Name: マイル アッセイで皮膚の血管の血管誘導剤の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学ぶマウス皮膚の血管漏出測定法。浸透性促進剤を用いて血管透過性を評価し、疾患治療の分子標的を特定する。Evans Blue Dyeと分光光度計で定量化する簡便な手法です。

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我々 は感謝ローラ Denti、ヴァレンティーナなガール フレンドとの UCL 眼科研究所で生物資源部スタッフは、テクニカル サポートのマウス飼育とカミーユ Charoy ヘルプします。この作品は、c. Ruhrberg、j. t. ブラッシュ (FS/13/59/30649) に英国心臓財団博士課程学生の身分 (氏/N011511/1) 医学研究評議会の助成金によって支えられました。

すべての動物の仕事は英国ホーム オフィスと機関の動物福祉・倫理的なレビューの体 (AWERB) のガイドラインに従って実施されました。
1. マウス作製
注: は、生後 6 ヶ月にまで少なくとも 8 週齢、成体マウスの実験を実行します。技術の再現性と一貫性のあるタイミングの異なる動物間この手順の各ステップを示すために実験的セッションごとに 2 の最小値と最大 6 匹のマウスを使用します。遺伝子組み換えマウスで透過性を誘発する物質の突然変異の効果の評価、理想的には、2 の変異マウスと実験あたり 2 濾胞を使用します。
<ol><li>24 時間刺激的な血管血管前の適切な吸入麻酔薬イソフルランなどを用いたマウスを麻酔します。立ち直り反射が失われ、マウスが外部刺激に応答するまで、麻酔導入の 3% イソフルランを使用します。麻酔維持のため 1.5% イソフルランを使用 (マウスが一定の呼吸数であることを確認)。麻酔下で慎重に、電気シェーバー、皮膚への傷害を避けることを各マウスの両翼を剃る。 注: 動物にストレスの原因を避けるために、皮膚損傷の結果可能性がありますシェービング中の動きを最小限に抑えるため、麻酔が使用されます。</li>
	<li>坊主のマウスをその家のケージに戻ります。雄マウスの各男性に個々 のケージにしないように麻酔回復後配置の戦いと、そのため、皮膚を損傷します。雌マウスのグループの彼らの家のケージに戻します。 注: 場合ケージの雄マウスの間に戦闘の現象は、施術前に区切ります個々 のケージに癒すために皮膚損傷の可能性を許可する実験の前に 3 日間。</li>
	<li>までは (通常数秒) 内で意識を回復し、(通常は 1 分) 内のケージの周りを移動、マウスを監視します。</li>
</ol>2. 静脈内注射・ エヴァンスの青い色素
<ol><li>流キャビネットでヒスタミン阻害剤ピリラミン マレイン酸 (4 μ g/μ L で 0.9% 生理食塩水) ・ エバンス ブルー色素 (1% 0.9% 生理食塩水の w/v) 個別に滅菌ソリューションを準備します。22 μ m フィルターを通して解決策を渡すことによって殺菌しなさい。</li>
	<li>30 G の針で 10 μ L ピリラミン マレイン酸ソリューション/グラムの体重 (図 1 a) それぞれのマウス腹腔内注入するのに滅菌 1 mL 注射器を使用します。注入、最初、首筋、マウスを行い、地面に向かって頭を監督し、腹部が上向きに指示される、それを傾けます。膀胱にぶつからないように正中線から腹部のより低い象限儀で注入します。 注: 8 週と生後 6 ヶ月の間のマウスの重量通常範囲は 15 と 30 g. ピリラミン マレイン酸が放出を阻害するテストするエージェントとは関係なく血管漏れを促進するそれ以外の場合、内因性のヒスタミンの。</li>
	<li>血管拡張を促進するために 10 分の 37 ° C の熱チャンバー内でマウスを配置します。また、熱ランプの使用はローカル倫理的なガイドラインによって許可されている場合は、血管拡張を促進するために、しっぽに焦点を当てた適切な熱ランプを使用します。</li>
	<li>マウス落に一度に 1 つのマウスを移動して 70% エタノール注入領域をきれいにし、血管拡張を促進する尾をこする。</li>
	<li>1 mL の滅菌注射器 30 G 針を使用して、100 μ L を管理 (図 1 b) の尾静脈を介して静脈内エバンス ブルー色素。すぐに出血を防ぐために親指と指尾を保持することによって、注射部位に圧力を適用します。 注: 尾静脈の可視化は、注入領域にひを向けることによって改善できます。マウス尾静脈に静脈注射の実行に関する詳細は、公開されているプロトコル18で見つけることが。</li>
	<li>30 分間循環する色素を許可します。</li>
</ol>3. 血管血管を刺激します。
<ol><li>20 μ L のボリュームで配信される最終的な投与ができる濃度に関心の透過性誘導剤を希釈滅菌ソリューションを使用すると、キャビネット層流。 注:図 1-図 2に示すように、pbs は、2.5 ng/μ L の濃度で血管の血管を刺激するために VEGFA を使用例実験で車両制御として使用されます 50 ng、および PBS の総線量を降伏します。</li>
	<li>31 G 針 2 別の 300 μ L の滅菌シリンジに関心と車両制御の透磁率を誘発するエージェントをロードします。それぞれのマウスに 3 通ソリューションの 20 μ L 注入する十分なソリューションを読み込む (すなわち針のデッド ボリュームを考慮するエージェントとマウス、プラス追加ボリュームあたりの車両の 60 μ L を準備)。</li>
	<li>イソフルラン (3% 麻酔導入立ち直り反射が失われ、マウスが外部刺激に応答するまで、マウスが一定の呼吸率を確かめる麻酔維持のため 1.5%) でテストする最初のマウスを麻酔します。</li>
	<li>掻きマウス (図 1) の側面に透過性促進剤の 20 μ L を注入します。針が、皮膚に対して 15 ° の角度であることを確認します。成功した注入を示す皮膚内で発生したバブルの形成を確認します。少なくとも 1 cm 離れて、2 追加サイトに皮内注射を繰り返します。</li>
	<li>第 2 側面を公開し制御車両ソリューションと帳票の注射を繰り返しますマウスをオンにします。皮膚のサンプルのそれに続くコレクションの識別を容易にするために各部位の位置を紙に記録します。 注: この段階で慎重にマウスの皮膚を処理します。たとえば、皮内注射の際の皮膚をつまんでは避けてください。</li>
	<li>その家のケージに注入されたマウスを戻り、それが (数秒) 内では通常意識を回復し、ケージの周りに移動するまでマウスを監視します。</li>
	<li>最初のマウスは、回復しながらすぐに手順 3.3 3.5 秒のマウス (までの六つのセッションごとに最大限にマウス).各マウスは、以降のステップに進むための時間を調整する注入した時の記録を残します。</li>
</ol>4. 真皮内で蓄積されたエバンス ブルーの定量化
<ol><li>マウスが注入された同じ順序を観察、皮内注射を受けた後、頚部転位 20 分で各マウスを処分します。 メモ: 血管漏れの期間使用すると、透水性誘導剤によって異なります、したがって、皮内注射と殺処分の間の時間を最適化するを必要があります。</li>
	<li>各場所は、その前後のクリーンな組織 (図 1) で包まれたコルク ボードに足ピンにマウスを抜粋しました。</li>
	<li>鋏は使いよう 】 を使用して、死んだマウスの胸まで下腹部から約 3-4 cm の縦切開を作る。メスと鉗子、真皮の内側とエバンス ブルー蓄積 (図 1E) のサイトを明らかにするための両方の側面から皮膚はいじめます。たるんだ皮膚をピンで止めるし、メスの漏れサイトの周りの地域から脂肪を除去します。必要な場合は、皮膚にエバンス ブルー漏れの大きさを示す代表的な写真を撮る。</li>
	<li>鉗子やメスを使用して、各サイトの流出・ エバンス ブルー色素を含む消費税皮膚領域は透過性誘導剤や車両を注入しました。 注意: 後続ステップ 4.7 ホルムアミド ボリュームの似ている部分が残りホルムアミドのようなボリュームで希釈する抽出された色素をできるように、各皮膚サンプルが吸着されること、ように皮膚の同様に大きさで分類された地域を消費税に世話します。.3.5 の手順で記録したインジェクション マップは、摘出するエリアを定義に役立ちます。</li>
	<li>1.5 mL チューブに各サンプルを配置し、それに応じて、ラベル付け、管の底にかかっている各サンプルを確かめます。さらに使用するまでの 20 ° C でサンプルを格納します。すぐに処理する場合以下の手順に従います。</li>
	<li>オーブンでまたは 55 ° C で加熱ブロックのウェルに開いてチューブを配置することによって、皮膚のサンプルを一晩乾燥します。</li>
	<li>エバンス ブルー色素を抽出、発煙のフードのサンプルを 250 μ L の脱イオン ホルムアミドを追加、チューブを閉じます。皮膚サンプル ホルムアミドすべて覆われてしまっています、オーブンまたは 55 ° C で加熱ブロックで一晩インキュベートを確認します。</li>
	<li>遠心分離機の最大速度でベンチトップ遠心分離機のサンプル (> 10,000 x g) 40 分。</li>
	<li>ヒューム フードの透明は、平底 96 ウェル プレート (図 2 a) の別のウェルに各サンプルから色素を含む上清の 100 μ L を転送します。</li>
	<li>メジャー ピーク 620 エバンス ブルー吸光度 740 のリファレンスを読む nm nm の分光光度計です。 注: 620 nm がピークのエバンス ブルーの吸光度、ながら 740 nm エバンス ブルーは吸収されない、参照波長を果たします。</li>
	<li>(図 2 b) 技術的な可変性を考慮して同じエージェントまたはマウスの各車両の帳票注射の吸光度の測定値の平均値します。</li>
	<li>対車両制御 (図 2) 透水性誘導剤からの測定値の倍の違いを計算します。</li>
</ol>

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</ol>

著者は宣言する利害の対立があります。

195217の最初の記述からマイル アッセイは血管の血管の分子機構を研究するため比較的、簡単、迅速かつ信頼性の高い方法で研究者を提供しています。たとえば、マイル アッセイは、したがって19,20,21を誘発するまたは血管ブロック エージェント8 の有効性をテストする能力や異なるエージェントの効力をテストする使用されています、22,23。別の例として血管透過性亢進を誘発するエージェントは、遺伝子改変マウス及び特定の受容体とシグナル伝達タンパク質リガンド誘導性の血管のための要件を決定する彼らの濾胞でテストされています。レスポンス10、11,12,13,14,15,20,23。マイルの試金のいくつかの変更されたバージョンはので、トレーサーの使用に関して、例えば使用されています。したがって、さまざまなサイズの微粒子11,13dextrans の蛍光標識といくつかの研究でエバンス ブルーを置き換えられます。
血管血管メカニズムを調査するため他のアッセイのマイル アッセイの主な利点はそれが比較的容易に行えるし、高価な機器を必要としません。さらに、そのまま血管のコンテキストでこのアッセイのモデルの血管漏れ、体内法を通して漏れを測定に関係なく体外試金のトランスもフラックス アッセイまたはトランス内皮電気抵抗 (のようTEER) アッセイは、内皮細胞の単層のみ、焦点します。したがって誘導剤の異なる配送ルートを活用してまたはのため別のサイトで血管漏れを分析することによって、ここで説明するマイル アッセイから血管血管の代替生体内で試金が異なる場合があります。続いて血管漏れ検査、肺や気管の11,13,15尾静脈を介してエージェントの全身投与による例です。マイルの試金の制限の 1 つは、します特定のエージェントの皮内注射、原則としても血圧と内皮バリアに加えてフローに影響も直接血管の透過性の影響をそのため。それにもかかわらず、この試金は最近による血管透過性を測定するため示されている VEGF の全身血圧15に及ぼす影響とは無関係。マイルの試金のもう一つの制限は、さまざまな組織で血管ベッドに異なる透過性促進剤及び皮膚のマイルの試験で得られた結果できない場合があります、したがって、代表などで発生する内容の応答可能性があります、肺や脳。
動物の年齢と体重は、マイルのアッセイで漏に影響を与える可能性があります。研究者をこれらの変数の影響を最小限に抑えるには、同腹子を使用する必要がありますまたは同様にサイズを使用して、コントロールとしてマウスを高齢者します。ときマウス興味の特定遺伝子の変異を評価し、マウス コントロールとして使用されるヘテロ接合体の繁殖戦略と野生型同腹子対ヘテロ接合体を生成します。さらに、いくつかの麻酔薬を静脈注射24,25を介して投与の記載されている血管収縮を避けるためにすぐに元に戻せる状態のガス麻酔薬イソフルランなどを使用することをお勧めします。マウス外側尾静脈にエバンス ブルー色素の注入はこのプロトコルの重要なステップを実験とデータの品質に大きく影響することができます。したがって、研究者は尾静脈注射を行う主務する必要があります、可能性があります必要があります経験またはマイル測定開始前に練習実験します。代わりに、研究者は、エバンス ブルー、レトロな軌道注入それを経験している場合などを提供するのに他の静脈内のルートを使用できます。透過性促進の皮内注射ソリューションは皮膚にエージェントに依存しない損傷を引き起こすことができます。そのため、皮内注射ボリュームの 20 μ l を超えないようにする必要があります、する必要があります常にヒスタミン阻害剤の存在下で行わし、車両制御の注射に正規化します。
マイル アッセイに使用されている多くの研究者によって、VEGF のシグナル伝達経路のたとえば、コンポーネントを評価 VEGF A 誘発血管透過性亢進の原因腹水癌患者16とビジョンを損なういくつかの新生血管浮腫目の病気7。私たちと他の人が VEGF A シグナル伝達カスケード12,13,14,の特定のコンポーネントの不足のために遺伝的に変更されたマウスにおける VEGF の誘導血管漏れを比較するのにマイルの試金を使用しているため、15,20,23. メインの病理学的 VEGF のアイソ VEGF165、信号 VEGFR2 と NRP1 の細胞質ドメインが SRC 家族キナーゼの ABL キナーゼを介した活性化を促進する NRP1 の複合体を介して、このアプローチを使用して私たちの最近の研究が明らかに14血管の応答を呼び起こす。VEGFA はまた血管の成長を促進する、その血管の活動は具体的には抑制されること場合、虚血性の組織に血流を回復する治療に使用可能性があります、したがって。操縦する血管の血管に向かって血管内皮細胞の VEGF の応答分子機構の解明研究があります、したがって、病理学的 VEGF A 誘発浮腫を抑制する選択的に操作できる経路を識別がんや虚血性眼疾患等の疾患。マイルの試金はこれらと分子のレギュレータと血管血管のエフェクターを解明する機能研究の他の多くの種類を支えるための便利な方法をする間違いなくいきます。

心血管システムの主な機能は循環のすべての臓器組織間ガス, 栄養素, と廃棄物の転送を有効にするのには。血管は、このような交換の1を許可するように基底の透磁率の臓器固有のレベルを持っています。例えば、腎臓の血管が血液脳関門を形成するタイトな非常に不可解なインタ フェース2,3,4ながら、浸透性の高い。血管の内側の粘膜を形成する内皮細胞は循環と基になる組織の間の物理的な障壁を提供して臓器特異的に血管透過性を調節します。しかし、ある特定の刺激は基底のレベル1を超える間に循環からの流体の漏出を高めるため内皮障壁の部分的崩壊を引き起こします。このような血管は、たとえば、サイトで観測された組織の外傷、炎症、腫瘍での敗血症、新生血管の疾患、脳や心臓、目の中に組織の虚血が発生するとそれぞれ脳卒中や心筋梗塞が原因5,6,7,8します。 慢性的に上昇、血管浮腫、眼疾患9に視力の低下など、組織の損傷が原因となりが発生。したがって、血管血管応答のモデリングは血管透過性を増加するメカニズムを理解するため、これを阻害するエージェントの有効性をテストすることが望ましい。
マイル アッセイは、血管の血管の代理指標として体内の血管漏れ対策確立、一般的に使用される、比較的単純な手法です。マイル アッセイが評価する信頼性の高い方法を提供する考えが一般に血圧や血流などの内皮障壁規制とは関係なく血管漏れを高める可能性があります因子を配合アカウントに入れないのに、物質の透磁率変調活動し、彼らの活動を促進するシグナル伝達の仲介。したがって、マイル アッセイは血管の血管のメディエーターとアクション10、11,12,13,のメカニズムを識別した数多くの研究に不可欠なされている14,15など血管内皮増殖因子 VEGF のことはもともと VPF16血管透過性因子として同定されました。
もともとモルモット17血管透過性亢進を勉強するマイルとマイルによって開発された, その分析後に適応されました選択血管透過性の分子機構を解明するためのモデル生物であるマウスを使用して遺伝子操作に彼らの絶妙な適合性のための規則。簡単に言えば、エバンス ブルー色素を静脈内に成体マウスに注入し、30 分 (図 1) を循環させること。車両制御対透水性誘導剤は血管漏出 (図 1) を誘発するために、マウスの側面に反対で複数のサイトでは皮内注射します。その結果、アルブミン結合エバンス ブルー色素は extravasates、(図 1) 真皮に蓄積されます。後マウスをカリング人道的、エバンス ブルーは真皮から抽出され血管漏出のレベルは光学濃度 (図 2) 物質-車両によるテストの比率として計算されます。

<table><tbody><tr><td>ピリラミン マレイン酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5514-5G</td><td>PBS</td></tr><tr><td>脱イオンホルムアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4117</td> で再懸濁 <td>ヒューム食器棚での使用</td></tr><tr><td>Microlance Needles 30g x 0.5"</td> <td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>305106</tr><tr><td>滅菌プラスチックパック 1ml ルアー</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>309659</tr><tr><td>滅菌済みMicroFineシリーイング0.3 ml - 8 mm - 30G&nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>324826</tr><tr><td>エバンス ブルー</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>マウス レストレイン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒートチャンバー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>バリカン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>メリアル</td><td>ap/drugs/220/96</td><td></td></tr><tr><td>スカルパル&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鈍いハサミ</td><td></td><td></td><td></td></tr>、<tr><td>鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>、エッペンドルフチューブ、</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒートブロック</td><td></td><td></td><td></td>、</tr><tr><td>コルクボード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>、卓上型冷蔵遠心分離機、</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>組換え血管内皮成長因子165</td><td>レライアテック</td><td>M30-004</td><td></td></tr></tbody></table>

マイル アッセイで皮膚の血管の血管誘導剤の評価

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

脊椎動物の生物における血管内皮細胞の主な機能は、血液と血液細胞、プラズマ高分子と水に内皮細胞の透過性によると合わせることができるという、体の各組織間の障壁として機能するには生理学的な必要はありません。特定疾患におけるサイトカインおよび成長因子が解放される一過性の血管透過性を増加する内皮障壁を対象とします。ただし、彼らの長期の存在は、慢性血管血管と浮腫のことにより組織損傷を引き起こす可能性があります。マイル アッセイは、血管漏れのプロキシの測定を通して血管血管を研究する研究者を可能にする生体内で手法です。ここでは、哺乳類の生理学と病理学を研究に最も広く使用されているモデル生物であるマウスでこの手順を実行する方法の詳細なプロトコルを提供します。プロシージャは、ラベルをマウスの側面に反対に透過性誘導剤と車両制御ソリューションの複数の皮内注射が続く循環アルブミンにエバンス ブルー色素の静脈内投与を含みます。その結果、エバンス ブルー色素は、徐々 にそれが蓄積し、車両に対する透過性誘導剤による漏れと定量化のため抽出することができます真皮にリークします。マイル アッセイ野生型で実行することができますまたは遺伝的マウスモデルを変更し、血管の透過性を調節し、エージェント/ターゲットの誘導またはブロックできるを識別する分子機構を研究対象に薬剤管理と組み合わせることがしたがって。

車両制御 (PBS) 野生型 C57/Bl6 マウスにおける相対的血管漏出を誘導するのに VEGF A の能力を評価するためにマイルの試金を使用しました。ここで、20 μ L 溶液 50 皮内注射で刺激なしの野生型マウスを用いた代表的な実験を示す VEGF A PBS または車両 PBS のみの ng。VEGF a 注入皮膚サンプルでエバンス ブルー色素漏出の増加が明確 PBS と比較して明らかな上皮内(図 1E) だった、ホルムアミド (図 2 a) の色素の抽出の後。複数の実験の定量化は、ことを示しています 50 VEGF-A の ng は大幅 PBS 単独で (図 2 b)、平均よりも青漏れは三枚開き (図 2) の車と比較して血管・ リーケージの増加より多くのエバンスを誘導します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig1.jpg"> 図 1: マイル アッセイにおける血管漏れの誘導します。模式図 (上部パネル) とマウスでマイルの分析を実行するときの一連のステップの対応する画像 (底面)。(A) ピリラミン マレイン酸は 10 ~ 30 分 (B) 100 μ l 1% マウスの尾に青いエバンス静脈注射前に内因性ヒスタミンの放出を防ぐために腹腔内に注入されます。(C) 30 分後、血管漏れはエージェントの皮内注射による (50 ng の VEGF-A の緑の円) 対車両制御 (PBS; 白い円).(D, E)エバンス ブルー蓄積のサイトにアクセス、マウスは皮内注射後の選別の 20 分、両翼の皮膚解剖し釘付けに。i. p.: 腹腔内;静脈: 静脈;内径: 皮;スケール バー、1 cm.<a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig2.jpg"> 図 2: マイル アッセイにおける血管漏れの定量化します。(A) エバンス ブルーの染料は肌サンプルを図 1にそれぞれの皮内注射から得られた吸光度を分光光度計で読み取りの 96 ウェル プレートに読み込まれるからホルムアミドで抽出されます。(B、C)両方透過性を誘発するエージェントのいずれか (B) 正規化された吸光度値 (光学密度、OD) をプロットすることによって複数の実験から吸光度の測定値のグラフィカルな表現 (VEGF A; 濃い緑の円) および車両 (PBS; グレー円)、または (C) 倍 OD で車両対エージェントの変更 (誤差範囲: SEM)。帳票 PBS と VEGF のサンプルのように (A) の吸光度の測定値は平均化され (B、C) にそれぞれ白または緑の円で表示されます。<a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

ここでは、マウスの皮膚に透過性促進剤の皮内投与により血管漏出を測定するためのプロトコルを提案する.この手法は、促進、あるいは血管漏れを抑制または血管の透過性を調節する分子機構を研究する分子の能力を決定する使用できます。

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

この手順の全体的な目標は、浸透促進剤の皮内注射によって誘発されるマウス真皮の血管漏出を測定することです。この手順は、どの分子が血管漏出を刺激または阻害できるか、関与するシグナル伝達経路は何かなど、in vivoでの血管透過性の調節に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順の主な利点は、迅速で比較的簡単であり、主に一般的な実験室の試薬と材料を使用することです。この技術の意味は、病理学的浮腫を伴う疾患の治療にまで及びます。特に、研究者はこのアッセイを使用して、新規の分子標的を特定し、血管透過性を阻害する関連薬物の能力を比較的迅速かつ簡単な方法でテストできます。ヒスタミン阻害剤マレイン酸ピリラミンとエバンスブルー染料の別々の溶液を0.9%生理食塩水溶液で調製します。.次に、層流キャビネットで作業し、0.22マイクロメートルのフィルターを通過して溶液を滅菌します。2つの溶液を別々の1ミリリットルシリンジに30ゲージの針を取り付けてロードします。次に、マウスをだらしげにします。次に、頭が地面に向けられ、腹部が上を向くようにマウスを傾けます。マウスを位置決めした後、腹腔内注射により体重1グラムあたり10マイクロリットルのマレイン酸ピリラミン溶液を投与します。次に、血管拡張を促進するために、マウスを摂氏37度の熱室に10分間置きます。次に、マウスをマウス拘束装置に移動します。次に、尾部を70%エタノールでこすり、さらに血管拡張を行います。100マイクロリットルのEvans Blue Dye溶液を尾静脈から静脈内投与します。.出血を防ぐために、指と親指の間にテールをすばやく保持し、注射部位に圧力をかけます。マウスの尾静脈へのEvans Blue Dyeの静脈内注射は、この手順の中で困難で重要なステップです。したがって、研究者は、残りの手順に進む前に、この注射を実行する能力があることが不可欠です。コンピテンシーを確立するには、事前の練習が必要です。リン酸緩衝生理食塩水の滅菌溶液を使用して、用量の最終容量が20マイクロリットルになるようにVEGF試薬を希釈します。次に、VEGF透過性誘導試薬とビヒクルコントロールを、31ゲージの針が取り付けられた2つの別々の300マイクロリットルシリンジにロードします。針を皮膚に対して15度の角度に保ち、マウスの側面に20マイクロリットルのVEGFを皮内に注入します。皮膚内の隆起した気泡を見つけて、注入が成功したことを確認します。少なくとも1センチメートル離れた2つの追加部位で皮内注射を行います。次に、マウスを回して2番目の側面を露出させ、ビヒクル溶液で3回の注入を繰り返します。各注入部位の記録と、注入手順が終了した時間を記録します。次に、マウスをホームケージに移します。マウスが意識を取り戻し、ケージの周りを動き始めるまで、マウスを監視し続けます。マウスを呼び出す前に、VEGFソリューションを20分間動作させます。この段階で、同じ手順に従って、すべてのマウスにVEGFAとビヒクルを順次注入します。20分後、安楽死させた各マウスを仰向けに置き、清潔なティッシュで包まれたコルクボードに足を固定します。次に、鈍いハサミの助けを借りて、死んだマウスの下腹部から胸部まで3〜4センチメートルの長さの垂直切開を行います。次に、鉗子とメスを使用して、脇腹の両側から皮膚をからかいます。メスを使用して、漏れ部位の周辺に脂肪が存在する場合は脂肪を取り除きます。次に、鉗子とメスを使用して、漏れたエバンスブルーダイで皮膚領域を切除します。切除された皮膚領域は、同様のサイズである必要があります。皮膚サンプルを1.5ミリリットルのチューブに移し、それに応じてラベルを付けます。開いたチューブをヒートブロックに一晩置いて、サンプルを乾燥させます。乾燥が完了したら、ヒュームフード内のサンプルに250マイクロリットルの脱イオンホルムアミドを加えます。チューブの蓋を閉め、ヒートブロックに一晩置いて、エバンス染料を抽出します。ベンチトップ遠心分離機で10, 000 g以上でサンプルを40分間遠心分離します。遠心分離後、遠心分離したサンプルから各色素含有上清100マイクロリットルを、ドラフト内で動作する96ウェルプレートのウェルに移します。分光光度計を使用してエバンスブルーの吸光度を読み取ります。VEGFによって誘発される血管漏出を研究するために、マウスに50ナノグラムのVEGFAをリン酸緩衝生理食塩水またはヒヒクルとしてリン酸緩衝生理食塩水のみに注射します。この画像は、VEGFA を注入した皮膚サンプル中の漏れた Evans Blue Dye の蓄積が、車両制御 in situ と比較して増加していることを示しています。この96ウェルプレート画像は、皮膚サンプルからホルムアミドで抽出されたロードされたEvans Blue Dyeを示しています。このグラフィカル プロットは、ペアになった VEGFA とビヒクルのみのコントロール サンプルの正規化された吸光度値を示しています。プロットは、50ナノグラムのVEGFAを注入すると、車両のみと比較してEvans Dyeの漏れが大幅に増加することを示しています。このグラフは、VEGFAと車両サンプルの光学密度の倍率変化を定量化した後に取得されます。このプロットは、VEGFA を投与した後の血管漏出が、ビヒクルのみと比較して平均 3 倍に増加したことを示しています。一度習得すると、このテクニックの主要な部分は、適切に実行すれば2時間で完了できます。この手順を実行する際には、非特異的な血管漏出とマウス間の変動を説明するために、薬剤誘発性血管漏出をビヒクル誘発血管漏出に正規化することが重要です。この手順は、薬物投与などの他の方法と組み合わせて、タンパク質を標的にして血管透過性を阻害できるかどうかなどの質問に答えることができます。この技術は、その開発後、血管生物学の分野の研究者が遺伝子改変マウスの血管過透過性の分子メカニズムを探求し、血管漏出に必要な主要なシグナル伝達成分を特定する道を開きました。このビデオを見れば、マウスの真皮の血管漏出を誘発し、測定する方法を十分に理解できるはずです。

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Research

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生物学

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マイルアッセイで皮膚の血管の血管誘導剤の評価

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