Name: 細胞内マクロファージの内部成長の定量化は高速とリーシュ マニア原虫の病原性を評価するための信頼性の高い方法です。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 学ぶマウス骨髄由来マクロファージを用いたリーシュマニア感染法と細胞内増殖の定量化技術。この高速で信頼性の高いin vitro手法は、寄生虫の病原性評価と治療薬開発に貢献します。

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この作品は、国立衛生研究所健康付与 RO1 AI067979 NWA によって支えられました。 有限会社は、学部の交わりからハワード ヒューズ医学研究所/大学のメリーランド州カレッジパークの受信者です。

すべての実験手順はケアと実験動物の使用のためのガイドの推奨事項に従って健康の国民の協会によって実施され、メリーランド大学 IACUC によって承認されました。1 4 からのセクションで説明するすべての手順は、生物層流キャビネット内無菌実施されなければなりません。個人用保護具を使用する必要がありますと実験のすべての段階を通してライブリーシュマニア原虫の処理中に注意が必要があります。
1. 分離と骨髄由来マクロファージ (BMMs)8,30,31の分化
<ol><li>
0:4 - 6 週齢女性C57BL/6または CO2チャンバーのBALB/cマウスを犠牲にし、頚部転位による死を確認します。70% エタノールに浸して保存すると、ハサミ、鉗子の滅菌を確認します。滅菌骨髄細胞分離プロセス全体の処理を許可する 70% のエタノールと手袋をスプレーします。</li>
	<li>解剖に犠牲にされたマウスのセキュリティで保護されたその前肢を固定することによってボードおびただしく 70% エタノールを噴霧して消毒してください。</li>
	<li>股関節に近いハサミ小切開 (約 1 cm) を確認します。皮膚の下に別の基になる筋と股関節周りのすべての方法皮膚をカットはさみを慎重に挿入します。 注: 郭清ボードは、股関節への改善されたアクセスを許可するように回転可能性があります。</li>
	<li>慎重に足首に向かって引いて足から皮膚を deglove し、削除します。足関節は、脛骨は完全にそのまま接合部や足首から下をカットする非常に慎重にされてで足を切断します。 注: この段階で腓骨が緩く接続されているし、鉗子で簡単に分けることができます。</li>
	<li>手動で回転のポイントを識別するために大腿骨を操作することによって股関節を見つけます。慎重に近位大腿骨頭をそのまま使用するのに股関節上に足を切断するのにハサミを使用します。</li>
	<li>ハサミでできるだけ脚から同様に多くの筋肉や結合組織を削除します。足首と股関節の構造上、余分な骨素材から任意の残りの皮を削除します。</li>
	<li>ペニシリン/ストレプトマイシン (最終濃度 1%) 氷の上にペトリ皿を添加した滅菌に RPMI で掃除の脚の骨を配置します。</li>
	<li>脛骨と大腿骨他の後ろ足を分離する 1.6 から 1.4 の手順を繰り返します。</li>
	<li>RPMI 鉗子を滅菌と滅菌 #10 ブレードを使用して浸漬骨から残りのすべての筋肉と結合組織を削除します。</li>
	<li>シャーレの蓋に骨を配置します。脛骨を骨髄にアクセスする足関節のすぐ上の刃で慎重にカットします。ひざの関節のすぐ下の切断することによって脚の残りの部分から脛骨を削除します。</li>
	<li>10 mL 滅菌 RPMI 10 mL 注射器にペニシリン/ストレプトマイシン (最終濃度 1%) を添加した、25 G 針を接続を描画します。</li>
	<li>しっかり脛骨鉗子、垂直方向に氷の上 50 mL コニカル チューブの上。軽く円錐管にもう一方の端から骨髄をフラッシュするのに骨の端に RPMI 約 5 mL を注入するのに注射器を使用します。骨が白くなるまで合計 10 mL RPMI で骨髄をフラッシュします。 注: 徹底洗浄後骨が白きます。されていない場合は、骨髄を削除するフラッシュを続行します。脛骨の遠位端は、小さすぎて針を挿入する場合、刃にトリミングする必要があります。</li>
	<li>膝関節上とすぐ下の骨髄にアクセスする骨の両端を公開する股関節、大腿骨をすぐにカットします。10 mL RPMI 脛骨と同じ方法での合計で大腿骨の骨髄をフラッシュします。</li>
	<li>クリーニングと残りの骨と 1.13 で 1.6 の手順をフラッシュを繰り返し、単一の 50 mL の円錐管にフラッシュされる骨髄細胞を収集 注: 場合、骨は骨をフラッシュする前に解剖中の任意の時点で中断、この骨から骨髄を使用しないでください。</li>
	<li>骨髄 300 x g で 4 ° C で 10 分間のすべての 4 つのボーンからフラッシュを収集するために使用される円錐チューブを遠心します。</li>
	<li>BMM の生殖不能媒体の 60 ml (20% の最終的な集中に RPMI FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、1.2 mM Na-ピルビン酸、25 μ g/mL 人間 M CSF) 175 cm2細胞培養用フラスコ フィルター キャップ付けに。</li>
	<li>清次遠心分離を破棄し、フラスコから BMM 培地 5 mL を使用して分注上下による細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>細胞懸濁液を培養用フラスコに転送、最大セル復旧できるように培養用フラスコから BMM 培地で 2 回の円錐管をすすいでください。細胞懸濁液が完全に混合媒体にことを確認し、フィルター キャップ付け第 2 175 cm2細胞培養フラスコに初期 175 cm2細胞培養用フラスコから 30 mL を配布します。</li>
	<li>37 ° c、5% CO2任意の汚染線維芽細胞、マクロファージと他の付着性のセルの分離を許可する各一晩 30 mL 細胞懸濁液を含む両方のフラスコを孵化させなさい。</li>
	<li>
1 日目:100 x 15 mm 無処理 TC ポリスチレン シャーレ約 10 mL でフラスコから未分化骨髄細胞を含む上清を転送/皿し、, 37 ° C、5% CO2.でフラスコを破棄します。</li>
	<li>
3 または 4 日:各ペトリ皿に (37 ° C に加温) 追加 5 mL BMM 媒体を追加し、37 ° C、5% CO2で潜伏を続けます。</li>
</ol>2. めっき Coverslips に BMMs 感染 (7 または 8 日)
<ol><li>6 ウェル培養プレートを準備するには、それぞれの空の下にも 4 4 滅菌 12 mm ガラス coverslips (オートクレーブ、密閉ガラス容器に格納される) を配置します。 注: 真空ラインに装着吸引チップで各滅菌 12 mm coverslip をピックアップします。井戸掃除を中断するチューブをつまんでリリース希望の位置に重複なしに coverslips を配置します。</li>
	<li>吸引メディア (と任意の非付着性のセル) 付着性骨髄でコーティングされたシャーレから派生したマクロファージと優しくすすぎ付着細胞カルシウムとマグネシウム塩化 (PBS-/-) を予め加温なしダルベッコ滅菌リン酸緩衝生理食塩水で 2 倍37 ° c</li>
	<li>滴下し、5 mL 滅菌 1 最終濃度 1 mM EDTA 各シャーレの-/- x の PBS を追加し、付着 BMMs。 顕微鏡を用いた細胞が切り離されることを確認をデタッチする 37 ° C で 5 分間インキュベートします。</li>
	<li>50 mL の円錐管に 1 mM EDTA を添加した 1 × PBS-/- で中断すべて剥離細胞を収集します。リンスは各皿 5 ml の PBS-/- 2 x、細胞懸濁液プールに追加します。 注: コレクション プロセス中に EDTA 毒性から大食細胞を保護するために追加の PBS-/- 細胞懸濁液を希釈することがあります。</li>
	<li>300 x g で 4 ° C で 10 分間遠心上澄みを廃棄し、ピペッティングによるマクロファージを 5-10 mL BMM 媒体で再懸濁します。場所は、細胞への愛着チューブと凝集を防ぐために氷の上を再停止されます。</li>
	<li>検定でトリパン ブルー色素排除を使用して実行可能なセルを数える。 注: 5 mL の培地で再停止される BMM セルをカウントするには、-/- 445 の μ L の PBS で 30 μ L 0.4% トリパン ブルー溶液 25 μ L の細胞懸濁液の希釈ミックス普通ことを簡単な定量化 (考慮して最終的な計算の 20 倍希釈係数検定).トリパン ブルー (生菌) で染色するでしたされませんセルのみをカウントします。この混合物があまりにも濃縮または希釈、細胞懸濁液の量を変更可能性があります。一般に、BMM の準備当たりの収量は 2 x 107とマウスのシングルから 5 x 10 の7セル間異なります。</li>
	<li>目的のめっき濃度 (5 x 105/mL) BMM 培地で細胞懸濁液を準備し、それぞれはよく 1 × 106マクロファージを受信するようにウェルあたり 2 mL 中 6 ウェル プレートに懸濁液を分散します。 注: これはすべてのよく取得、coverslips を均一にカバーするマクロファージの十分な数を保証する重要なステップです。井戸 coverslips の重複または媒体でフローティングされていないを確認します。もしそうなら、そっと滅菌ピペット チップで調整します。</li>
	<li>37 ° C、5% CO2で一晩インキュベートします。</li>
</ol>3. L. amazonensisの感染形態の浄化
注: 準備リーシュ マニア感染症 - 定常 promastigote 文化8,13から metacyclic promastigotes の浄化や標準L. amazonensis を使用して amastigote フォームに文化の promastigotes を区別します。無菌分化プロトコル6,8。
<ol><li>
リーシュ マニア原虫metacyclic promastigotes の精製を用いた密度勾配 media(Materials)33<ol>
<li>40% 原液滅菌、エンドトキシン フリーの水の密度勾配メディアを準備します。</li>
		<li>M199 培地で 10% 濃度を準備する (血清) なし 10 x M199 中密度勾配ソリューションを希釈します。</li>
		<li>0.22 μ m のフィルターを通してすべてのソリューションをフィルターします。 注: 4 oC は、もはや闇の中で 1 ヶ月以上の在庫ソリューションを格納できます。</li>
		<li>15 mL コニカル遠心管の底に 40% 密度勾配メディア溶液 2 mL を追加します。</li>
		<li>層の 40% の密度勾配メディア層の上に M199 で 10% の密度勾配メディア溶液 2 mL、慎重にパスツール ピペットを使用して 2 つのレイヤー間の任意の混合を回避します。</li>
		<li>10 分間 1,900 × g で遠心分離によって停滞期文化から 1 x 10 の9の寄生虫を収集します。</li>
		<li>セルで 6 mL ダルベッコ変更重要な媒体 (DMEM) 再懸濁します。</li>
		<li>レイヤー グラデーション メディア層、優しく、レイヤー間の混合を避けるためにパスツール ピペットを使用して 10% の密度の上に直接細胞懸濁液 2 mL。</li>
		<li>室温で 1,300 x g で 10 分間のグラデーションを遠心します。 注:リーシュ マニア原虫種の物性の違い、それぞれ遠心条件は最大収量を確保するため若干調整する必要があります。</li>
		<li>上位 10% の密度勾配メディア境界 (0%、10% の密度勾配媒体層間のインターフェイス) で結成から寄生虫 (metacyclic promastigote フォームの濃縮) を収集します。</li>
		<li>DMEM の 1 つのボリュームで寄生虫を希釈し、遠心分離 (室温で 10 分間 1,900 g x) によって収集します。</li>
		<li>500 μ L DMEM 培地で再懸濁します、収量を定量化する検定でカウントします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
L. amazonensis amastigotes 培養条件下での生成 (低 pH/温度を高架)6,8,13<ol>
<li>Amastigote 培地 (pH 4.5) の等量とログ相 promastigote 文化 (pH 7.4 26 oC) のミックス 5 mL は 25 cm2フラスコ (合計 10 mL 中) を使用して、26 の ° C で一晩インキュベートします。</li>
		<li>26 ° C から 32 ° c. にフラスコをシフトします。</li>
		<li>3 〜 4 日後の 32 ° C で amastigote メディア文化 1:5 分割します。</li>
		<li>寄生虫を感染症で使用する準備ができているかどうかを確認する次の 3-4 日 (最大 7 日) にチェックインします。 注: 正常な無菌 amastigotes 表示鞭毛なしの楕円形が必要です。部分的に差別化された amastigotes がある短い鞭毛と大きな楕円形。文化が塊の多くを持っていない - 非成長で、寄生虫を死の徴候が多く群生しています。Amastigote 文化を 1:5 の分割、最大 3 週間維持することができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. l. amazonensisと感染症
<ol><li>目的モイ (通常 3-5 metacyclic promastigotes マクロファージ [MOI 1:3、1:5] あたり) とマクロファージ [MOI 1:1] につき 1 amastigote によると寄生虫の懸濁液を希釈します。-/- 50-100 μ L のボリュームで PBS で 2 mL の培地を既に含む各ウェルにリーシュを追加します。</li>
	<li>BMMs amastigotes と metacyclic promastigotes 34 oC 感染症で 3 h 1 h 間インキュベートします。 メモ: 最適な感染温度は種によって異なります。</li>
	<li>次の孵化、徹底的に洗い流す-/- 無料の寄生虫も 3 x 2 ml の PBS で 37 ° c に予め温めておいた 注: 分散 coverslips がお互いにフロートしないように優しく PBS。プレートを軽く旋回し、液体を吸引します。クロス汚染を避けるために寄生虫の複数の系統を使用している場合は、独立した吸引チップを使用します。</li>
	<li>それぞれの孵化によって 1 h または 3 h の時間ポイント サンプルを修正 2% の 1.5-2 mL でも PFA-/- 10 分のため PBS で洗浄 PBS-/- の 3 倍。最後の洗浄を吸引しないし、染色まで PBS で coverslips を含んでいる版冷蔵庫で冷やします。</li>
	<li>さらにタイム ポイントのプレートの各ウェルに 2 ミリリットル新鮮な BMM 媒体を追加し、34 ° c. で孵化させなさい</li>
	<li>修正残り時間に応じてポイントで説明 4.3、ステップ、板染色まで冷蔵庫で冷やします。</li>
</ol>5. DAPI 染色と Coverslip 取付
<ol><li>Coverslips を含む井戸から PBS を吸引し、0.1% 非イオン性洗剤で 1.5 mL PBS-/- を追加します。-/- 2 mL の PBS で 3 回洗浄後、室温で 10 分間インキュベートします。</li>
	<li>2 μ g/ml (水に 5 mg/mL 原液から希釈) DAPI coverslips を含む井戸に 1 mL の PBS-/- を追加し、さらに 1 時間室温で孵化させなさい。 注: DAPI のインキュベーション時間はリーシュ マニア原虫の細胞内の適切な可視化にとって重要です。急速に大食細胞核を染色、その大きいサイズと DNA のためコンテンツが細胞内の寄生虫の核の染色は遅くなります。したがって、BMM 核を視覚化する必要なインキュベーション時間を延長は寄生虫の核膜と寄生虫細胞膜透過に DAPI を許可するため。適切な DAPI 染色、寄生虫のべん毛のポケット近くミトコンドリア キネトプ ラスト DNA も視覚化できます、核の DNA に加え。</li>
	<li>それぞれよく coverslips 3 を含む洗浄 2 mL PBS-/- とそれから、持ち上げて x と下細胞側に置くし、ガラス顕微鏡をマウントする鉗子でフリップ coverslips 市販 antifade 取付試薬とスライドします。 注: Coverslips は非常に壊れやすい、慎重な取り扱いを必要です。特に井戸を持ち上げるときの側壁に対して、それらの圧力を置かないようにします。PBS-/- の数滴を追加する coverslip と井戸の間の表面張力を減らすし、リフティングのプロセスが容易になります。極細針は、井戸の底から coverslips を詮索好きな支援するために使用可能性があります。観察をスライドに配置した後軽く下に押して鉗子でメディアをマウントで気泡を押し出す。観察が壊れているがおそらく持ち上がるプロセス中に反転がマウントされません。予備第 4 coverslip を使用します。</li>
	<li>スライド定量化まで冷蔵庫で冷やします。</li>
</ol>6. 感染症の定量化
<ol><li>イマージョン オイル 100 X 対物レンズを用いたマクロファージに焦点を当て、蛍光顕微鏡下で DAPI 染色スライドを調べる (358 で励起 nm; 461 で最適な発光 nm)。 スライド ガラスと coverslip の大食細胞の層にフォーカスがあることを確認します。</li>
	<li>マクロファージ (大核を DAPI 染色) の数と小さい amastigote 核マクロファージ原子核の周りに群がった数を数値化 (図 2 aDAPI を参照) 各視野を使用して手動のカウンター。 注: Amastigote 核すべて表示ことがあります彼らの小さいサイズのために集中の 1 つの平面に。大食細胞核に焦点を当てたときに表示されるそれらをカウントして寄生虫核マクロファージの核の上下の平面を確認するファインフォーカスを使用します。</li>
	<li>定量化を繰り返すもう一つのビジョンのフィールドに移動します。別のカウンター キーを使用して、カウント フィールドの数を追跡します。防ぐために各 coverslip で並列で visual フィールドに移動する重複をカウントします。</li>
	<li>Coverslip あたり 200 マクロファージの最小値を定量化します。3 通 (3 coverslips) 感染症のそれぞれの時点を定量化します。前の 1 つがcoverslip の重複、悪い土台、ガラス破損等によるカウントのため適していない場合 4 coverslip をカウントします。 注: 任意の 1 つの coverslip 200 マクロファージにカウントできません、第四にスペアをカウントします。</li>
	<li>Amastigotes/マクロファージまたは amastigotes/100 大食細胞として感染率を計算し、生定量化データから感染させた大食細胞割合を決定します。</li>
</ol>

著者は、彼らは競合の金銭的な利益がある宣言します。

上記、BMM 感染試験によって生成された定量的データにより、感染率と比較的短い期間 (最長 2 週間、2 に比べて病原性の変化の信頼性の決定を取得します。ヶ月生体内で実験に必要な)。このメソッドは、DNA 特定色素 DAPI、特にマクロファージと寄生虫の核を汚れと感染細胞の迅速な同定及び定量化に依存します。比較では、ギムザなどの他の汚れは強さを変化させて、複雑な視覚分析37多数の異なる細胞コンポーネントにバインドします。DAPI を使用細胞内寄生虫・携帯から明確な区別の認識構造 (唯一の宿主細胞の核が染色もとのサイズが桁違い寄生虫核より大きい)、簡単かつ迅速にできるように感染症の定量化。
任意の実験プロシージャと同様、このメソッドはいくつかの制限といくつかの重要な手順を慎重に実行を必要とします。生体内でリーシュ マニア感染症には、貪食能、感染症38の究極のコースを決定する前に複雑な生得の免疫反応が含まれます。モデル マウス株の選択は、したがっての研究デ...

リーシュ マニア症は、原虫リーシュ マニア属の種によって引き起こされる人間の病気の広いスペクトルを指します。約 1200 万人現在リーシュ マニア、世界中に感染しているし、以上 3 億 5000 万が危険にさらされます。病の病理は、リーシュ マニア原虫種と宿主因子によって決まるし、症状が無害な自己治癒皮膚病変から致命的な visceralizing フォームに変わる。最悪の人間の病気としてマラリア後だけランキングが1原虫感染によって引き起こされる未処理、内臓リーシュ マニア症は致命的な場合。病の病理や症状に多岐にわたる違いがあるにもかかわらずすべてのリーシュ マニア原虫種昆虫内の promastigote と amastigote の段階と脊椎動物のホストをそれぞれ交互 digenic ライフ サイクルがあります。内部脊椎動物、リーシュ マニアホスト マクロファージ浸潤、parasitophorous 液胞 (Pv)、高度病原性 amastigote フォームが複製ファゴライソゾームの特性と酸性コンパートメントの形成を誘導します。Amastigotes 慢性感染の間に宿主組織の永続化および伝送サイクルを完了するに感染していないサシチョウバエを渡されることができます。したがって、人間の病気の開発の中で、amastigotes は、最も重要なリーシュ マニアライフ サイクル フォーム2です。理解リーシュ マニア病原性3,4,5,6、7のための重要なマクロファージ Pv 内での amastigotes の複製方法の調査は、新規の効果的な治療法の開発。
リーシュ マニア感染や骨髄由来マクロファージ (BMMs)、時間の経過とともに細胞内リーシュ マニア原虫の数の定量的評価を含むレプリケーションを研究する研究室による定期的な利用法をご紹介します。リーシュ マニアの定量化の文化におけるマクロファージに感染フォーム (metacyclic promastigotes または amastigotes)の in vitro感染マウス骨髄と分化から球の収穫には、細胞内寄生虫感染 72 96 h の期間の 24 時間間隔での数です。この試金は、いくつかの環境要因および足蹠でさらに検証されたL. amazonensis病原性の促進に鉄の役割の重要性の識別を含む寄生虫の遺伝子の影響を判断する私たちの研究室で使用されていますマウス6,8,9,10、11,12,13,14,15 病変の開発研究.以来、すべての病原性リーシュ マニア原虫種ホスト マクロファージ内の複製のニッチを確立、この試金はすべてリーシュ マニア原虫種の病原性決定の普遍的に使用できます。
BMM 感染症を実行する単一セルのレベルでホスト寄生虫相互作用の解析とこうしてリーシュ マニア原虫が彼らのホストの優先の微小環境、マクロファージの PVs と対話する方法のより広範な理解ことができます。探索する正常にマクロファージ感染アッセイ複数グループ16,17,18,19,20,21,22で使用されています。ホスト マクロファージや細胞内感染症を特徴付ける複雑な相互作用の彼らの潜在的関与やリーシュ マニア原虫遺伝子の機能。BMM の感染症は、寄生虫としての成長、読み出し殺菌一酸化窒素産生、活性酸素種の生成および他の不利な条件など、細胞の生存に影響を与えるホストの要因の影響の定量化を許可します。ライソソーム様 Pv23中が発生しました。マクロファージ感染アッセイは、治療開発13,24の潜在的な抗 leishmanial 薬リードを識別するために利用されています。
BMM 感染症の体外性質は、リーシュ マニア病原性を評価するために他の方法に比べていくつかの利点を提供します。ただし、時間の経過とともに細胞内寄生虫生存のメカニズムを調べるいくつかの以前の研究では、感染率20,21,24は定量化しなかった。さらに、次の時間をかけて生体内で感染症に焦点を当てた多くの研究によってそう寄生虫レプリケーション25,26に間接的にのみ関連が他の生理学的な症状や皮膚病変の長さを測る,27.体内感染寄生生物の毒性を評価するために厳格なアプローチが単独で腫れ足蹠に基づく病変サイズ測定はしばしば不十分で彼らは感染した組織の炎症反応を反映してではなく、寄生虫の絶対数。このため、足蹠ヒメシバの試金が感染した体内寄生虫の負荷の定量化が続いて長い制限希釈を必要とする手順28の試金します。さらに、研究生体内では度々 関心6,8,9,10,の組織を抽出する時に別のポイントで複数の動物を犠牲にします。11,13。 対照的に、ちょうど 1 つの動物から得られる BMMs の数が多いと、これらの細胞は、時間の様々 なポイントで感染症の評価を許可する条件の下でめっきすることが。さらに、生体内での研究と比較すると実験条件をより細かく制御 BMM 感染体外を実行できます。寄生虫自身と一緒に感染するマクロファージの定量化は、感染 (MOI) と培養条件の多様性の正確に制御できます。これらの要因を細かく制御は、離散細胞経路の特性を識別する内感染に与える影響を理解する上でのキーをすることができます。
これらの利点を考えると、それはリーシュ マニア病原性を研究する非常に少数グループがマクロファージの細胞内複製の定量的評価をフルに活用を撮影ところやや意外。この資料では、このアッセイのより広範な利用を妨げる、その適切な実施を促進するステップバイ ステップのプロトコルを提供可能性があります一般的な落とし穴について述べる.精度、汎用性を考慮してここで述べる BMM 感染試験ないのみ利用できるリーシュ マニア病原性に影響を及ぼす宿主-病原体相互作用を探索する内で複製その他の微生物の研究にもマクロファージ29。重要なは、この試金は反 leishmanial 医薬品開発の迅速かつ経済的な前臨床スクリーニング法としても開発できます。

<table><tbody><tr><td>6ウェル細胞培養プレート</td><td>Cellstar</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Acros Organics</td><td>AC147440250</td><td></td></tr><tr><td>エアロゾルバリアピペットチップ (100-1000 &mu;L)</td><td>フィッシャーブランド</td><td>02-707-404</td><td></td></tr><tr><td>エアゾールバリアピペットチップ (20-200 &mu;L)</td><td>フィッシャーブランド</td><td>02-707-430</td><td></td></tr><tr><td>エアゾールバリアピペットチップ (2-20 &mu;L)</td><td>フィッシャーブランド</td><td>02-707-432</td><td></td></tr><tr><td>バードパーカー リブバック カーボンスチール サージカル ブレード #10</td><td>アスペン サージカル</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>BD ルアーロック チップ 10 mL シリンジ</td><td>ベクトン ディキンソン (BD)</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>BD プレシジョングライド ニードル 25G&nbsp;</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305124</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm</td><td>Cellstar</td><td>627 160</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Flask</td><td>Cellstar</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glasses: 12 mm circles</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>D-Biotin</td><td>J.T.ベイカー</td><td>C272-00</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール 200 プルーフ</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 100 mm x 15 mm 非 TC 処理ポリスチレン ペトリ皿</td><td>コーニング</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll400</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG テキサスレッド</td><td>Invitrogen</td><td>T-862</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG AlexaFluor488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>ヘミン</td><td>東京化学工業株式会社</td><td>H0008</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>アイソトンII 希釈剤</td><td>ベックマンコールター</td><td></td><td></td>8546719</tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>ジェミニ</td><td>400-106</td><td></td></tr><tr><td>ミディアム 199 (10X)</td><td>Gibco</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>Na ピルビン酸 (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>アルファ エーザー</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ジェミニ</td><td>400-109</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (-/-)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14200166</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピリン円錐形遠心分離チューブ 15 mL</td><td>セルスター</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピリン円錐形遠心分離チューブ 50 mL</td><td>セルスター</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止試薬</td><td>サーモフィッシャー</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス Lamp-1 抗体</td><td>Developmental Studies ハイブリドーマバンク</td><td>1D4B</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Bright-Line&nbsp;血球計算盤&nbsp;</td><td>ハウサーサイエンティフィック</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>RPMI ミディアム 1640 (1X)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 界面活性剤</td><td>ミリポアシグマ</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>シグマ Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>繊細なはさみ、4 1/2 インチ</td> <td>VWR</td><td>82027-582</td><td></td></tr><tr><td>解剖鉗子、ファインチップ</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>Z1 コールター パーティクル カウンター、デュアル スレッショルド</td><td>ベックマン コールター</td><td>6605699</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞内マクロファージの内部成長の定量化は高速とリーシュ マニア原虫の病原性を評価するための信頼性の高い方法です。

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

リーシュ マニア、リーシュ マニア症の原因となるエージェントのライフ サイクルそれぞれ昆虫内の promastigote と amastigote の段階と脊椎動物のホスト間で交互に行います。脊椎動物の段階で感染種によって非常に致命的な内臓疾患形態に良性の皮膚病変から広く、リーシュ マニア症の病原性の症状があります、すべてのリーシュ マニア原虫種ホスト マクロファージの内部に存在します。そのライフ サイクル。リーシュ マニア感染が侵入し生き残るため、マクロファージ内 parasitophorous 液胞 (PVs) 内のレプリケート機能に直結したがってします。したがって、細胞内で複製する寄生虫の能力評価は、病原性を決定するための信頼性の高い方法として機能します。モデル動物を用いたリーシュ マニア症開発の勉強は時間がかかり、退屈で、多くの場合困難である特に pathogenically 重要な内臓フォームです。骨髄由来マクロファージ (BMMs)リーシュ マニア原虫の細胞内の発展を追跡する方法をご紹介します。細胞内の寄生虫数は 72 96 h の感染のための 24 時間間隔で決定されます。このメソッドは、リーシュ マニア病原性に及ぼすさまざまな遺伝的要因の信頼性の高い定量できます。リーシュ マニア原虫ミトコンドリア鉄トランスポーター遺伝子 (LMIT1) の単一の対立遺伝子の削除がリーシュ マニア amazonensis変異株LMIT1/ΔLmit1の BMMs、内部成長能力を損なう方法を示す例については、野生型と比較して毒性の大幅な削減を反映しています。この試金は、宿主-病原体相互作用に及ぼす諸要因(栄養素、活性酸素種など)の分析を個別に操作できる実験条件を正確に制御できます。したがって、適切な実行と BMM 感染症研究の定量化は、従来の動物モデル研究の非侵襲的、急速な経済的な安全で信頼性の高い代替を提供します。

リーシュ マニアは 2 つの感染形 - metacyclic promastigotes procyclic promastigotes から文化の固定相で区別する amastigotes、細胞内ステージ (図 1) であります。L. amazonensisなどのいくつかのリーシュ マニア原虫種の amastigotes 区別できます無菌培養で pH (4.5) および高温 (32 ° C)、BMM PVs の中見つけられるそれらに類似した条件を下げる promastigote セルをシフトすることによって8,34. だけでリーシュ マニア原虫の metacyclic promastigote または amastigote フォームが PVs の形成を誘導してホスト マクロファージ35</s...

すべての病原性リーシュ マニア原虫種に存在し、脊椎動物のホストのマクロファージ内で複製。ここでは、リーシュ マニア、続いて細胞増殖動態の正確な定量培養マウス骨髄由来マクロファージに感染するプロトコルを提案する.このメソッドは、リーシュ マニアの病原性と宿主-病原体相互作用に影響を与える個々 の要因を調べる場合に役立ちます。

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

この実験の全体的な目標は、in vitroでのマウス骨髄由来マクロファージの感染を通じて、さまざまなリーシュマニア株の病原性を評価し、その後の寄生虫の細胞内増殖動態の定量化を行うことです。この方法は、宿主のマクロファージと病原体の両方から、感染性リーシュマニア原虫の病原性を決定する因子に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、in vivo 研究と比較して、必要な動物数が大幅に少なく、高速で経済的、かつ信頼性の高い方法であることです。この技術の意味は、変異したリーシュマニア株の感染性や治療用化合物の有効性を評価するために使用できるため、リーシュマニア症の治療にまで及びます。骨髄由来マクロファージの単離と細胞内寄生虫の定量ステップは、書かれたプロトコルだけでは学ぶことが難しいため、この方法を視覚的に実証することは非常に重要です。まず、生後4〜6週齢の雌マウスを解剖ボードに固定し、動物を70%エタノールで消毒します。ハサミを使って片方の股関節の近くに1センチの切開をし、関節の周りの皮膚を丸ごと切ります。脚から足首に向かって皮膚を引っ張って手足を慎重に外し、足首の関節または下の足を切り取って脛骨を無傷のままにします。股関節の位置を特定するには、大腿骨を操作して回転点を特定し、はさみを使用して股関節の上の脚を切断し、大腿骨の近位頭を無傷のままにします。脚からできるだけ多くの筋肉と結合組織を取り除き、洗浄した骨を抗生物質を添加した滅菌RPMIを含むペトリ皿に氷の上に置きます。脚の骨の2番目のセットを採取した後、滅菌した鉗子と10番の刃を使用して、残っている筋肉と結合組織を取り除きます。洗浄した骨を空のペトリ皿の蓋に移し、メスを使用して各脛骨の両端を取り外して骨髄にアクセスします。鉗子を使用して、氷上の50ミリリットルの円錐管の口に1つの脛骨を置き、抗生物質を補充した培地で満たされた10ミリリットルの注射器に取り付けられた25ゲージの針の先端を脛骨の一端に挿入します。約5〜10ミリリットルの培地を骨を通して円錐管に流し込み、すべての赤い骨髄組織が採取され、骨が白く見えるまで注ぎます。すべての骨髄が収集されたら、プールされた骨髄を遠心分離し、骨髄細胞パレットを5ミリリットルの骨髄由来マクロファージ培地に再懸濁します。骨髄細胞懸濁液を、60ミリリットルの滅菌骨髄由来マクロファージ培地を含む175平方センチメートルの細胞培養フラスコに移し、培養フラスコの培地でチューブを2回すすぎ、細胞の回復を最大化します。2回目の洗浄後、30ミリリットルの細胞アリコートを2番目の175平方センチメートルの細胞培養フラスコに移し、各フラスコをフィルターキャップで閉じます。次に、両方の培養物を摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートし、常在するマクロファージを汚染した線維芽細胞や他の付着細胞から分離できるようにします。翌朝、各フラスコから10ミリリットルの未分化骨髄細胞含有上清を個々の100×15ミリメートルの非組織培養処理ポリスチレンペトリ皿に移し、細胞をさらに2〜3日間細胞培養インキュベーターに戻します。次に、皿ごとに5ミリリットルの新鮮な摂氏37度の骨髄由来マクロファージ培地を培養物に供給し、プレートをインキュベーターに戻します。培養後7日目または8日目に、真空ラインに取り付けられた吸引チップを使用して、オートクレーブ滅菌済みの12mmガラスカバースリップ4枚を6ウェル培養プレートの各ウェルの底に重ならないように移します。実験の各時点で同一のプレートを準備します。次に、骨髄由来マクロファージ培養物を新鮮な摂氏37度のPBSと5ミリリットルのPBSで2回洗浄し、カルシウムとマグネシウムを含まない5ミリリットルのEDTAを各プレートに1ミリモルEDTAを補充します。摂氏37度で5分後、分離した細胞を50ミリリットルの円錐管にプールし、カルシウムとマグネシウムを含まないPBSの追加の5ミリリットルで各プレートを2回すすぎます。遠心分離後、マクロファージを5〜10ミリリットルの新鮮な骨髄由来マクロファージ培地に氷上に再懸濁します。カウント後、新鮮な骨髄由来マクロファージ培地で細胞を1ミリリットルあたり10〜5倍の濃度に希釈し、6ウェルプレートにウェルあたり2ミリリットルの細胞を添加します。次に、細胞培養インキュベーターで細胞を一晩インキュベートします。細胞にL.amazonesisを感染させるには、寄生虫懸濁液を適切な実験多重度に希釈し、実験の全時点を含む6つのウェルプレートすべてのウェルに50〜100マイクロリットルの寄生虫を添加します。骨髄由来マクロファージを適切な感染期間と温度でインキュベートします。次に、ウェルごとにカルシウムまたはマグネシウムを含まない新鮮な摂氏37度のPBSでウェルを3回洗浄し、初期時点のサンプルを1.5〜2ミリリットルの2%パラホルムアルデヒドで10分間固定します。後の時点に対応するプレートについては、各ウェルに2ミリリットルの新鮮な骨髄由来マクロファージ培地を追加し、プレートを適切なインキュベーターに戻します。次に、先ほど示したように、残りの各時点の細胞を固定して洗浄し、サンプルを摂氏4度で新鮮なPBSに保存します。DAPIで細胞を染色するには、上清をカルシウムとマグネシウムを含まない1.5ミリリットルの新鮮なPBSに置き換え、室温で10分間0.1%非イオン性洗剤を補給した後、カルシウムまたはマグネシウムを含まないPBSで2ミリリットルを3回洗浄します。次に、室温で1時間、1ミリリットルのPBIにDAPI1ミリリットルあたり2マイクログラムの細胞を染色します。3回の洗浄後、カバーのスリップセル側を下にして、市販の退色防止剤で取り付けられた個々のガラス顕微鏡スライドに置きます。次に、感染細胞の数を定量化するために、蛍光顕微鏡の100倍エマージョンオイル対物レンズと手動カウンターを使用して、各大きなDAPI染色核の周りに集まっている小さなアマスチゴート核の数を特定します。リーシュマニアには、培養の定常期に前輪式前乳房と区別されるメタ環状前乳房と、脊椎動物の宿主内で見られる細胞内感染型であるアマスチゴテの2つの感染型があります。ここでは、軸索分化型アマスチゴテスを骨髄由来マクロファージ内で可視化することができます 最初の感染から1時間後、および食作用ソソーム融合による寄生胞の形成前に。48時間後、複数の寄生虫を保有する明確な大きな寄生虫性液胞が観察されます。これは、毒性の強いリーシュマニア感染症の特徴です。対照的に、非毒性の対数期前茎動物は、寄生性液胞の発達を開始することができず、複製に失敗し、最終的には宿主マクロファージ内で死滅します。この実験では、感染後72時間まで細胞内野生型メタサイクリックリーシュマニア原虫の数が着実に増加していることが観察されましたが、ミトコンドリアの鉄輸入が損なわれた変異型寄生虫の細胞内増殖はほとんどまたはまったく測定されず、マクロファージ内の寄生虫の増殖にはミトコンドリア活性が必要であることが示唆されました。野生型および変異型無軸虫を用いたマクロファージ感染は、中環状前胸類と同様の細胞内増殖パターンを示したが、野生型寄生虫の感染力は中環状前胸類よりもさらに高かった。メタサイキング・プロマスタチゴテ感染には最初の24時間の遅延があることに注意することが重要です。これは、内在化されたメタサイキング・プロマスタゴットが複製を開始する前に最初にアマスチゴテスに分化するために必要な時間を表しています。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば15日で完了することができます。この手順を試行する際には、適切なマウス系統を使用し、マクロファージ細胞と寄生虫細胞の両方を慎重に定量して、すべての実験で一貫したMOIを確保することが重要です。このビデオをご覧になった後、DAPIによる核染色後の骨髄由来マクロファージの培養方法とリーシュマニアへの感染方法、および細胞内寄生虫の増殖を定量化する方法について十分に理解できるはずです。Leismaniaでの作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは、生物学的安全キャビネットや個人用保護具の使用、鋭利な器具の回避などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ライブホストのトランスジェニックリーシュマニア原虫のin vivoイメージング

感染THP1細胞と寄生虫の救助や変態アッセイ...

細胞内の抗リーシュマニアに対するスクリーニングのための寄生虫のRescue and形質転換試験<em&gt;ドノバンリーシュマニア</emTHP1ヒト急性単球性白血病細胞株における&gt;無鞭毛

このビデオは、コロニー形成単位アッセイによってマクロファージのリステリア菌感染を測定するためのin...

コロニー形成ユニットアッセイによる宿主細胞における細菌感染の定量化

このビデオでは、マクロファージをメタサイクリックプロマスタチゴートで処理し、その結果、細胞内アマスタステートを形成することで、リーシュマニアの病原性を調査しています。リーシュマニアの病原性の確認は、核酸蛍光色素染色によって達成されます。この知見は、リーシュマニア症の新たな治療法の開発に貢献することができます。...

培養マクロファージにおけるリーシュマニア病原性の評価

このビデオは、骨髄由来マクロファージ(BMM)の寄生虫の細胞内増殖を定量化するアッセイを示しています。マクロファージ細胞は、リーシュマニアの運動性侵襲期と非運動性の浸潤期にそれぞれ感染し、メタサイクリック前胸茎と無形成性に浸潤します。寄生虫はマクロファージに侵入し、寄生虫の液胞に内在化され、内部で増殖します。細胞内寄生虫の増殖は、マクロファージと寄生虫核を蛍光染色した上で顕微鏡を用いて定量化されます。...

マクロファージにおける寄生虫の細胞内増殖を定量化するためのIn vitroアッセイ

プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答

ここでは、レーシュマニア・アマゾネンシスを用いたマウスの皮状感染を評価するためのコンパイル済みプロトコルを提示する。これは、寄生虫の病原性を研究するための信頼性の高い方法であり、感染に対する脊椎動物宿主応答の全身的な見解を可能にする。...

マウスの寄生虫毒性を評価するリーシュマニアアマゾネンシスによるVivo感染

リーシュマニア感染における貪食作用に関連するメカニズムは、ほとんど解明されていないままである。ここでは、リーシュマニアと宿主細胞との相互作用の間に起こる初期事象を評価する方法について説明する。...

共焦点顕微鏡を用いた リーシュマニア の貪食作用の調査

ここでは、腹腔内(IP)または歯肉内(IG)を介して L.infantum-Lucに感染したゴールデンハムスターの縦断的評価を、生物発光イメージングとPCRによって紹介します。ハムスターは、感染の1日後(1 dpi)、感染の1週間後(8 dpi)、および感染の3週間後(22 dpi)に評価され、50dpi...

インビボ ルシフェラーゼを発現するAxenic Amastigotesの歯肉接種による Leishmania乳児感染ハムスターのイメージング

げっ歯類のマラリア原虫の遺伝学的交配は蚊に2つの遺伝的に異なる寄生虫を供給することによって実行されます。組換え子孫は、蚊が感染したマウスを噛まないようにできるようにした後、マウスの血液からクローン化されています。このビデオでは、遺伝的交雑を生成する方法を示しています。...

げっ歯類のマラリア原虫の遺伝的交雑の生産のためのプロトコル

学ぶマウス骨髄由来マクロファージを用いたリーシュマニア感染法と細胞内増殖の定量化技術。この高速で信頼性の高いin vitro手法は、寄生虫の病原性評価と治療薬開発に貢献します。

細胞内マクロファージの内部成長の定量化は高速とリーシュマニア原虫の病原性を評価するための信頼性の高い方法です。

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細胞内マクロファージの内部成長の定量化は高速とリーシュ マニア原虫の病原性を評価するための信頼性の高い方法です。

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