Name: ネイティブ、タグなしの Huntingtin Exon1 モノマーと相撲の融合戦略を使用して線維の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学ぶ、His-SUMO融合タグを用いたタグフリーHuntingtinエクソン1モノマーと線維の生成法。逆相HPLCとUPLCによる精製で高純度を達成し、凝集傾向タンパク質の構造・機能研究に応用可能な再現性の高いプロトコルを提供します。

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この作品 CHDI 財団やスイスの全米科学財団からの補助金によって主に資金を供給されました。ありがとう博士ソフィー Vieweg 有益な議論この新しい表現システムの開発と Lashuel グループの他のメンバーの間にこの式システムと彼らの経験を共有するため、その入力、貴重なフィードバック。我々 はまた、ULP1 プラスミドを提供する教授オリバー Hantschel を感謝します。著者原稿の批判的検討の博士ジョン B. ワーナーと博士 Senthil K. Thangaraj に感謝します。

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<li>Sathasivam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+splicing+of+HTT+generates+the+pathogenic+exon+1+protein+in+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aberrant splicing of HTT generates the pathogenic exon 1 protein in Huntington disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (6), 2366-2370 (2013).</li>
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<li>El-Daher, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+proteolysis+releases+non-polyQ+fragments+that+cause+toxicity+through+dynamin+1+dysregulation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Huntingtin proteolysis releases non-polyQ fragments that cause toxicity through dynamin 1 dysregulation.</a> EMBO Journal. 34 (17), 2255-2271 (2015).</li>
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<li>Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Intein-based+Strategy+for+the+Production+of+Tag-free+Huntingtin+Exon+1+Proteins+Enables+New+Insights+into+the+Polyglutamine+Dependence+of+Httex1+Aggregation+and+Fibril+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An Intein-based Strategy for the Production of Tag-free Huntingtin Exon 1 Proteins Enables New Insights into the Polyglutamine Dependence of Httex1 Aggregation and Fibril Formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).</li>
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<li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+polyglutamine-containing+huntingtin+fragments+into+amyloid-like+fibrils%3A+implications+for+Huntington%27s+disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).</li>
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<li>Tam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chaperonin+TRiC+blocks+a+huntingtin+sequence+element+that+promotes+the+conformational+switch+to+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The chaperonin TRiC blocks a huntingtin sequence element that promotes the conformational switch to aggregation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1279-1285 (2009).</li>
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著者は、この記事の内容との利害があるないことを宣言します。

このプロトコルでタグなしのネイティブの取得ミリグラム量 Httex1 のための効率的な手順を概説した我々 23 または 43 のグルタミン残基を含みます。これは彼に C 末端融合として Httex1 を表現することによって達成された6-相撲タグ IMAC で細胞ライセートから融合タンパク質を分離する使用され、Httex1 の高速液体クロマトグラフィー精製前に切断します。相撲戦略は、いくつかの他のタンパク質の生産に使用されている、提案手法が、相撲を使用して本質的に生成することもできるユニークな特性を狂わせたら、集計が発生しやすいので、以前に証明しているアミロイド蛋白質表示されます。処理し、43,44を作り出す非常に困難。「行儀」タンパク質の生成は、わかりやすい、使いやすいプロトコルに匹敵するプロトコルを提案します。相撲可溶性し、式と IMAC の精製ステップ中に Httex1 を安定化します。タグ、インテイン戦略10集計と観察の時期尚早胸の谷間は、もはや問題なかった。
天然変性タンパク質は劣化に対して特に脆弱です。N17 地域の N 末端の劣化は、このプロトコルを使用して問題ではない、間 Httex1 PRD で切り捨てが発生します。切り捨てられた蛋白質が疎水性、料金、サイズ Httex1 に非常に類似している挑戦は、クロマト グラフの手段によってそれらを削除する、従ってそれは最初の場所でそれらの形成を防ぐために最善。プロトコルに密接にこだわり、常に氷に取り組んで、プロテアーゼ阻害剤の十分な量を使用して保つ必要がある観察打ち切りレベル非常に低い。Httex1 の C 末端融合タグを適用するので、削除でした切り捨て PRD の簡単に切り捨てられたタンパク質親和性タグも失うことになります。ただし、ネイティブのシーケンスは Httex1 終了プロリンと我々 の知る限り、このオプションは適用できませんを維持する必要がある場合、プロリン後痕跡を残さないと効率的な胸の谷間を誘導するために知られている C 末端融合タグがないです。
プロトコルの最も重要な部分は、解放後の相撲タグの胸の谷間 ULP1 によって Httex1 の処理です。タンパク質は、クロマトグラフィーによってすぐに浄化する必要があります。幸いなことに、これは通常 4 ° C で 10-20 分で完了する効率的かつ高速反応です。対照的に、インテイン戦略は不完全な胸の谷間と始まり集約トレードオフ収量を最大化するために必要となる、インテインの完全な胸の谷間にいくつかの時間を必要です。高速精密検査は、それが開始されます Httex1、突然変異体に必要な 23Q バリアントは、長い時間安定したに対し、開裂反応に比較的高濃度で集計します。クロマトグラフィー精製中に相撲の別の利点が明らかになります: Ssp DnaB インテインは疎水性カラムに強く棒、相撲は親水性と C4 逆相カラムから完全に示しています。商業 ULP1 は非常に高価ですが、タンパク質は、次の以前に発行されたプロトコル29高収率で簡単に製作可能します。
Httex1 を使用する前に分解のプロトコルを適用することの重要性をすることはできません十分に強調します。Httex1 のような凍結乾燥 polyQ 蛋白質が安定しているストアドの長い期間にすることができます、水やバッファーに完全に溶け合うことはありません。前もって形成されたオリゴマーや繊維の存在は、凝集速度とタンパク質45の生物物理特性に大きな影響を与える可能性があります。ここで説明した分解プロトコルでは、タンパク質の分解、前もって形成された集合体の除去と凍結乾燥のサンプルから単量体 Httex1 のソリューションの生成をことができます。相撲とインテイン戦略で得られた Httex1 の同様の集計速度と線維の形態を観察した.
Httex1 を生産する以前の方法と比較して、ここで説明した相撲戦略は、いくつかの利点を提供しています、構造を調査するための可能な研究の範囲と健康と病気のこの蛋白質の機能特性を拡大します。相撲 Httex1 融合タンパク質は扱いやすい、冷凍し、保存または周囲温度で 24 h のためのソリューション内に保持、無料の mHttex1 はすぐに集計できます。安定性と相撲 Httex1 融合タンパク質の高溶解性タンパク質を操作および/またはそれ以外の場合は不可能な胸の谷間の後 mHttex1 に酵素と化学の変更を導入するより大きい柔軟性を提供します。これは導入を含むポスト翻訳の修正、fluorophores が付いて、スピン ラベル、ビオチン タグ等紹介進歩すべき 1) Httex1; の構造-機能相関の解明に今後調査を促進します。2) Htt の集約と病理が広がっている; を調査するための新しいツールを生成します。3) 突然変異体 Httex1 の安定化し、その集計を防止する分子を同定する方法を新しいの開発を有効にします。・ 4) このタンパク質上で動作し、ハンティントンの病気のための治療法を見つけるに当社のクエストに参加させる他の分野から科学者を奨励します。

Htt は 348 kDa タンパク質であり、いくつかの生理学的機能1に関与しています。Htt 以上 36 N 末端残基の拡張 polyQ 地域を含む、HD2,3が発生します。HD の病理学は、線条体、大脳皮質神経細胞死や影響を受ける組織4、5の萎縮につながる細胞介在物によって特徴付けられます。PolyQ 繰り返し管を含むいくつかの N 末端 Htt フラグメントは HD 患者の死後脳で検出され、huntingtin 蛋白質6のプロテアーゼによるプロセシングによって生成されると考えられています。最近の研究は、Httex1 が異常 mRNA スプライシングにより形成されることもお勧めします。病理学的 polyQ 変異を含み、動物の過剰発現 HD7、従って HD 病理と病の進行で6、このフラグメントの可能性の中心的役割を強調表示の主要な機能の多くを要約することができます Httex1 8,9。
高集計性向変異体 Httex1 (mHttex1) 拡張 polyQ 管と、ため既存式システムの大半はタンパク質 Httex1 の一時的な融合に基づいています (グルタチオン-S-トランスフェラーゼ (GST)、チオレドキシン (TRX) などやマルトース結合タンパク質 (MBP) やその表現、安定性、浄化および溶解度10、11,12,13,14 を向上させる特異的ペプチド (ポリ ヒスチジン) ,,1516,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,,2728。フュージョン パートナー、プロテアーゼ トリプシンなどの胸の谷間サイトを含む短いシーケンスと Httex1 にリンクして、タバコ etch ウイルス (TEV) プロテアーゼまたは胸の谷間と集計の開始前に Httex1 のリリースを許可する PreScission または浄化。これらのメソッドの欠点は、痕跡を残さない非胸の谷間のため追加残基と不完全な胸の谷間 (のための不均一性に加え Httex1 のシーケンス内での miscleavage により切り捨てられたフラグメントの作成を残しての可能性Viewegらの利点と制限事項このアプローチの詳細についてを参照してください)10.これらの制限に対処するため、我々 は最近コンストラクトの一時的な N 末端融合を用いた初めてのネイティブ タグ無料 Httex1 の生成を有効にする表現戦略を開発(Ssp)Httex110DnaB インテイン。インテイン胸の谷間は痕跡を残さないと特定蛋白質の mg 量が得られます、それまだ収量を減らすことができる 2 つの欠点に苦しむ: 式とで胸の谷間が発生するという事実の間に起こることができるインテインのすなわち、早すぎる胸の谷間特に拡張 polyQ 繰り返しで Httex1 の凝集による蛋白質の損失につながる可能性がいくつかの時間。
これらの制限に対処するため、ネイティブの生産のための我々 の戦略を絞り込むことに、相撲、Httex1 に酵母ホモログ Smt3 もっと丁度の一時的な融合に基づく新しい式システムを開発私たちタグ無料 Httex1。組換え蛋白質の生産のため相撲システムのアプリケーション 2004年29式の増加率と相撲融合タンパク質の溶解度を示した発表されました。相撲タグはユビキチン様タンパク質特定プロテアーゼ 1 (ULP1)、認識サイトを必要としないが、相撲の三次構造を認識し、miscleavage30の可能性を実質的に排除を切断することができます。さらに、ULP1 を介した胸の谷間は高速であり、痕跡を残さないと追加残余を残すありません。融合タグの早すぎる胸の谷間10自触媒インテインと完全に外部プロテアーゼの要件から敬遠です。相撲戦略は組換えタンパク質生産31,32,33で広く使用されますが、我々 は、不調である本質的の生成のために特に便利だ本稿で示すHttex1 のような集計が発生しやすいので、アミロイド蛋白質。シンプルさ、効率、相撲 fusion ベース手法の信頼性がネイティブなタグ無料 Httex1 をさまざまな分野からの研究者によりアクセスして Httex1の in vitroのネイティブでないシーケンスを使用する必要があることと考えています.これは、Httex1 の構造機能相関の解明に今後研究を容易にする重要な前進です。
プロトコルは細菌文化、12 L から Httex1 の浄化を記述が、プロトコルが小さいまたは大きいスケールの生産のため簡単に合わせることができます。プロトコル (23Q) 下 polyQ リピート長変異体 Httex1 と野生型 Httex1 (wtHttex1) の生産を説明します (mHttex1)、polyQ を繰り返します (43 q) 上の長さ (36Q) の病原性のしきい値。

<table><tbody><tr><td>ギ酸ウラニル (UO2(CHO2)2)</td><td>EMS</td><td>22450</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids</td><td>EMS</td><td>FCF200-Cu-50</td><td></td></tr><tr><td>High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL Hellma Analytics</td><td></td><td>110-1-40</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Substance Dulbecco's (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td><td>Witech</td><td>SVA4730203</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>AxonLab</td><td>A0839.0100</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth (Miller's LB Broth)</td><td>&nbsp;Chemie Brunschwig</td><td>1551.05</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル &beta;-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)</td><td>AxonLab</td><td>A1008.0025</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌 B ER2566</td><td>NEB</td><td>NEB# E4130</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma</td><td>56750-500G</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete&nbsp;プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>ロシュ</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>抗ハンチンチン抗体、a.a. 1-82</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MAB5492</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD ヤギ抗マウスIgG(H + L)</td><td>Licor</td><td>925-68070</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>AxonLab</td><td>A0999.0005</td><td></td></tr><tr><td>HisPrep 16/10 column&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28936551</td><td></td></tr><tr><td>C4 HPLC カラム</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4168.P0</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;10 &micro;m C4 300 &Aring;, LC カラム 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm ガードカラム, 温度ジャケットなし</td></tr><tr><td>アセトニトリル HPLC</td><td>MachereyNagel</td><td>C2502</td><td></td></tr><tr><td>Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile</td><td>Sarstedt AG</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計 セミマイクロキュベット</td><td>Reactolab S.A.</td><td>2534</td><td></td></tr><tr><td>Superloop、1/16インチフィッティング(&Auml;KTAdesign)、50 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>18111382</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7.160 102</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;100 kDマイクロコン&nbsp;高速フローフィルター</td><td>メルクミリポアコーポレーション</td><td>MRCF0R100</td><td></td></tr><tr><td>Vibra-cell VCX130超音波液体プロセッサ</td><td>Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml;KTA 900 フラクションコレクターを装備&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasco J-815 Circular Dichroism</td><td>Jasco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters UPLCシステム&nbsp;</td><td>Waters</td><td></td><td>C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 μm カラム&nbsp; 、予熱カラム (40 °;C)、流速0.6 mL/分、注入量4 &mu;L</td></tr><tr><td>waters HPLC システム</td><td>Waters</td><td></td><td>2489 UV 検出器および 2535 クオータナリーグラジエントモジュール、FlexInject ハウジング内の 20 mL ループ</td></tr><tr><td>ESI-MS: Finnigan LTQ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ック リオフィライザー装置</td><td>FreeZone 2.5 Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai Spirit BioTWIN&nbsp;</td><td>LaB6 gun と 4K x 4K FEI Eagle CCD カメラ (FEI) を装備し、80 kV</td>37 °C で動作する <td>FEI</td><td></td> 電子顕微鏡</tr><tr><td>。C振れ&nbsp;インキュベーター</td><td>Infors HT multitron Standard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biophotometer plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ネイティブ、タグなしの huntingtin exon1 モノマーと相撲の融合戦略を使用して線維の生成

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

ハンチントン病 (HD) CAG 拡張 (≥36) によって引き起こされる継承された致命的な神経変性疾患 HD 遺伝子の最初のエクソンの Huntingtin 蛋白質 (Htt) の式の結果、N 末端フラグメントそのポリグルタミン (polyQ) ストレッチ。
Huntingtin 蛋白質 (Httex1) の exon1 携帯で HD の機能の多くを繰り返す最小 Htt フラグメント、動物モデル、Htt の最も広く研究の断片の一つ。Httex1 の小型サイズになります実験生物物理特性より長いフラグメントまたはフルレングス Htt と比較して標準的な高解像度技術を使用してに従う義務があります。ただし、高凝集傾向変異体 Httex1 の (mHttex1) 増加 polyQ コンテンツ (≥42) で困難になっている効率的な式と十分な量のこれらの蛋白質を生産し、それらをアクセシブルにする浄水システムを開発するには融合蛋白質や蛋白質のネイティブのシーケンスを変更するその他の戦略を使用せずさまざまな分野からの科学者。堅牢かつ最適化されたメソッドをここで提案するネイティブのミリグラム単位の微量の生産のためタグ-無料 Httex1 小さなユビキチン関連修飾子 (相撲) の一時的な融合に基づきます。シンプルさと戦略の効率、Httex1、従ってこのタンパク質を研究者をよりアクセシブルにして異なる研究室の実験の再現性を向上のネイティブでないシーケンスを使用する必要はありません。これらの進歩も Htt と同様新規診断ツールの開発と治療治療または HD の進行を遅らせるの構造機能相関の解明を目指した今後の研究を容易にすることと考えています。

Httex1 は N ターミナルを持つ大腸菌で表される彼の6-相撲タグ。式および融合タンパク質の精製の代表の結果を図 1にまとめます。Met1 だ完全に裂かれた生体内で42Htt と Ala2、始まる 2 90 残基の Httex1 のシーケンスで構成されます。23Q バリアントは、アミノ酸の番号、図 1Aに表現された融合タンパク質の完全なシーケンスを示します。プラスミッドはコミュニティと共有する近い将来 Addgene に入金されます。プラスミッドおよび表現された融合タンパク質の概略図を図 1Bに示します。His6 相撲 Httex1 を中レベル (図 1C) 表現し、融合タンパク質のほとんどは、溶解、両方、23Q、43 q バリアントの後可溶性画分に存在です。融合タンパク質が予想よりも高い分子量に基づいて移行されます。これは相撲の強い倍もあって、たいがいは主にグルタミン、プロリン残基を含む Httex1 の異常なシーケンス構成。(23Q) 野生型と変異体 (43 q) 融合タンパク質濃縮 IMAC (図 1D) 共同ホスト蛋白質の浄化の存在が Httex1 と大きなサンプルの比較的低い発現レベルによって説明できる 〜 80% の純度にボリュームを列に適用します。
彼の胸の谷間6-相撲タグと Httex1 の精製を図 2Aに示します。高精度は、彼の胸の谷間を監視するための効率的なツール6-相撲タグ (図 2B)。融合蛋白質の元のピークが消費されると、彼に対応する 2 つの新しいと十分に分離ピーク6-相撲タグと Httex1 が表示されます。胸の谷間の反応は、10 〜 20 分に仕上がっています。西部のしみ (WB) が開裂反応を効率的に監視するには遅すぎるが、参考のため、相撲胸の谷間の完全性を示すための図に含まれています。両方の Httex1 23Q と 43 q は、彼からも分けることができます6-相撲クロマトグラフィー (図 2C) でタグを付けるし、高精度、MS、SDS-PAGE 分析 (図 2D) に示すように、高純度で得られました。
この法により作製した Httex1 蛋白質は Httex1 の予想集計プロパティを保持、沈降法による変異 Httex1 37 ° C の線維化動態を評価したことを説明するために CD による二次構造の変化を監視分光学、TEM による骨材の形態を特徴とします。MHttex1 線維形成沈降分析により凝集速度の代表的なデータ セットを図 3に示します。線維を形成するため、時間をかけて 43 q が高精度で, 定量化した水溶性の Httex1 の損失。培養 48 時間後の可溶性タンパク質の完全な枯渇を遵守します。さらに、CD 分光法 (図 3B) によるタンパク質の二次構造を決定します。構造化されていないから Httex1 43 q シフト (λmin 205 nm) 培養 48 時間後主に β シート豊富な立体配座 (λmin 215 nm) します。この構造変化は、48 時間 (図 3C) で TEM による観測として長い繊維集合体の形成を伴っている.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> 図 1.彼の発現と精製6-相撲 Httex1 融合タンパク質。  (A) 彼のアミノ酸シーケンス6-相撲-Httex1-QN融合コンストラクト (彼の6-緑色で相撲とオレンジの Httex1 QN );(B)発現と融合タンパク質の精製の図式的な概観(C) 式および換散; 後融合蛋白質の溶解度の SDS-PAGE 解析融合タンパク質の IMAC の精製と SDS-PAGE による端数の解析 (D) クロマト グラム (赤いバー: 非連結の割合、青いバー: 洗浄分数、黒いバー: 溶出ピークを含む画分);<a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> 図 2.彼の胸の谷間6相撲タグとタグ無料 Httex1 QN蛋白質の浄化。 (A) 図式的な概観;(B) による高精度で ULP1 と相撲タグの胸の谷間 (青: ULP1; 添加前に黒: 20 分 (23Q)、ULP1 の付加の後でそれぞれ 10 分 (43 q)) と WB (MAB5492 集、二次ヤギ抗マウス抗体 1: 5000)Httex1; 分取クロマトグラフィー精製の (C) のクロマト グラムD: 解析、高精度で浄化された Httex1 の SDS-PAGE と MS;予想される分子量はそれぞれ 9943 Da (23Q) と 12506 Da (43 q です)。<a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> 図 3.Httex1-43 q の集計:高精度に基づく (A) 沈降分析。(B) 0 h と 48 時間の集計の 48 h. (C) TEM 顕微鏡写真で二次構造の CD スペクトル (スケール バーは、200 nm)。<a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

ここでは、ネイティブなタグ無料モノマーのミリグラム量と小さなユビキチン関連修飾子 (相撲) の一時的な融合に基づくハンチンチン蛋白質 (Httex1) の exon1 の線維の生産のための堅牢な最適化されたプロトコルを提案する.

ネイティブ、タグなしの Huntingtin Exon1 モノマーと相撲の融合戦略を使用して線維の生成

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

この方法により、タンパク質の天然配列を持つタグフリーのエクソン1を作製することができ、このタンパク質の構造機能を研究する新たな機会を提供し、健康や疾患におけるその機能を理解することができます。ここでの主な利点は、メソッドのシンプルさ、効率性、堅牢性です。この方法は、配列の不均一性を排除することにより、異なるラボ間での比較と再現性を可能にし、促進します。この方法はハンチンチンエクソン1の産生のために開発されましたが、アミロイドベータペプチドやα-シヌクレインなどの他の凝集しやすいシステムにも適用できます。まず、0.45μmシリンジフィルターを使用して、His-SUMO Huntingtinのエクソン1融合タンパク質を含む以前に分離された上清をろ過します。ろ過された上清の20マイクロリットルのサンプルをSDS-PAGE分析のために取り出します。清澄化したライセートをスーパーループに充填します。His-SUMO Huntingtin one 融合タンパク質を、4°Cの高速液体クロマトグラフィーシステム上で固定化金属親和性クロマトグラフィーにより、清澄化された細菌溶解物から単離します。10カラム容量または200ミリリットルのバッファーAを毎分10ミリリットルで通過させ、未結合のタンパク質を洗い流します。2.5カラム容量または50ミリリットルの100%バッファーBで、毎分2ミリリットルで融合タンパク質を溶出します。SDS-PAGE分析のために各画分を20マイクロリットル取ります。各サンプルに20マイクロリットルのローディング染料を加えます。2マイクロリットルの粗タンパク質、非結合画分、洗浄画分、および溶出ピークの各画分を15%ゲルにロードします。ゲルを180ボルトで90分間泳がせます。ランが終了したら、製造元の指示に従って、ゲルをCoomassie染料で染色します。融合タンパク質を含む画分をクロマトグラムのピークに従ってプールします。次に、プールした画分に100ミリモルのDTTと100ミリモルのL-システインを加え、チューブを静かに反転させて溶解します。HPLC精製用の溶媒Aを調製するには、2リットルのボトル入り飲料水に2ミリリットルのトリフルオロ酢酸を加えます。溶媒Bを調製するには、2.5リットルのアセトニトリルボトルに2.5ミリリットルのトリフルオロ酢酸を追加します。.メーカーの指示に従ってHPLCシステムを準備します。ブランクランを実行して、カラムがクリーンであることを確認します。その後、ULP1を添加する前に100マイクロリットルの融合タンパク質を採取し、UPLCによる切断反応をモニターします。20ミリリットルの融合タンパク質を新しい50ミリリットルのチューブに移し、0.4ミリリットルのULP1ストック溶液を追加します。サンプルを氷上でインキュベートし、残りの融合タンパク質を氷上に保ちます。中間工程ではタンパク質を保存せず、精製が完了するまで進めてください。10分ごとに100マイクロリットルの切断反応を取り出して、UPLCの進行をモニタリングします。サンプルを遠心分離した後、各上清の2マイクロリットルをUPLCで分析します。ULP1 を添加する前のサンプルと添加後に採取したサンプルについて、得られたクロマトグラムを比較します。SUMOの切断が完了したら、22μmのシリンジフィルターでサンプルをろ過します。次に、ろ過したサンプルを逆相HPLCで精製します。UPLCおよびESI-MSによるHPLCフラクションの分析50ミリリットルのプラスチックチューブに同様の純度のフラクションをプールします。サンプルを液体窒素で凍結し、凍結乾燥します。次に、凍結乾燥したタンパク質を2ミリリットルのプラスチックチューブに移し、摂氏マイナス20度で保存します。凍結乾燥されたハンチンチンエクソン100マイクログラムを、1.5ミリリットルのチューブ内のニートリフルオロ酢酸8マイクロリットルに1つずつ溶解します。室温で20分間インキュベートした後、窒素またはアルゴンの流れとともにヒュームフードの下でトリフルオロ酢酸を慎重に蒸発させます。タンパク質が乾いたら、100マイクロリットルの水に溶かします。次に、2マイクロリットルのサンプルをUPLCで分析します。次に、20マイクロリットルのタンパク質溶液と20マイクロリットルの2Xローディング色素を混合します。1〜10μgのタンパク質サンプルをSDS-PAGEで分析します。ゲルを180ボルトで90分間泳がせます。ランが終了したら、製造元の指示に従って、ゲルをCoomassie染料で染色します。50ミリリットルのチューブに10ミリリットルのDPBSを準備します。DPBS溶液は、使用前に2マイクロメートルのフィルターでろ過してください。これに続いて、凍結乾燥されたハンチンチンエクソン150マイクロリットルを1.5ミリメートルチューブ内の12マイクロリットルのニートリフルオロ酢酸に1つずつ溶解します。室温で20分間インキュベートした後、窒素またはアルゴンの流れとともにドラフト内でトリフルオロ酢酸を慎重に蒸発させます。細分化されたタンパク質を予冷したDPBSの1ミリリットルに溶解し、1モルの水酸化ナトリウムでpHを7.2〜7.4に調整します。次に、タンパク質溶液を100キロダルトンの遠心フィルターで1.5ミリリットルのプラスチックチューブにろ過します。アミノ酸分析検出に基づくUPLC検量線を用いて、Huntingtinのエクソン1の濃度を測定します。次に、3マイクロモルのハンチンチンエクソン1の濃度を得るために添加する必要があるDPBSの量を計算します。計算された量のDPBSを試験管に加えることにより、タンパク質を3マイクロモルに希釈します。アグリゲーションプロトコルが開始されるまで、チューブを氷上に保ちます。ディスアグリゲーションプロトコルが事前に形成された凝集体の除去に成功したことを検証するために、電気顕微鏡法およびその他の技術による検証を実施する必要があります。発現した融合タンパク質の完全なアミノ酸配列をここに示します。ここには、プラスミドと発現した融合タンパク質の概略図を示します。His-SUMO Huntingtinのエクソン1は中程度レベルで発現し、融合タンパク質の大部分は溶解後の可溶性画分に存在し、23グルタミンと43グルタミンの両方の変異体について存在します。野生型および変異型融合タンパク質は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより、約80%の純度まで濃縮することができます。His-SUMOタグの切断とハンチンチンエクソン1の精製を示します。元の融合タンパク質のピークが消費され、His-SUMOタグとHuntingtinエクソン1に対応する2つの新しく分離されたピークが現れます。ハンチンチンエクソン 1 23 グルタミンと 43 グルタミンはどちらも、逆相 HPLC によって His-SUMO タグから分離でき、UPLC、MS、および SDS-PAGE 分析で示されるように高純度で得られました。沈降アッセイによって決定されたm-Huntingtinエクソン1フィブリル形成の凝集速度は、インキュベーションの48時間後に可溶性タンパク質が完全に枯渇することを示しています。タンパク質の二次構造のCD分光法は、ハンチンチンエクソン1 43グルタミンの非構造化からβシートリッチコンフォメーションへのシフトを示しています。この構造変化は、TEMによって観察されるように、長い繊維状凝集体の形成を伴います。このハンチンチンエクソン1の発現と精製の方法は、一度習得すれば、適切に実施すれば3日で実施できます。この手順を試みる際には、ハンチンチンエクソン1タンパク質、特にポリグルタミン伸張が拡大したタンパク質は、凝集する傾向が非常に高いことを覚えておくことが非常に重要です。この方法により、十分な量のハンチンチンエクソンワンタンパク質を作製し、これまでアクセスできなかった研究を実施して、タンパク質の構造、凝集、毒性を調査し、ハンチンチンエクソンワンの疾患関連型を検出および定量するための新しいアッセイを開発することができます。SUMO融合タンパク質の安定性と高い溶解性は、タンパク質の操作における柔軟性を高め、切断後には不可能であった融合タンパク質の状況下での修飾の導入を可能にします。この方法の簡便さと効率性により、非天然の配列やモデルシステムを使用する必要がなくなり、さまざまな分野の研究者がこの重要なタンパク質の生物学を理解し、ハンチントン病の治療に効果的な治療法を開発するための探求に参加するようになることを願っています。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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ネイティブ、タグなしの Huntingtin Exon1 モノマーと相撲の融合戦略を使用して線維の生成

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