フローティング マウス腸凍結切片で腸内房細胞を可視化する抗リン girdin 抗体の使用

この染色手順の全体的な目標は、マウス空腸凍結切片の房細胞を視覚化することです。この方法は、寄生虫感染中に哺乳類の腸内で房細胞の増殖がどのように起こるかなど、消化器病学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、組織学的経験が限られている研究者が高品質の房細胞画像を取得できることです。

ホルマリン固定されたばかりのマウスの死体の骨盤内臓器を露出させることから始めます。直腸の端を肛門から切り取り、腸間膜を切って腸を体から分離します。空腸を分離するには、胃前庭の肛門側から腸を4センチ切り取り、残りの小腸の肛門半分を捨てます。

空腸を半分にクリップして、フラッシング手順を容易にします。20ミリリットルの10%緩衝中性ホルマリン溶液を20ミリリットルの注射器に装填し、ベベルを外した状態で18ゲージのストレートニードルを取り付けます。次に、クリップされた空腸の一方の端から10%緩衝中性ホルマリン溶液を注入して腸の内容物を洗い流し、腸内腔の表面を固定します。

PBSを注入して腸内腔を洗浄します。次に、液体ゼラチン溶液でフラッシュしてPBSを置き換えます。クリップされた空腸の一方の端を縫合糸結紮によって閉じ、6-0ナイロンカット縫合糸を使用します。

空腸を液体ゼラチンで満たし、縫合結紮によって反対側の端を閉じます。次に、空腸の長さにわたって4つの縫合糸の結び目を作ります。組織を50ミリリットルの15%スクロースに10%緩衝中性ホルマリン溶液に浸し、摂氏4度で一晩

翌日、縫合糸の結び目で空腸を切断して、両端が結紮されたソーセージのような空腸片を3つ取得します。クライオモールドでピースを整列させ、埋め込みコンパウンドで覆います。液体窒素で冷却したイソペンタンでクライオモールドをスナップ凍結します。

空腸の切片を準備するには、まずクライオスタットのチャンバー温度と物体温度の両方を摂氏マイナス22度に設定します。凍結した組織ブロックをクライオスタットチャンバーのクライオモールドに少なくとも15分間置きます。15分後、かみそりの刃でブロックを半分に切り、空腸の横断面を露出させます。

ブロックの半分をクライオスタットアダプターに取り付けます。ゼラチンを充填した空腸を30ミクロンの厚さの切片に切片にします。冷凍鉗子を使用して、切片を3ミリリットルのPBSを含む35ミリメートルの培養皿に穏やかに移します。

切片を3ミリリットルのPBS-Tで各5分間3回洗浄した後、フリーフローティング切片を含む皿に新たに調製した抗原賦活化溶液3ミリリットルを加えます。次に、蓋を閉め、皿と蓋の間の隙間をビニールテープで密封し、ハイブリダイゼーションインキュベーターで摂氏50度で振とうせずに3時間インキュベートします。免疫染色後、PBSで染色切片の皿を実体顕微鏡に移します。

MASコード化された白いスライドガラスの中央にある液滴に200マイクロリットルのPBSを置きます。次に、P200ピペットチップを使用して、皿から1つの空腸切片を液滴に移します。セクションの位置合わせを調整した後、セクションの周囲に残っているすべてのPBSを吸引します。

20マイクロリットルの水性封入剤を追加し、メディアの上にカバースリップを置きます。カバーのスリップエッジをキシレンベースの封入剤ですぐに密封し、2〜3時間乾燥させてから共焦点顕微鏡観察を始めてください。空腸のゼラチン充填は、丸い円盤の形状を維持し、絨毛の直立位置を維持します。

ゼラチン充填物がないと、空腸切片がねじれやすくなり、絨毛が後方に揺れるようになります。pY1798は、膜、スプール形状の体細胞の細胞血漿、および強く染色された管腔先端を含む房細胞全体を再現性よく描写します。これらの場所では、強力なシグナル凝縮が房細胞の突き出た房に対応します。ファロイジンは、腸ブラシの境界を形成する微絨毛に存在する糸状アクチンに対して高い親和性を持っています。

ファロイジンは、房から伸びる細根の塊に対応する太いブラシの境界を再現性よく目立つようにマークします。pY1798シグナルと目立つ厚みのあるファロイジン陽性ブラシの境界との一貫した共局在は、このプロトコルが房細胞が絨毛上または陰窩内に存在するかどうかに関係なく、房細胞を首尾よく同定することを示しています。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば3日で行うことができます。

低発光点ゼラチン、フリーフローティングクライオ切片、低温抗原賦活化の組み合わせは、他のプロジェクト組織の免疫染色にも適用できます。