細胞内マクロファージの内部成長の定量化は高速とリーシュ マニア原虫の病原性を評価するための信頼性の高い方法です。

この実験の全体的な目標は、in vitroでのマウス骨髄由来マクロファージの感染を通じて、さまざまなリーシュマニア株の病原性を評価し、その後の寄生虫の細胞内増殖動態の定量化を行うことです。この方法は、宿主のマクロファージと病原体の両方から、感染性リーシュマニア原虫の病原性を決定する因子に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、in vivo 研究と比較して、必要な動物数が大幅に少なく、高速で経済的、かつ信頼性の高い方法であることです。

この技術の意味は、変異したリーシュマニア株の感染性や治療用化合物の有効性を評価するために使用できるため、リーシュマニア症の治療にまで及びます。骨髄由来マクロファージの単離と細胞内寄生虫の定量ステップは、書かれたプロトコルだけでは学ぶことが難しいため、この方法を視覚的に実証することは非常に重要です。まず、生後4〜6週齢の雌マウスを解剖ボードに固定し、動物を70%エタノールで消毒します。

ハサミを使って片方の股関節の近くに1センチの切開をし、関節の周りの皮膚を丸ごと切ります。脚から足首に向かって皮膚を引っ張って手足を慎重に外し、足首の関節または下の足を切り取って脛骨を無傷のままにします。股関節の位置を特定するには、大腿骨を操作して回転点を特定し、はさみを使用して股関節の上の脚を切断し、大腿骨の近位頭を無傷のままにします。

脚からできるだけ多くの筋肉と結合組織を取り除き、洗浄した骨を抗生物質を添加した滅菌RPMIを含むペトリ皿に氷の上に置きます。脚の骨の2番目のセットを採取した後、滅菌した鉗子と10番の刃を使用して、残っている筋肉と結合組織を取り除きます。洗浄した骨を空のペトリ皿の蓋に移し、メスを使用して各脛骨の両端を取り外して骨髄にアクセスします。

鉗子を使用して、氷上の50ミリリットルの円錐管の口に1つの脛骨を置き、抗生物質を補充した培地で満たされた10ミリリットルの注射器に取り付けられた25ゲージの針の先端を脛骨の一端に挿入します。約5〜10ミリリットルの培地を骨を通して円錐管に流し込み、すべての赤い骨髄組織が採取され、骨が白く見えるまで注ぎます。すべての骨髄が収集されたら、プールされた骨髄を遠心分離し、骨髄細胞パレットを5ミリリットルの骨髄由来マクロファージ培地に再懸濁します。

骨髄細胞懸濁液を、60ミリリットルの滅菌骨髄由来マクロファージ培地を含む175平方センチメートルの細胞培養フラスコに移し、培養フラスコの培地でチューブを2回すすぎ、細胞の回復を最大化します。2回目の洗浄後、30ミリリットルの細胞アリコートを2番目の175平方センチメートルの細胞培養フラスコに移し、各フラスコをフィルターキャップで閉じます。次に、両方の培養物を摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートし、常在するマクロファージを汚染した線維芽細胞や他の付着細胞から分離できるようにします。

翌朝、各フラスコから10ミリリットルの未分化骨髄細胞含有上清を個々の100×15ミリメートルの非組織培養処理ポリスチレンペトリ皿に移し、細胞をさらに2〜3日間細胞培養インキュベーターに戻します。次に、皿ごとに5ミリリットルの新鮮な摂氏37度の骨髄由来マクロファージ培地を培養物に供給し、プレートをインキュベーターに戻します。培養後7日目または8日目に、真空ラインに取り付けられた吸引チップを使用して、オートクレーブ滅菌済みの12mmガラスカバースリップ4枚を6ウェル培養プレートの各ウェルの底に重ならないように移します。

実験の各時点で同一のプレートを準備します。次に、骨髄由来マクロファージ培養物を新鮮な摂氏37度のPBSと5ミリリットルのPBSで2回洗浄し、カルシウムとマグネシウムを含まない5ミリリットルのEDTAを各プレートに1ミリモルEDTAを補充します。摂氏37度で5分後、分離した細胞を50ミリリットルの円錐管にプールし、カルシウムとマグネシウムを含まないPBSの追加の5ミリリットルで各プレートを2回すすぎます。

遠心分離後、マクロファージを5〜10ミリリットルの新鮮な骨髄由来マクロファージ培地に氷上に再懸濁します。カウント後、新鮮な骨髄由来マクロファージ培地で細胞を1ミリリットルあたり10〜5倍の濃度に希釈し、6ウェルプレートにウェルあたり2ミリリットルの細胞を添加します。次に、細胞培養インキュベーターで細胞を一晩インキュベートします。

細胞にL.amazonesisを感染させるには、寄生虫懸濁液を適切な実験多重度に希釈し、実験の全時点を含む6つのウェルプレートすべてのウェルに50〜100マイクロリットルの寄生虫を添加します。骨髄由来マクロファージを適切な感染期間と温度でインキュベートします。次に、ウェルごとにカルシウムまたはマグネシウムを含まない新鮮な摂氏37度のPBSでウェルを3回洗浄し、初期時点のサンプルを1.5〜2ミリリットルの2%パラホルムアルデヒドで10分間固定します。

後の時点に対応するプレートについては、各ウェルに2ミリリットルの新鮮な骨髄由来マクロファージ培地を追加し、プレートを適切なインキュベーターに戻します。次に、先ほど示したように、残りの各時点の細胞を固定して洗浄し、サンプルを摂氏4度で新鮮なPBSに保存します。DAPIで細胞を染色するには、上清をカルシウムとマグネシウムを含まない1.5ミリリットルの新鮮なPBSに置き換え、室温で10分間0.1%非イオン性洗剤を補給した後、カルシウムまたはマグネシウムを含まないPBSで2ミリリットルを3回洗浄します。

次に、室温で1時間、1ミリリットルのPBIにDAPI1ミリリットルあたり2マイクログラムの細胞を染色します。3回の洗浄後、カバーのスリップセル側を下にして、市販の退色防止剤で取り付けられた個々のガラス顕微鏡スライドに置きます。次に、感染細胞の数を定量化するために、蛍光顕微鏡の100倍エマージョンオイル対物レンズと手動カウンターを使用して、各大きなDAPI染色核の周りに集まっている小さなアマスチゴート核の数を特定します。

リーシュマニアには、培養の定常期に前輪式前乳房と区別されるメタ環状前乳房と、脊椎動物の宿主内で見られる細胞内感染型であるアマスチゴテの2つの感染型があります。ここでは、軸索分化型アマスチゴテスを骨髄由来マクロファージ内で可視化することができます 最初の感染から1時間後、および食作用ソソーム融合による寄生胞の形成前に。48時間後、複数の寄生虫を保有する明確な大きな寄生虫性液胞が観察されます。これは、毒性の強いリーシュマニア感染症の特徴です。

対照的に、非毒性の対数期前茎動物は、寄生性液胞の発達を開始することができず、複製に失敗し、最終的には宿主マクロファージ内で死滅します。この実験では、感染後72時間まで細胞内野生型メタサイクリックリーシュマニア原虫の数が着実に増加していることが観察されましたが、ミトコンドリアの鉄輸入が損なわれた変異型寄生虫の細胞内増殖はほとんどまたはまったく測定されず、マクロファージ内の寄生虫の増殖にはミトコンドリア活性が必要であることが示唆されました。野生型および変異型無軸虫を用いたマクロファージ感染は、中環状前胸類と同様の細胞内増殖パターンを示したが、野生型寄生虫の感染力は中環状前胸類よりもさらに高かった。

メタサイキング・プロマスタチゴテ感染には最初の24時間の遅延があることに注意することが重要です。これは、内在化されたメタサイキング・プロマスタゴットが複製を開始する前に最初にアマスチゴテスに分化するために必要な時間を表しています。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば15日で完了することができます。この手順を試行する際には、適切なマウス系統を使用し、マクロファージ細胞と寄生虫細胞の両方を慎重に定量して、すべての実験で一貫したMOIを確保することが重要です。

このビデオをご覧になった後、DAPIによる核染色後の骨髄由来マクロファージの培養方法とリーシュマニアへの感染方法、および細胞内寄生虫の増殖を定量化する方法について十分に理解できるはずです。Leismaniaでの作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは、生物学的安全キャビネットや個人用保護具の使用、鋭利な器具の回避などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。