マイル アッセイで皮膚の血管の血管誘導剤の評価

この手順の全体的な目標は、浸透促進剤の皮内注射によって誘発されるマウス真皮の血管漏出を測定することです。この手順は、どの分子が血管漏出を刺激または阻害できるか、関与するシグナル伝達経路は何かなど、in vivoでの血管透過性の調節に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順の主な利点は、迅速で比較的簡単であり、主に一般的な実験室の試薬と材料を使用することです。

この技術の意味は、病理学的浮腫を伴う疾患の治療にまで及びます。特に、研究者はこのアッセイを使用して、新規の分子標的を特定し、血管透過性を阻害する関連薬物の能力を比較的迅速かつ簡単な方法でテストできます。ヒスタミン阻害剤マレイン酸ピリラミンとエバンスブルー染料の別々の溶液を0.9%生理食塩水溶液で調製します。.

次に、層流キャビネットで作業し、0.22マイクロメートルのフィルターを通過して溶液を滅菌します。2つの溶液を別々の1ミリリットルシリンジに30ゲージの針を取り付けてロードします。次に、マウスをだらしげにします。

次に、頭が地面に向けられ、腹部が上を向くようにマウスを傾けます。マウスを位置決めした後、腹腔内注射により体重1グラムあたり10マイクロリットルのマレイン酸ピリラミン溶液を投与します。次に、血管拡張を促進するために、マウスを摂氏37度の熱室に10分間置きます。

次に、マウスをマウス拘束装置に移動します。次に、尾部を70%エタノールでこすり、さらに血管拡張を行います。100マイクロリットルのEvans Blue Dye溶液を尾静脈から静脈内投与します。.

出血を防ぐために、指と親指の間にテールをすばやく保持し、注射部位に圧力をかけます。マウスの尾静脈へのEvans Blue Dyeの静脈内注射は、この手順の中で困難で重要なステップです。したがって、研究者は、残りの手順に進む前に、この注射を実行する能力があることが不可欠です。

コンピテンシーを確立するには、事前の練習が必要です。リン酸緩衝生理食塩水の滅菌溶液を使用して、用量の最終容量が20マイクロリットルになるようにVEGF試薬を希釈します。次に、VEGF透過性誘導試薬とビヒクルコントロールを、31ゲージの針が取り付けられた2つの別々の300マイクロリットルシリンジにロードします。

針を皮膚に対して15度の角度に保ち、マウスの側面に20マイクロリットルのVEGFを皮内に注入します。皮膚内の隆起した気泡を見つけて、注入が成功したことを確認します。少なくとも1センチメートル離れた2つの追加部位で皮内注射を行います。

次に、マウスを回して2番目の側面を露出させ、ビヒクル溶液で3回の注入を繰り返します。各注入部位の記録と、注入手順が終了した時間を記録します。次に、マウスをホームケージに移します。

マウスが意識を取り戻し、ケージの周りを動き始めるまで、マウスを監視し続けます。マウスを呼び出す前に、VEGFソリューションを20分間動作させます。この段階で、同じ手順に従って、すべてのマウスにVEGFAとビヒクルを順次注入します。

20分後、安楽死させた各マウスを仰向けに置き、清潔なティッシュで包まれたコルクボードに足を固定します。次に、鈍いハサミの助けを借りて、死んだマウスの下腹部から胸部まで3〜4センチメートルの長さの垂直切開を行います。次に、鉗子とメスを使用して、脇腹の両側から皮膚をからかいます。

メスを使用して、漏れ部位の周辺に脂肪が存在する場合は脂肪を取り除きます。次に、鉗子とメスを使用して、漏れたエバンスブルーダイで皮膚領域を切除します。切除された皮膚領域は、同様のサイズである必要があります。

皮膚サンプルを1.5ミリリットルのチューブに移し、それに応じてラベルを付けます。開いたチューブをヒートブロックに一晩置いて、サンプルを乾燥させます。乾燥が完了したら、ヒュームフード内のサンプルに250マイクロリットルの脱イオンホルムアミドを加えます。

チューブの蓋を閉め、ヒートブロックに一晩置いて、エバンス染料を抽出します。ベンチトップ遠心分離機で10, 000 g以上でサンプルを40分間遠心分離します。遠心分離後、遠心分離したサンプルから各色素含有上清100マイクロリットルを、ドラフト内で動作する96ウェルプレートのウェルに移します。

分光光度計を使用してエバンスブルーの吸光度を読み取ります。VEGFによって誘発される血管漏出を研究するために、マウスに50ナノグラムのVEGFAをリン酸緩衝生理食塩水またはヒヒクルとしてリン酸緩衝生理食塩水のみに注射します。この画像は、VEGFA を注入した皮膚サンプル中の漏れた Evans Blue Dye の蓄積が、車両制御 in situ と比較して増加していることを示しています。

この96ウェルプレート画像は、皮膚サンプルからホルムアミドで抽出されたロードされたEvans Blue Dyeを示しています。このグラフィカル プロットは、ペアになった VEGFA とビヒクルのみのコントロール サンプルの正規化された吸光度値を示しています。プロットは、50ナノグラムのVEGFAを注入すると、車両のみと比較してEvans Dyeの漏れが大幅に増加することを示しています。

このグラフは、VEGFAと車両サンプルの光学密度の倍率変化を定量化した後に取得されます。このプロットは、VEGFA を投与した後の血管漏出が、ビヒクルのみと比較して平均 3 倍に増加したことを示しています。一度習得すると、このテクニックの主要な部分は、適切に実行すれば2時間で完了できます。

この手順を実行する際には、非特異的な血管漏出とマウス間の変動を説明するために、薬剤誘発性血管漏出をビヒクル誘発血管漏出に正規化することが重要です。この手順は、薬物投与などの他の方法と組み合わせて、タンパク質を標的にして血管透過性を阻害できるかどうかなどの質問に答えることができます。この技術は、その開発後、血管生物学の分野の研究者が遺伝子改変マウスの血管過透過性の分子メカニズムを探求し、血管漏出に必要な主要なシグナル伝達成分を特定する道を開きました。

このビデオを見れば、マウスの真皮の血管漏出を誘発し、測定する方法を十分に理解できるはずです。