを含む12によってマスクされた抗原を公開する効果的な方法です。ただし、パラフィン切片の解析のために一般的に使用される高温 (95-99 ° C で 30 分間) は、複雑な組織/ゼラチンの形態を損傷することが。ここで抗原の検索と組織形態の保全の両方を可能にする低温抗原検索 (3 h の 50 ° C) を使用しました。
pY1798 抗体マウス腸管のみならず複数の臓器 (胃、回腸、結腸、および胆嚢) マウスとヒト1から TCs にラベルを付けることができます。しかし、このプロトコル任意の組織から取りはずされた組織における pY1798 信号が急速に低下する、ため空腸内腔にフォルマリン含まれています (ステップ 2.1.15。、図 1 a2)。
フローティングの凍結切片の厚さに関連する制限があります。薄い凍結切片は、顕微鏡用透光性の面で有利なことができますが、薄さは物理的に脆弱なこれらのセクションを作る。対照的に、厚い凍結切片は物理的に頑丈ながセクションに低い抗体透磁率があります。このプロトコルでは 30 μ m 厚いセクションが使用された両方物理的に安定して抗体を透過しました。PY1798/ビリン/DAPI 三重染色パラフィン セクション久我らが使用するものと同様のプロトコルが失敗した場合、組織の広範な経験のない研究者の工夫したが実行1である可能性があります。パラフィン セクション F アクチン ファロイジン染色に伴う困難を避けるためには、パラフィン切片がここで使用されませんでした。
アミノ酸チロシン 1798 girdin に隣接する保全のため pY1798 抗体はマウス、ラットなど人間以外の種で TCs を染色に適用できます。このプロトコルで使われるゼラチン充填は、他の中空の臓器も適用できます。確かに、pY1798 や TC、離れてゼラチン充填低温抗原検索の組み合わせは悪名高いマウスの腸内で「難しい」エピトープを明らかにするために役立つことがあります、結果として、多くの研究者の関心の可能性があります。
Girdin の生物学的役割と TCs のリン酸化の意義は不明です。しかし、林らによる研究そのチロシンを示唆 girdin のリン酸化は8F アクチン重合の程度に関連付けられています。一方、久我ら発見それ致命的なアポトーシス誘導剤の用量 (e.g、シスプラチン、x 線放射) と関連付けられるかもしれない彼らが仮定されるマウスの小腸で TCs の相対頻度の大きい増加を引き起こした、。絨毛1girdin のリン酸化と同期の tcs、腸から可能な転換は。この可能性は、将来的にさらに調査が必要です。3 つのグループが最近急速な観察は、TC 周波数以下の寄生虫感染15,16,17になります。したがって、この漠然とした染色は人間の腸内の内視鏡的収集の組織を分析するだけでなく使用できるが、TC 蓄積が人間の腸内寄生虫感染症の診断に役立つ可能性がも。

房細胞 (TCs) は、頂房とスプール形の細胞体1によって特徴付けられる消化管上皮細胞のマイナーな散乱コンポーネントです。TCs は 1956年2で最初に説明されたが TC 機能不明で、信頼性の高い TC マーカーの欠如もあって。
榎本らまず girdin3神経系、血管、心臓弁、腱、筋4などの非神経組織に発現するアクチン結合蛋白質を特徴付けられます。Girdin の遺伝的アブレーションを持つマウスは、発育と複数の脳異常4,5,6を表示します。一方、人間 girdin の損失の機能突然変異は進行性脳症、重度障害と早期発症てんかん発作7に関連付けられます。
2011 年は、林らは、動的リン酸化チロシン EGFR と Src8などチロシンキナーゼを介した 1798 で girdin を識別されます。またリン酸 girdin がアクチンの細胞移行8をトリガーする改造のため必要なことを示した。大森らが開発したサイトとリン酸化状態固有人間 girdin 抗体チロシン 1798 (pY1798 抗体) 後藤のプロトコルを次にリン酸化のサイト指示された突然変異誘発を使用して抗体を検証表現のベクトル運ぶフルレングス girdin9,10。2017 年、久我らその pY1798 は、高い特異性と感度の高い1TCs をラベルを報告しました。PY1798 抗体はまだ特性内腔側の先端に「房' を含むセル全体形状 girdin の生物学的役割が明らかに優れたの染色特性に基づく以前の TC マーカー優れたと TC のリン girdin をあることを示した機能は明白でない1を残った。
本研究で説明した方法で蛍光染色、一次抗体標的タンパク質に対してとプライマリに対して蛍光標識二次抗体を使用して組織の特定の蛋白質をマークする組織学的手法は、します。抗体。このメソッドの目的は、組織の限られた経験と高品質の TC の画像を取得する研究者を許可することです。このプロトコルは、フローティングの凍結切片スライド マウントの凍結切片の必要性を避けるため、またはパラフィン セクションを使用します。ただし、浮遊セクションがスライド ガラスからのサポートの欠如のため壊れやすい、切片厚が抗体の透磁率を減らすことができます。このプロトコルには、これらの問題を克服する 2 つのアプローチが含まれています: 1) 浮遊セクション汚損プロシージャ全体の形態を維持するためにゼラチンで全体腸内腔に充満および 2) に低温の抗原検索の使用pY1798 信号を強化します。

<table><tbody><tr><td>Slc:DDY 6週齢雌マウス</td><td>中部化学 四号</td><td>該当</td><td></td>なし</tr><tr><td>リン酸水素二ナトリウム 12-水 (Na2HPO412H2O)</td><td>和光</td><td>196-02835</td><td></td></tr><tr><td>ジヒドロリン酸ナトリウム 二水和物 (NaH2PO42H2O</td><td>和光</td><td>199-02825</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>和光</td><td>199-10665</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100,&nbsp;ポリオキシエチレン(10) オクチルフェニルエーテル</td><td>片山化学</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>和光</td><td>190-00013</td><td></td></tr><tr><td>10%緩衝中性ホルマリン溶液</td><td>武藤化学</td><td>20215</td><td>ステップ1.3.</td></tr><tr><td>ファロイジン蛍光色素コンジュゲート、アレクサフルオア 594 ファロイジン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>ナカライ テスク</td><td>21915-35</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-ジアミディノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>N.N-ジメチルホルムアミド (DMF)</td><td>ナカライテスク</td><td>13015-75</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Σ</td><td>A9647-10G</td><td></td></tr><tr><td>18ゲージ ステンレス製ストレートニードル</td><td>テルモ</td><td>NN-1838R</td><td></td></tr><tr><td>U.S.P. 6-0 60cm ナイロンカット縫合糸 クラウンジュン</td><td>河野製作所</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>22ゲージ ウィングドニードル</td><td>テルモ</td><td>SV-22DLK</td><td></td></tr><tr><td>20mL テルモ シリンジ</td><td>テルモ</td><td>SS-20ES</td><td></td></tr><tr><td>50mL 遠心チューブ</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL いわき遠心管</td><td>いわき</td><td>2325-015</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL マイクロ試験管</td><td>スター</td><td>RSV-MTT1.5</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン粉末 Gelare-blanc</td><td>新田バイオラボ</td><td>2809</td><td></td></tr><tr><td>凍結組織検体用包埋化合物 O.C.T. コンパウンド 118 mL 12 個</td><td>サクラファインテック</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 piece, well size 20 x 25 x 5 (mm)</td><td>Shoei Work's</td><td>1101-3</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26404-75</td><td></td></tr><tr><td>Falcon cell culture dish 35 x 10mm Easy-Grip</td><td>Corning 353001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗原賦活化液濃縮液、Target Retrieval Solution pH 9 10x</td><td>Dako</td><td>S2367</td><td>Antigen retrieval solution concentrate in step 4.2.2.</td></tr><tr><td>Protein Block</td><td>Dako</td><td>X0909</td><td>4.2.5のブロッキング溶液。</td></tr><tr><td>Phospho-Y1798 girdin (pY1798) antibodies</td><td>Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X</td><td>28143</td><td>Phospho-Y1798 girdin antibodies in step 4.2.6.</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG(H+L) 高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Aquous封入剤、Prolong Gold 退色防止封入剤</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ、松波マイクロカバーガラス 22×22 mm 100個 厚さNo.1</td><td>松波ガラス</td><td>C022221</td><td></td></tr><tr><td>Entellan キシレン系新品封入剤顕微鏡</td><td>メルク ミリポア</td><td>107961</td><td></td></tr><tr><td>MASコーティングスライドガラス 白</td><td>松波ガラス</td><td>MI-MAS-01</td><td></td></tr><tr><td>木 マッペ KO型</td><td>松栄ワークス</td><td>99-40007</td><td></td></tr><tr><td>浸漬油 518 F 蛍光フリー 20ml</td><td>ツァイス</td><td>444960</td><td></td></tr><tr><td>ピペット、ピペットマン P (P2、P20、P200、P1000)</td><td>ギルソン</td><td>F144801、F123600、F123601、F123602</td><td></td></tr><tr><td>超純水製造装置</td><td>アドバンテック</td><td>GS-590</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック手袋、スターニトリル手袋</td><td>スター</td><td>RSU-NGVM</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>ディープフリーザー、三洋超低</td><td></td><td>MDF-382</td><td></td></tr><tr><td>ショーケース冷凍機</td><td>日本冷凍機</td><td>NC-ME50EC</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス、サーモミンダー SDminiN(ゼラチンを50°Cで溶解する)</td><td>タイテック</td><td>0068750-000</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションインキュベーター(50°Cでの抗原賦活化用)</td><td>タイテック</td><td>HB-100</td><td></td></tr><tr><td>免疫染色用インキュベーションチャンバー</td><td>コスモバイオ</td><td>10DO</td><td></td></tr><tr><td>免疫組織化学用レシプロシェーカー(室温用)</td><td>タイテック</td><td>NR-1</td><td></td></tr><tr><td>免疫組織化学用レシプロシェーカー(4C用)</td><td>東京理化機械</td><td>MMS-3010</td><td></td></tr><tr><td>立体顕微鏡(組織ハンドリング用)</td><td>オリンパス</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>立体顕微鏡(図1B用)</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡(図3用)</td><td>ニコン</td><td>E800</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>LSM700</td><td></td></tr></tbody></table>

フローティング マウス腸凍結切片で腸内房細胞を可視化する抗リン girdin 抗体の使用

Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections

アクチンの様々 な組織の細胞移行をトリガーするための改造に必要なゾル性細胞質蛋白質であるアクチン結合タンパク質 girdin。Girdin は受容体とチロシン 1798 で非受容体チロシンのキナーゼによってリン酸化します。大森ら開発サイトとリン酸化状態特異的抗体チロシン 1798 (pY1798) で人間 girdin に対して特に結合リン酸化チロシンを 1798 年が非リン酸化チロシン-1798。pY1798 抗体は、特に哺乳類の消化管組織に存在する房細胞 (TCs) をラベルに使用されているが、これらの細胞の機能は不明。このプロトコルは、pY1798 抗体、蛍光抗体法を用いた空腸における TCs の堅牢な可視化できます。成功し、単純な TC の可視化を確保するため、このプロトコルは、2 つの組織学的技術を含まれている: ゼラチン充填空腸組織充填した空腸 3 h の 50 ° c の低温抗原検索から浮遊凍結切片の生産ゼラチン浮遊セクション汚損プロシージャ全体の形状を維持は、TCs pY1798 TCs に絨毛先端から分散の染色にこのプロトコルの使用の成功結果から低温抗原検索により、堅牢な信号に対しクリプト。ステンド グラスの TCs スプール形相馬、突出 '房' に対応する内腔側のチップに凝縮する蛍光信号ファロイジン染色 pY1798 陽性 TCs は肥厚したブラシの境界線と, し、TC 房から延びる細根質量に対応します。消化器内視鏡で集められた人間の生検サンプルの TCs を調べるこのプロトコルを使用することができます。また、TCs では寄生虫感染マウスで蓄積する報告された最近、このプロトコルが人間の腸内寄生虫感染症の診断のためのアプリケーションを持っていることを示唆しています。

空腸のゼラチン充填
ゼラチン充填 (図 1 b) の利点は、ゼラチン充填マウス腸の典型的な手順 (図 1 a) を示します。簡単に言えば、18 ゲージ ストレート針の斜めのヒントは、ピアスの腸の壁 (図 1 a1) に対して保護するために削除されました。ゼラチン充填を使用して達成された 10% は液体ゼラチン( で充填する前に切り取られた空腸のセクション腸をフラッシュして腸の内腔の表面 (図 1 a2) を修正するための一方の端から挿入中性ホルマリンをバッファリング図 1 a3)。結果のソーセージのような部分 (図 1 a4) が埋め込まれた、冷凍、そして横で区分クライオスタットで 30 μ m の厚さにスライス。ゼラチンの記入がない場合は、空腸のセクションはキンク、後方スイングする絨毛を許可する (図 1 b、左) に傾向があります。ゼラチン充填はセクションの円形のディスクを保持し、(図 1 b、右) 絨毛の直立位置を維持します。画像は、浮遊空腸のセクションの形態を維持する充填ゼラチンによってもたらされるメリットを明確に示します。
腸内房細胞の成功イメージング
pY1798 抗体は、ドットのしみが付くこと、西部にしみが付くこと、パラフィン セクション染色、染色、雪解けに取り付けられた cryosection またはフローティング cryosection1,9を染色を含む変数免疫染色技術を適用できます。このプロトコルでフローティング凍結切片での蛍光染色の tc pY1798 抗体、ファロイジン、TCs1の構造特性を発揮する染色 DAPI を使用してマウスの腸に着目。一般に、TCs 絨毛先端から地下室1約 1 TC/100 上皮細胞の割合で点在しています。代表的な結果表示、pY1798 が再現性をもってスプール形相馬と堅牢な信号結露が TC1 の ' 房' から突出に対応、強く染色内腔側先端の細胞質膜を含む全体の TCs を delineates (図 2 a-2 b)。一方、ファロイジン ファロトキシン、タマゴテングタケ、キノコから有毒な二環式 heptapeptides の家族あり、アクチン フィラメント (アクチン)、親和性の高い腸刷子縁を形成する絨毛の存在であります。11. ファロイジン 1 x 108 と目立つようにマーク、肥厚した刷子縁房1から伸びる根の質量に対応します。したがって、pY1798 信号 (スプール形相馬、内腔側先端に信号凝縮) 目立つように厚くファロイジン正刷子縁との一貫性のある共局在を示しますこのプロトコルが正常に関係なく、TCs を識別彼らが絨毛で(2 a を図)または(図 2 b)地下室にあるかどうか。
低温抗原検索は浮遊セクションを汚すための効果的です
95-99 ° C で熱による抗原検索はパラフィン切片、凍結切片スライド マウントの分析に広く使用されます。しかし、このようなセクションがスライド12でサポートされているスライド マウントのセクションよりもより一般的に壊れやすいために、ダメージを与えず浮遊セクションにこのアプローチを適用することは難しい。低温抗原検索 (3 h の 50 ° C) から水のお風呂を使用して影響を及ぼさない形態ブラインドの抗原検索の客観的効果を行った予備実験で浮遊空腸のセクションのテストと統計学的に低温の抗原検索(図 3)の有効性を確認しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig1.jpg"> 凍結切片の形態学的保全のため空腸部図 1: ゼラチン充填 ゼラチンでマウス腸腔内充填の手順の写真を(A) 。(A1)18 ゲージ ストレート針の斜めのヒントは、腸壁の穿孔を避けるために削除されました。(A2)中性緩衝ホルマリン溶液 (10%) は、腸の内容物をフラッシュおよび腸の内腔表面を修正するクリップされた空腸の一方の端に注入しました。(A3)切り取られた空腸は液体ゼラチンと 6-0 ナイロン縫合糸(黒矢印)を使用して結紮両端でいっぱい。(A4)4 つの縫合ノット(白い矢印)既存の縫合糸の結び目(黒矢印)の間に配置をもたらした 3 つの短い小品。組織は、2 つの示された位置(白い矢印)でソーセージのような 3枚に分けるでしょう。(B)ゼラチン充填のフローティング cryosection 形態に有益な効果。ゼラチン充填なしセクションがちキンク、下位(左); 簡単にスイングする絨毛を許可します。ゼラチン充填、30 μ m 厚いセクション ディスク形状の維持し、腸絨毛の直立位置は保存状態(右)。画像は、ノマルスキー微分干渉コントラストを使用して撮影されました。スケール バー、1 mm.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/57475/57475fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig2.jpg"> 図 2: マウス腸内の代表的な蛍光画像房細胞 TCs 絨毛(A)や地下室の共焦点の蛍光画像(B)、フローティング マウス腸のセクションで部位特異的に染色し、1798 (チロシンのリン酸化 girdin に対するリン酸化状態特異的抗体pY1798、緑、最適な励起/蛍光波長 490/525 nm)、ファロイジン (赤、590/617 nm), 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI、青、358/461 nm)。低倍率の画像 (50 μ m スケール バー) に白いボックスによって囲まれた領域 (尺度バー、10 μ m) 右上で展開されました。pY1798 抗体再現性をもって染色内腔側先端 (矢印)、膜、およびスプール形 TC 相馬の細胞質に存在 ( (A), 絨毛またはクリプト(B)) の場所に関係なく、TCs を染色します。ファロイジン染色 (矢印) で目立つように肥厚したブラシの境界線は TCs の別の独特の記号<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/57475/57475fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig3.jpg"> 図 3: 低温抗原検索を強化 pY1798 蛍光抗体法 実験プロシージャの 2 つのグループは、低温抗原検索の有効性を確認するために比較しました。浮遊空腸のセクション (30 μ m 厚い、n = 13) から単一の冷凍ブロックは 2 つのグループに分け、各グループからのセクションは、完全なプロトコルに従う染色されたや同じプロトコルが欠けている低温の抗原検索 (ステップ 4.2.2)。染色後のセクションは、グループ番号が付いた個々 のスライドに搭載されていた、マスキング テープで覆われていた各スライドにラベルします。すべてのスライドがシャッフル、テープ上の新しい番号でラベル付け、FITC フィルターを蛍光顕微鏡下で観察されました。表示の pY1798 肯定的な TCs の合計数の平均と各グループの棒グラフ (平均 ± 標準偏差) で表示されていた。2 つのグループの間の平均のカウントを比較する両側 t 検定を行った。0.05 以下の P 値が統計的に有意と考えられました。低温抗原検索は、pY1798 蛍光抗体法の有効性を大幅改善。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/57475/57475fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

久我らはリン酸化状態アクチン結合タンパク質 girdin チロシン 1798 (pY1798) のリン酸化などに対する特異抗体できる房細胞 (TCs) をラベルに使用することを発見しました。このプロトコルは、pY1798 抗体を用いた浮遊空腸凍結切片の免疫蛍光染色を使用して Tc の堅牢な可視化できます。

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is ...

この染色手順の全体的な目標は、マウス空腸凍結切片の房細胞を視覚化することです。この方法は、寄生虫感染中に哺乳類の腸内で房細胞の増殖がどのように起こるかなど、消化器病学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、組織学的経験が限られている研究者が高品質の房細胞画像を取得できることです。ホルマリン固定されたばかりのマウスの死体の骨盤内臓器を露出させることから始めます。直腸の端を肛門から切り取り、腸間膜を切って腸を体から分離します。空腸を分離するには、胃前庭の肛門側から腸を4センチ切り取り、残りの小腸の肛門半分を捨てます。空腸を半分にクリップして、フラッシング手順を容易にします。20ミリリットルの10%緩衝中性ホルマリン溶液を20ミリリットルの注射器に装填し、ベベルを外した状態で18ゲージのストレートニードルを取り付けます。次に、クリップされた空腸の一方の端から10%緩衝中性ホルマリン溶液を注入して腸の内容物を洗い流し、腸内腔の表面を固定します。PBSを注入して腸内腔を洗浄します。次に、液体ゼラチン溶液でフラッシュしてPBSを置き換えます。クリップされた空腸の一方の端を縫合糸結紮によって閉じ、6-0ナイロンカット縫合糸を使用します。空腸を液体ゼラチンで満たし、縫合結紮によって反対側の端を閉じます。次に、空腸の長さにわたって4つの縫合糸の結び目を作ります。組織を50ミリリットルの15%スクロースに10%緩衝中性ホルマリン溶液に浸し、摂氏4度で一晩浸します。翌日、縫合糸の結び目で空腸を切断して、両端が結紮されたソーセージのような空腸片を3つ取得します。クライオモールドでピースを整列させ、埋め込みコンパウンドで覆います。液体窒素で冷却したイソペンタンでクライオモールドをスナップ凍結します。空腸の切片を準備するには、まずクライオスタットのチャンバー温度と物体温度の両方を摂氏マイナス22度に設定します。凍結した組織ブロックをクライオスタットチャンバーのクライオモールドに少なくとも15分間置きます。15分後、かみそりの刃でブロックを半分に切り、空腸の横断面を露出させます。ブロックの半分をクライオスタットアダプターに取り付けます。ゼラチンを充填した空腸を30ミクロンの厚さの切片に切片にします。冷凍鉗子を使用して、切片を3ミリリットルのPBSを含む35ミリメートルの培養皿に穏やかに移します。切片を3ミリリットルのPBS-Tで各5分間3回洗浄した後、フリーフローティング切片を含む皿に新たに調製した抗原賦活化溶液3ミリリットルを加えます。次に、蓋を閉め、皿と蓋の間の隙間をビニールテープで密封し、ハイブリダイゼーションインキュベーターで摂氏50度で振とうせずに3時間インキュベートします。免疫染色後、PBSで染色切片の皿を実体顕微鏡に移します。MASコード化された白いスライドガラスの中央にある液滴に200マイクロリットルのPBSを置きます。次に、P200ピペットチップを使用して、皿から1つの空腸切片を液滴に移します。セクションの位置合わせを調整した後、セクションの周囲に残っているすべてのPBSを吸引します。20マイクロリットルの水性封入剤を追加し、メディアの上にカバースリップを置きます。カバーのスリップエッジをキシレンベースの封入剤ですぐに密封し、2〜3時間乾燥させてから共焦点顕微鏡観察を始めてください。空腸のゼラチン充填は、丸い円盤の形状を維持し、絨毛の直立位置を維持します。ゼラチン充填物がないと、空腸切片がねじれやすくなり、絨毛が後方に揺れるようになります。pY1798は、膜、スプール形状の体細胞の細胞血漿、および強く染色された管腔先端を含む房細胞全体を再現性よく描写します。これらの場所では、強力なシグナル凝縮が房細胞の突き出た房に対応します。ファロイジンは、腸ブラシの境界を形成する微絨毛に存在する糸状アクチンに対して高い親和性を持っています。ファロイジンは、房から伸びる細根の塊に対応する太いブラシの境界を再現性よく目立つようにマークします。pY1798シグナルと目立つ厚みのあるファロイジン陽性ブラシの境界との一貫した共局在は、このプロトコルが房細胞が絨毛上または陰窩内に存在するかどうかに関係なく、房細胞を首尾よく同定することを示しています。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば3日で行うことができます。低発光点ゼラチン、フリーフローティングクライオ切片、低温抗原賦活化の組み合わせは、他のプロジェクト組織の免疫染色にも適用できます。

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Research

JoVE Journal

Biology

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フローティングマウス腸凍結切片で腸内房細胞を可視化する抗リン girdin 抗体の使用

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