Name: 非正規のアミノ酸類の選択的な圧力の取り込みによって生成される抗菌ペプチド (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 学ぶ非正規アミノ酸をニシンに取り込む方法。Escherichia coliを用いて抗菌ペプチドを修飾し、寒天拡散アッセイと蛍光顕微鏡で活性を評価します。新規抗菌剤開発への応用が期待されます。

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J.H.N.、結核と M.B. は、EU FW7 プログラム (SYNPEPTIDE) によって資金を認めます。F. j. s. およびタスクフォースオニオン連邦教育省 (BMBF プログラム「HSP 2020」、TU WIMIplus プロジェクト SynTUBio) 科学とドイツ研究振興協会 (クラスターのエクセレンス「Unifying 触媒概念」) で資金調達を認めます。

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

プロリン類縁体の挿入の SPI を使用して、ターゲットを絞ったナイシン構造を大幅に変更一意のシーケンスの組み合わせや化学的性質を持つ新規ペプチドのバリアントを作成します。この方法で、20 cAAs の側鎖の化学的性質に制限する、古典的な遺伝子工学の基本制限を回避できます。生体内で化学の多様化ナイシン上記例示としては、自然の Ptm を補完するために、RiPPs の化学空間を劇的に向上させる一般的な方法を示します。アンプの特に偉大な約束を保持自然アミノ酸のレパートリーを拡大すると考えています。タンパク質の立体構造の 20 cAAs の定義された配置で機能の途方もない範囲が実現できます。長さ3にのみ 7 100 aa、cAAs を介してのみこのような構造の機能を実現する方法はアンプの限られたでしょう。それはこうして一般的 RiPPs の形で自然なアンプに広くファーストクリーニング修正4驚くべきことではないです。同じ方法では、代替のビルディング ブロックとして ncAAs は (バウマンら201735および参照をそこに見る)、薬力学及び薬物動態学的パラメーターを改善するために偉大な約束を保持します。
比較的簡単な実験のセットアップ、単純明快な実行と再現性の高いこの仕事の利点で使用される SPI 方法。グローバル置換対象ペプチドにマルチサイトの ncAA の設立も可能です。その一方で、メソッドは、ターゲット遺伝子産物の頻発のアミノ酸置換の適切でないかもしれません。原則として、サイト指示された突然変異誘発、望ましくない位置を変更できますが、これら追加の変更も構造と生物活性を含むいくつかのアンプ プロパティに影響を与える可能性があります。生産の栄養要求性の歪みがあり、一度は、遺伝子レベルの大幅な変更を必要とせずいくつかの ncAAs をテストできます。また、メソッドは栄養要求性大腸菌に限定しない系統しますが、自然な生産のホストを使用して実行できます。たとえば、周らは新規 RiPPs の生産のための SPI もで動作することを示した、当然 Trp auxotroph L. 乳酸菌: メディアを定義を使用して、3 つトリプトファン類縁体は、ナイシン50で 4 つのポジションで組み込まれました。
SPI 法選択のグローバル交換につながるので ncAA によって cAA、それはターゲットのペプチッドおよび蛋白質の広い範囲に一般に適用できます。範囲栄養要求性大腸菌の系統が利用できます (手順 1 を参照)、各 ncAAs で交換をテストするいくつかの cAAs を許可します。メタを使って組み込む類縁体に会った-欠損株 (例えば、 B834(DE3)) 採用が最も一般的。Isostructural Met 類縁体の例では、azidohomoalanine (Aha) と homopropargylglycine (Hpg)、市販の ncAAs 効率的に組み込むことができます。両方は、添付ファイルの互換性のあるアルキンまたはアジ化機能をそれぞれ運ぶ分子の bioorthogonal ハンドルをご紹介します。蛍光染料、またはポリエチレング リコール (PEG) 部分を銅 (I) により取り付けることがたとえば、-51アジ化物アルキンの環化付加反応 (CuAAC) を触媒。
両方遺伝子組換え ncAA 設立方法 (SPI と SCS) 通常十分な目標量を達成するため、対応するペプチッドおよび蛋白質の野生型生産基準利回りは頻繁に減る。純度は、多くの場合生産効率との相関、追加精製ステップ低豊富な種の特に必要かもしれません。組換えナイシン生産のこの特定のケースでセル lysates から選択的濃縮によってリーダーの彼の付けられたシーケンスはリップ浄化を大幅簡素化されます。このプロトコルに示すように精製純度とナイシン、濃度を向上しますが、しばしばアンプ純度収量および特定のアクティビティを決定するのに十分なを生成しません。高速液体クロマトグラフィー、クロマトグラフィー イオン交換 (IEC)、沈殿物、IMAC 以外にも一般的に使用されるアンプの浄化方法が含まれます (などアセトンまたはトリクロロ酢酸 (TCA) を使用して) または混合物 - 多段階浄化方式52 の結果。.注意すべきこと、ポリカチオン自然が IEC の浄化を促進する一般的。凍結乾燥はよく精製されたアンプを格納する使用されます。
理想的には、アンプに組み込むのための ncAAs は手頃な価格で市販する必要があります。 または、簡単にシンプルで再現性のある化学合成プロトコルによって生成されます。SPI 法の均等に重要な前提条件は、ncAA が認識、活性化および内因性や共発現 Aar によって同種の tRNA に充電します。これはテスト体外アミノ酸活性化または tRNA アミノアシル化アッセイ53でできます。簡単な代わりに、緑色蛍光タンパク質 (GFP) などのタンパク質モデルの SPI テスト式の存在の両方を行い ncAA 補充の不在で実行できます。さらに、成長中と細胞透過性と化学的安定性の溶解度は、重要な要因を構成します。
この例では抗菌作用はグラム陽性インジケーターひずみを使用して上映されました。リーダー ペプチダーゼ NisP を表して、ナイシン成熟の最終段階を触媒です。リーダー配列の除去 (彼のタグ付き浄化用) することも行われた体外精製 NisP50またはトリプシン54処理による。この仕事の範囲を超えて病原体と多剤耐性菌テストできます静菌や殺菌を阻害する同様の方法論を使用してアンプで。MRSA、MDR結核菌、VRE、アシネトバクター、肺炎球菌、緑膿菌、肺炎桿菌、臨床的に関連性の高いターゲット種が含まれます。寒天平板拡散ほかアッセイ表示ここでは、成長抑制は細菌種を接種した、アンプと補われた適切な液体のメディアを使用しても実行できます。スープの希釈方法を使用して、最小発育阻止濃度 (MIC) は純粋なペプチド55を使用して決定します。ここで紹介する作業の試金を生物活性と参照化合物、たとえば市販ナイシンを基準にしてアンプを含むソリューションの潜在的能力を推定する使用もできます。
RiPPs 組換え生産は多くの場合実現可能な39、よく PTM 遺伝子の共発現を含むです。生産ひずみが適した ncAA を含む化学的に定義されたまたは合成最小媒体に転送される、すぐに対応する cAA の特定の残基置換が行われます。したがって、組換え生産が可能で、ncAA の定款と PTM が対象製品の十分な量を得られる条件を見つけることができます、他の RiPPs を同じ手法で製作可能します。ホスト細胞プロテオームほかペプチド PTM 機械もなれると ncAA 変更 SPI の中に注意してください。その結果、ターゲット式誘導のタイミングと次の潜伏期間の長さは、最適化を要求できます。NcAA 混入 PTM 酵素に安定性と活動に影響する、ため加工リップの生産原則に影響を受けます。十分な PTM 酵素効果は、MS と生体活性アッセイによって検出された加工プレペプチドの形成によって示されます。PTM を生成するために、上記で紹介した異なる誘導性プロモーターを用いることができる ncAA の存在で続いて前駆体ペプチド遺伝子の誘導の最初 (ncAA の不在) の遺伝子。一般的には、前駆体遺伝子の厳しい弾圧が必要な理由である ncAA の加算の前に cAA を含むターゲット ペプチドの生産を抑制すること。このプロトコルでは、これは成長媒体にグルコースの添加による異化作用の抑圧によって実現されます。組換え生産はまだされていない場合、対応する遺伝子の発現温度とコドン使用が最適化を要求できます prepeptide 処理に必要な PTM 酵素が遺伝的に遠いホストと通常属しますので特に設立。NisBC や NisP は、原則として、プレペプチドの ncAAs の存在に認識とナイシンの場合、PTM の酵素の処理と干渉できます。アンプに ncAA 定款、適切な式の条件および AMP 活性測定法の信頼性を識別するために最初の小規模式実験を行うことはこうして勧めします。

20 世紀における抗生物質の発見と有効な病原性微生物に対する新規抗菌剤の並行開発は、細菌感染症の治療を対象としました。しかし、メチシリン耐性Staphylococcusaureus (MRSA)、バンコマイシン耐性腸球菌 (VRE) などの多剤耐性の病原体の出現により MDR (多剤耐性)サルモネラファージ型 10 (DT10)、クレブシエラ、緊急新しい抗菌剤1を生成する必要があります。抗菌ペプチド (アンペア) は、物理化学的性質、柔軟性、サイズ、疎水性、およびアクション2のモードのおかげで新薬の開発のための有望な候補者は、汎用性の高い、多くの場合非常に特定の化合物です。アンプは、通常 7 100 アミノ酸からなる小さなペプチドです。多くの場合、逆3の電荷は、対象となる微生物細胞膜と相互作用する正荷電アルギニンとリジンの残余の豊富なカチオン性構造であること。アンプの特定のサブグループは、ribosomally 合成と posttranslationally 変更されたペプチド (RiPPs)4です。これらは菌類の王国と細菌のドメインから多くの生物によって生成されます。最もよく知られた、広く使用されている RiPPs の 1 つは、ナイシン、自然に乳酸菌ラクトコッカス乳酸菌(乳酸菌 l.) によって生成です。グラム陽性菌のパネルに対してアクティブ、ナイシンとして使用されています食品業界で biopreservative その抗菌特性と対象微生物系統5に進化した抵抗の不在のため 50 年以上。研究は、そのナイシンを不安定ベビーブーム、両方のグラム陽性およびグラム陰性の病原体6に対する抗菌活性につながる細菌の細胞膜に孔が生成されますを示しています。脂質 II に結合することにより細菌の細胞壁合成は抑制7です。ナイシンは、リーダーおよびコア ペプチド領域 (図 1) で構成されている線形前駆体ペプチドとして保安院によってエンコードされます。リボソーム合成後 prenisin は最初その脱水酵素によって変更されます。ここでは、prepeptide のコア領域のセリンやスレオニン残基が dehydroalanine (Dha) と dehydrobutyrine (Dhb)8にステータス退避。その後、脱水残渣、ランチオニン リングにシステインと結合 (したがってランチオニン リングを含む抗生物質の名前「ランチビオティック」) 酵素触媒のマイケル付加によって。この翻訳後修飾 (PTM) は、内閣官房酸シクラーゼにより触媒されます。L. 乳酸菌で変更された prenisin でトランスポーター NisT、セルから、運ばれて、リーダーのペプチッドは成熟しており、アクティブなナイシン フォーム9を解放する NisP, プロテイナーゼ切断します。責任あるリーダー ペプチダーゼ NisP は高い基質特異性、効率的にプロセスだけの変更ナイシンをそれ以来10。
一般に、アクティブな RiPPs は、リン酸化やメチル化糖鎖を介して例えば、アセチル化ペプチドの化学の領域を大幅に増やす PTM 酵素 (例えば NisBC) の行動から生じる。複雑さのこのレベルは ncAAs の直接結合によってさらに拡張できます。一方、多くの場合実現可能なアンプの化学合成はその構造の複雑さのための大規模な生産のための挑戦です。たとえば、ランチビオティック lactosin S 71 の反応段階での全化学合成はたった 0.00311,12の粗利回りナイシンの最終利回りは 10% で達成されました。したがって、生物生産は正しい stereocenters と高濃度生成のための現実的な選択肢を提供しています。
今日まで以上 150 ncAAs、例えば、フッ素またはアザイドを含む官能基を有するは、組換えタンパク質に組み込まれている、ncAA 変更アンペアのいくつかの例が報告された13,14をされています。 15,16。NcAAs の導入に伴い、従来の突然変異誘発と比較して新規の物理化学的性質を生成できます。おそらく新規抗生物質につながる既存のペプチドの多様性を増やすことができます。
NcAAs の組換えペプチドへの取り込み方法栄養細菌系統17の使用に基づいて選択的な圧力混入 (SPI) であります。これらの系統は、ncAA の対応する cAA アナログを合成することではありません。方法論は頻繁に観察されたリラックスした基質特異性、多くの自然のアミノアシル tRNA シンテターゼ (Aars)18の機能を使用しています。その自然の cAA 基板から離れて、これらの酵素は認識し目的の ncAA を有効にし、同種の tRNA(s) にそれを充電することができる多い。これは (すなわちcAA → ncAA 置換) 残基特異的ターゲット遺伝子産物に ncAA のリボソームの設立に します。もちろんのみ可能目的の ncAA は構造的に、化学的に標準的なアミノ酸に似ている場合、細胞生理学、翻訳機械およびターゲットのペプチドや蛋白質の配列を容認します。特定の実験のセットアップで栄養要求性ホスト セル置換するネイティブのアミノ酸の限界濃度に付属している培地で培養されます。細胞増殖や cAA 自由な媒体による交換は、cAA の細胞の枯渇に します。次の手順で、ncAA が追加され、ターゲット遺伝子の発現が誘導されます。必然的に、ncAAs 今も組み込まれますしない宿主細胞の他の多くのタンパク質ターゲット遺伝子発現のこの段階で。それにもかかわらず、エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) ひずみと強力なプロモーターの制御下でターゲット遺伝子を運ぶプラスミッド変換されますので、低レベルで SPI セットアップの毒性がされます (一般競争力の高い T7 プロモーター/RNA ポリメラーゼ システム)19。誘導 (通常時 cAA が使い果たされる)、細胞が成長を停止するホストおよびその細胞質酵素からくり後すぐにプラスミドを用いた対象遺伝子の発現に主に使用されます。サイト指示された突然変異誘発は、ターゲット遺伝子20残基特異 ncAA インストールのサイトを定義する使用できます。
NcAAs の定款モデル ペプチドとしてラダーポリマー アンプ ナイシン A が選ばれました。34 アミノ酸長くがあり、コア ペプチド シーケンス (図 1) にのみ単一のプロリン残基を持ちます。サチライシン、ericin A と S、epidermin 同様ナイシン Z とナイシン Q のようのように活動9,21のために不可欠の保存のプロリンがようです。CAA プロリン プロリン アミド回転および二次構造の安定化に特に重要な役割を果たしています。側鎖の立体構造のリング (exo 遠藤シームパッカ リング/) アミド結合の熱力学的安定化を担当します。折りたたみの安定性、足場の剛性、多くの生物学的構造22の機能 (アントシアン、fluorinations、メチル化) など対象の化学修飾プロリルたたんのしばしば批判的に影響を与えます。したがって、それはもっともらしい Pro→ プロリン アナログ置換が小説と珍しい特性リング B、ナイシンの 2 番目のリングが授けるされますを期待します。
ここでは、プロリン栄養組換えナイシン生産大腸菌の菌株を使用しました。Prepeptide 遺伝子保安院として修飾酵素遺伝子nisBCの式が必要です。遺伝的コード化ペプチド製品は、アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーによる精製の N 末端タグ付きの彼リーダーを運ぶ。活性測定L. 乳酸菌を表現し、NisPT の分泌がエシェリヒア属大腸菌のセル lysates または精製ペプチドのサンプル (図 1) から組換えナイシンのバリエーションを有効に使用されます。成熟したアンプは、NisP によってリーダーの胸の谷間の後解放されます。この寒天平板拡散法でアンプ サンプルは固体成長する媒体に拡散し、グラム陽性菌の成長を抑制することができます。インキュベーション後、これは成長阻害ハローによって視覚的に観察することができます。L. 乳酸菌指標として、ほかの亜種ナイシン腸球菌、セレウス菌、黄色ブドウ球菌乳酸菌摂取に対する抗菌活性を示した21,23。
RiPPs の ncAAs を組み込むことの代替とは異なる実験的メソッドは停止コドン抑制 (SCS)24です。これは、直交 tRNA のアミノアシル tRNA 合成酵素 (aaRS) のペアが対応する ncAA のため必要。理想的には、すべてのこれらの 3 つのコンポーネントは、bioorthogonal、すなわち、彼らは内因性の Trna と Aars と対話しないが。NcAA 固有 aaRS は、変異シンテ25の遺伝子ライブラリのスクリーニングおよび酵素活性部位の修正によって生成できます。さらに、ncAA の導入では、コドンが再割り当てされ、cAA をエンコードしませんが必要です。一般的には、アンバー終止コドンは使用される24,26です。
最近では、SPI は、α chloroacetamide を含むとクリック-化学-互換性の ncAAs の定款の保安院27に設立されました。たとえば、 Nε- alloc リジンはルテニウム触媒を用いたオレフィンメタセシス28 によって部位特異的 (SCS) と残基特異 (SPI) 設立方法とその後変更された体外なげなわペプチド captistruin に編入されました。.SPI と比較して直交 tRNA から SCS メソッドはより複雑/aaRS ペアが共発現します。日には、プロリンの取り込みの o 組は開発29をされているが、我々 の知識の限り、プロリン アナログ定款例は報告されていません。
それは、SPI の手法を使用していないすべての ncAAs を組み込むことができます注意してください。まず、細胞質に ncAAs の取り込みは、大腸菌のようなグラム陰性菌の内膜は、細胞の膜に埋め込まれている輸送蛋白質の多数によって調整されます。通常、大腸菌は構造的に側鎖を有する細胞にアミノ酸酸類縁体の広い範囲を運ぶことができる、標準的なアミノ酸に化学的に類似。第二に、多くの化学反応性や不安定の ncAAs 彼らは有毒な代謝とホストの生理学細胞30細胞成長に向けた阻害剤として動作可能性があります。したがって、吸収および本番ホストの ncAA の毒性は事前テストする必要があります。天然のアミノ酸を組み込む修飾酵素 (例えば、nisBC) に副作用として PTM 機械の不活化を避けるためには、遺伝子の表現を厳密にコントロール セットアップを使用できます、ターゲット遺伝子 (に ncAA例えば、保安院)。これは、特別に設計された SPI プロトコル31に示すように 2 つの異なるプロモーターとターゲット遺伝子発現の誘導を使用して実現できます。上記のとおり、SPI 法は ncAA アクティベーションと同種の tRNA を充電可能にする Aar のリラックスした基質特異性に依存します。その後、tRNA はリボソームのアミド結合形成が続くし、ターゲット (ポリ) ペプチドのフォールディングに配信されます。このプロセスでは、校正と編集のメカニズムが関連する32になることがあります。これらの理由から、それはターゲットが存在する非常に重要なの ncAA cAA に化学的に構造的に似ています。その他の重要なポイントは、十分な安定性 (成長媒体の両方と細胞代謝にさらされて) および ncAA の溶解度。さらに、それは利用可能な商業的または化学的に合成されやすいはずです。
ここでは、SPI、組換え RiPPs に ncAAs の残基特異結合を許可するためのプロトコルについて述べる.特に、異なったプロリン類縁体の抗菌ペプチド ・ ナイシン A に組み込まれているホストの有機体として大腸菌を用いたします。質量分析法はアミノ酸置換を確認する使用され、ペプチド製品を成長阻害アッセイおよび微生物指標菌を使用して蛍光顕微鏡を用いた生体活性の分析します。
定義された ncAAs で成功した組換えナイシン式の基本的な要件が必要です適切なプロリン栄養要求性大腸菌。この栄養要求株、プロアならない機能不全、遺伝子のノックアウトによって例えば達成。細胞内のプロの生合成の細胞が完全に奪われた (すなわち、削除proABC) 安定した欠復帰の可能性なし。広く使われている遺伝子ノックアウト法、ファージ伝達または Datsenko ・ ワナーは33によると単一遺伝子ノックアウトです。さらに、プロアノックアウト系統は Addgene 級将校や慶應義塾コレクションなどの公開リポジトリから入手できます。組換えnisABC式は、T7 の促進者の使用に依存しているので、式のホスト株は T7 RNA ポリメラーゼの誘引可能な遺伝子を運ぶため持っています。これは、たとえば市販のキットを使用して、ホストのゲノムに λDE3 (64) の導入によって実現できます。また、上記のように栄養、BL21(DE3) などの緊張は作成できます。

<table><tbody><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>カール・ロート、ドイツ</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>グアニジン塩酸塩</td><td>カール・ロート、ドイツ</td><td>0035.2</td><td></td></tr><tr><td>リン酸水素二カリウム</td><td>カール・ロート、ドイツ</td><td>P749.3</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td>カール・ロート、ドイツ</td><td>3904.3</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素ナトリウム 一水和物</td><td>カール・ロート、ドイツ</td><td>K300.2</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>水素二ナトリウム</td>カール<td>ロス、ドイツ</td><td>P030.2</td><td></td></tr><tr><td>L-アラニン</td><td>カールロス、ドイツ</td><td>3076.2</td><td></td></tr><tr><td>L-アルギニン</td><td>カールロス、ドイツ</td><td>3144.3</td><td></td></tr><tr><td>L-アスパラギン一水和物</td><td>カールロス、ドイツ</td><td>HN23.1</td><td></td></tr><tr><td>L-アスパラギン酸</td><td>カールロス、ドイツ</td><td>T202.1</td><td></td></tr><tr><td>L-システイン</td><td>カール・ロート、ドイツ</td><td>3467.3</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>カール・ロート、ドイツ</td><td>3772.1</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン酸</td><td>カール・ロート、ドイツ</td><td>3774.1</td><td></td></tr><tr><td>L-グリシン</td><td>カール・ロート、ドイツ</td><td>3187.3</td><td></td></tr><tr><td>L-ヒスチジン</td><td>カール・ロート、ドイツ</td><td>3852.3</td><td></td></tr><tr><td>L-イソロイシン</td><td>カール・ロート、ドイツ</td><td>3922.3</td><td></td></tr><tr><td>L-ロイシン</td><td>カール・ロス、ドイツ</td><td>3984.3</td><td></td></tr><tr><td>L-リジン一水和物</td><td>カール・ロス、ドイツ</td><td>4207.2</td><td></td></tr><tr><td>L-メチオニン</td><td>カール・ロス、ドイツ</td><td>9359.4</td><td></td></tr><tr><td>L-フェニルアラニン</td><td>カール・ロス、ドイツ</td><td>4491.2</td><td></td></tr><tr><td>L-プロリン</td><td>カール・ロス、ドイツ</td><td>T205.3</td><td></td></tr><tr><td>L-セリン</td><td>・カール・ロス、ドイツ</td><td>4682.4</td><td></td></tr><tr><td>L-threonine</td><td>Carl Roth, ドイツ</td><td>T206.2</td><td></td></tr><tr><td>L-トリプトファン</td><td>Carl Roth, ドイツ</td><td>4858.2</td><td></td></tr><tr><td>L-チロシン</td><td>Carl Roth, ドイツ</td><td>T207.2</td><td></td></tr><tr><td>L-valine</td><td>Carl Roth, ドイツ</td><td>4879.4</td><td></td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>Carl Roth, ドイツ</td><td>3746.3</td><td></td></tr><tr><td>マグネシウム硫酸塩</td><td>カール・ロス、ドイツ</td><td>0261.2</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>カール・ロス、ドイツ</td><td>6780</td><td>溶融寒天に添加するための 20% (w/v) 溶液を調製</td></tr><tr>塩化<td>カルシウム</td><td>カール・ロス、ドイツ</td><td>PN93.2</td><td></td></tr><tr><td>鉄(II) 塩化</td>物 <td>シグマ・アルドリッチ、ドイツ</td><td>372870</td><td></td></tr><tr><td>チアミン塩酸塩</td><td>シグマ・アルドリッチ、ドイツ</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン</td><td>カール・ロート(ドイツ</td><td>) 3822.2</td><td></td></tr><tr><td>硫酸銅(II)</td><td>メルク(ドイツ</td><td>) 102792</td><td></td></tr><tr><td>塩化マンガン(II)</td><td>カール・ロート(ドイツ</td>) <td>KK36.2</td><td></td></tr><tr><td>塩化亜鉛</td><td>メルク(ドイツ</td><td>) 108816</td><td></td></tr><tr><td>オルトモリブデン酸イモニウム</td><td>シグマ・アルドリッチ(ドイツ</td><td></td>) 277908 <td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>カール・ロス、ドイツ</td><td>7533.3</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル&beta;-D-1-チオガラクトピラノシドシ</td><td>グマアルドリッチ、ドイツ</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩</td><td>カールロス、ドイツ</td><td>K029.5</td><td>作業濃度100&micro;大腸菌の場合は、ddH2O</td></tr><tr><td>カナマイシン硫酸</td>塩<td>カール・ロス、ドイツ</td><td>T832.2</td><td>使用濃度 50 & マイクロで 100 mg/mL ストックを調製します。大腸菌の場合は、ddH2O</td></tr><tr><td>chloramphenicol</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>3886.1</td><td>working concentration 5 & micro;L. lactisの場合は、エタノール</td></tr><tr><td>(4S)-フルオロプロリン</td><td>バケム、スイス</td><td>F-3970</td><td></td></tr><tr><td>(4R)-フルオロプロリン</td><td>バケム、スイス</td><td>F-3975</td><td></td></tr><tr><td>(4S)-ヒドロキシプロリン</td><td>バケム、スイス</td><td>F-1395</td><td></td></tr><tr><td>(4R)-ヒドロキシプロリン</td><td>バケム、スイス</td><td>F-2980</td><td></td></tr><tr><td>(4S)-メタノプロリン</td><td></td><td></td><td>化学合成</td></tr><tr><td>(4R)-メタンプロリン</td><td></td><td></td><td>化学合成</td></tr><tr><td>塩酸(HCl)</td><td>カール・ロス、ドイツ</td><td>P074.4</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWR、ドイツ</td><td>20825.324</td><td></td></tr><tr><td>M17-ブロス</td><td>シグマル・アルドリッチ、ドイツ</td><td>56156</td><td>商用製品、Terzaghi BE&を参照Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 内容物と調製</td></tr><tr><td>寒天</td><td>Carl Roth, ドイツ</td><td>5210.5</td><td></td></tr><tr><td>Lactococcus lactisからのNisin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich、ドイツ</td><td>N5764</td><td>商用製品、生物活性</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td>の参照として使用できますカール<td>・ロス、ドイツ</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>カール・ロス、ドイツ</td><td>3899.3</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS用1.5 mLオートサンプラーバイアル</td><td>Sigma-Aldrich、ドイツ</td><td>Supelco 854165</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>VWR、ドイツ</td><td>HiPerSolvLC-MS用のCHROMANORM ULTRA、83642</td><td>LC-MSグレードが必要な</td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>VWR、ドイツ</td><td>HiPerSolv LC-MS用のCHROMANORM、84865</td><td>LC-MSグレードが必要な</td></tr><tr><td>1 mL Ni-NTA IMACカラム、例:HisTrap FF Crude</td><td>GE Healthcare、UK</td><td>29-0486-31</td> IMAC 0.45 & micro <td>用の異なるメーカーと樹脂</td></tr>。<tr><td>mボトルトップフィルターユニット</td><td>VWR、ドイツ</td><td>10040-470</td><td>真空ポンプを使用した溶液の滅菌ろ過</td></tr><tr><td>0.45&micro;mシリンジフィルターPVDF膜</td><td>カールロス、ドイツ</td><td>CCY1.1</td>シ<td>リンジを使用した溶液の滅菌ろ過と細胞溶解物から粒子を除去するル</td></tr><tr><td>アーロックシリンジ、PP、50 ml</td><td>カールロス、ドイツ</td><td>T552.2</td><td>溶液の滅菌ろ過&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>1.5 mL エッペンドルフチューブ</td><td>エッペンドルフ、ドイツ</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 (ポリスチレン、滅菌)</td><td>カール・ロス、ドイツ</td><td>TA19</td><td></td></tr><tr><td>ナイルレッド</td><td>シグマ・アルドリッチ、ドイツ</td><td>72485</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌 & デルタ;proA strain</td><td>CGSC, Keio collection</td><td>JW0233-2</td><td>proline-auxotrophic E. coli K-12 strain</td></tr><tr><td>E. coli B834(DE3)</td><td>Novagen (Merck), Germany</td><td>69041</td><td>methionine-auxotrophic E. coli B strain</td></tr><tr><td>&lambda;DE3 Lysogenization Kit</td><td>Novagen (Merck), ドイツ</td><td>69734-3</td><td></td></tr><tr><td>Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT</td><td></td><td></td><td>細菌指示株, Khusainov R & を参照Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890</td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf tubes</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>5427 R</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>GE Healthcare, UK</td><td>P1</td><td></td></tr><tr><td>FPLC system</td><td>GE Healthcare, UK&</td><td>Auml;kta Purifier 10 または同様の</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>TI Eclipse 広視野蛍光顕微鏡&nbsp; 100x (N.A. 1.4) 対物レンズと Mercury Lamp</td><td>蛍光顕微鏡</td></tr>電子<tr><td>増倍 CCD (EMCCD) カメラ</td>のセットアップ例 <td>Andor Technologies, UK</td><td>Andor Luca&nbsp;</td><td>蛍光顕微鏡のセットアップ例</td></tr><tr><td>蛍光励起フィルター</td><td>Thorlabs, USA</td><td>Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC)</td><td>蛍光顕微鏡用サンプルセットアップ</td></tr><tr><td>蛍光蛍光フィルター</td><td>AHF Analysentechnik, Germany</td><td>T 560 LPXR</td><td>蛍光顕微鏡用サンプルセットアップ</td></tr><tr><td>カバースリップ 24 x 60 mm</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>LH26.1</td><td>蛍光顕微鏡用サンプルセットアップ</td></tr><tr><td>イマージョンオイル</td><td>Carlツァイス、ドイツ</td><td>Immersol 518 F</td><td>蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>プローブ超音波処理装置</td><td>バンデリン、ドイツ</td><td>ソノパルスHD3200 ソノトロード MS-72</td><td>200 W 最大HF出力</td></tr><tr><td>C5 HPLCカラム (2.1x100 mm、3 &micro;</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>567227-U</td><td>質量分析用セットアップ例</td></tr><tr><td>HPLCシステムAgilentに結合されたESI-TOF</td><td>Agilent, USA</td><td>Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC</td> 質量<td>分析用セットアップ例</td></tr></tbody></table>

非正規のアミノ酸類の選択的な圧力の取り込みによって生成される抗菌ペプチド

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

自然には、様々 な個々 のアミノ酸構成ブロックのシーケンスを変更することにより新しいタンパク質機能を作成する可能性があります。ただし、すべてのバリエーションは 20 標準的なアミノ酸 (cAAs) に基づいています。ポリペプチドに追加の物理化学的性質を導入する方法として非正規のアミノ酸類 (ncAAs) の取り込みはますますタンパク質工学で使用されます。彼らの比較的短い長さのため ncAAs による ribosomally 合成とファーストクリーニング変更されたペプチドの変更は特に魅力的です。新しい機能や化学処理は、アミノ酸残基の特定の変更によって生成できます。選択圧定款 (SPI) 方法は、化学的に定義された成長媒体で必須アミノ酸の奪われている栄養要求性ホスト系統を利用します。いくつかの化学的に構造的に類似したアミノ酸アナログ対応するアミノアシル tRNA 合成酵素によってをアクティブにすることができ、残基特異 cAA(s) → ncAA(s) 置換対象のペプチドや蛋白質の配列を提供します。とはいえ、SPI メソッドのコンテキストで ncAAs 組み込まれているホスト プロテオーム組換え遺伝子発現の段階で、セルのリソースの大部分は、ターゲット遺伝子の発現に割り当てられます。これにより効率的な残基特異 ncAAs しばしば変更されたターゲットの多量を伴って定款です。提示された作品は、抗菌ペプチド ナイシン、ラクトコッカス乳酸菌によって生成される自然ランチビオティックに六つのプロリン類縁体の体内取り込みをについて説明します。ナイシンの抗菌特性を変更してその発酵と栄養要求性大腸菌での発現の間にさらに拡大すること定義されている成長媒体の系統。それによって、cAAs ncAAs で特定の残基置換の効果は、抗菌活性と特異性に変更を配信できます。抗菌活性アッセイ、蛍光顕微鏡を使用してグラム陽性ラクトコッカス乳酸菌インジケーターひずみを成長阻害するナイシンの変種をテストします。質量分析法を使用して、生理活性ナイシンの変形 ncAA 定款を確認しました。

このプロトコルは、SPI 法によるプロリン類縁体の残基特異設立に ncAA 変更ナイシンの亜種の生産を有効にすることができます。以前は、24 mg/L の利回りの実現可能性とは、完全に修正された野生型ナイシン39組換え生産の報告されました。SPI メソッドを使用して、ターゲットのペプチド ・ タンパク質の収量はよく良いと野生型生産48に近い量を達することができます。最初の実験として組換え野生型リップ生産は選択した栄養要求性ホストでテスト必要があります。ここ、プロリン栄養要求性大腸菌MG1655 Δ確率:: frt ΔproC:: frt (DE3) が宿主として使用されました。誘導、栽培 ncAAs 定款最大ペプチド収量に向かってタイミングとして培地の組成と温度を最適化できます。
抗菌活性アッセイ 野生型遺伝子組換えナイシン生産および浄化を上記のプロトコルに従う行った。この場合、プロリンはステップ 3.6 で ncAA 誘導体の代わりに使用されました。抗菌活性は、リップの生産を確認し前に、と浄化後の抗菌活性を比較する使用されました。作業の試金のため溶出画分と IMAC フロースルーされ直接使用、グラム陽性菌乳酸菌 l.インジケーター株 (図 2) に対するテストします。この歪みは、NisP を表現、亜種内にエシェリヒア属大腸菌のセル lysates またはペプチド試料をそれぞれ精製ナイシン リーダーのペプチッドの蛋白質分解開裂によってアクティブになります。明らかに、流れを成長阻害活性を示した。これは、IMAC のコラム連結しなくて生理活性物質によって説明できます。すべてのテストの溶出画分は、IMAC で彼の付けられたペプチドの濃度を示す unpurified の例と比べると増加活性を示した.(マイナス コントロール) として溶出バッファーでしたこのアッセイのL. 乳酸菌の成長に影響しないことに注意してください。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig2.jpg"> 図 2.抗菌テストの IMAC 浄化 recombinantly 野生型ナイシンを作り出した後。 L. 乳酸菌インジケーターひずみに溶出画分 5 に 15 と IMAC 浄化の流れ (外径600正規化の希釈) unpurified 細胞ライセートとの比較テストを行いました。成長阻害ハローのサイズは、抗菌活性を示します。クロラムフェニ コール 400 μ G/ml の濃度では、陰性対照として肯定的な制御と IMAC 溶出バッファーとして使用されました。<a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
Recombinantly の抗菌活性を証明するために六つの異なったプロリン類縁体を含むバリアント活性アッセイを行ったL. 乳酸菌インジケーターひずみの抑制をテスト ナイシンを生産しました。6 サンプルではプロリンの類似を使用して生産の 5 つの成長抑制を図 3に示します。(ハローのサイズから判断する)、最良の結果が - fluoroproline、(4R) - アナログ (4R) の導入実験の観察されたヒドロキシプロリンと (4S)-methanoproline。野生型ナイシンを成長阻害ハローのサイズを比較する生産し、すべての 3 つのナイシン バリエーションを示した同様阻害強度並列でテストします。ただし、ハローのサイズだけをすることはできませんアンプの濃度を特定できませんでしたのでロバに特定のアクティビティを使用します。したがって、法は質的結果ナイシン亜種の抗菌活性の保持または失われたかどうかのテストだけに利用します。特定のアクティビティを調べるには、ナイシンの亜種の濃度の定量化 (ディスカッションを参照) 必要があります。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig3.jpg"> 図 3.ナイシンの亜種を含むセル lysates の抗菌活性アッセイ生産を介してSPI プロリン アナログ。遺伝子組換えの野生型サンプルとナイシン バリアントを比較。全てのサンプルが OD600-収穫された細胞培養密度基準セル換散後正常化しました。ハローは、インジケーターひずみ成長抑制の形で生物活性を示します。最初の右へ左から行: (4R)-fluoroproline (4R) - ヒドロキシプロリン、(4R) - methanoproline とクロラムフェニ コール (400 μ G/ml; 抗菌肯定的な制御)。2 列目: (4S)-fluoroproline (4S) - ヒドロキシプロリン、(4S) - methanoproline、プロリン (野生型コントロール)。注化学専門語;例えば、(4R) - fluoroproline、別名トランス-4 - fluoroproline。<a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
LC ESI TOF 質量分析法 IMAC 浄化後 ncAAs のナイシンへの取り込みは、LC ESI TOF 質量分析法によって分析されました。図 4は、ナイシン バリアント (4R) の deconvoluted の質量スペクトルを示しています-fluoroproline。このバリアントは、前述を精製し、その後 LC ESI-飛行時間型質量分析法による分析それはまだリーダーを行うための IMAC だった。図 4Aに主峰 (4R) を含む変更されたナイシンに対応-6883.18 da deconvoluted 質量 fluoroproline (計算される質量 6882.05 Da、計算でプロリンと対応する野生型ペプチドの質量位置 9、6864.06 Da)。低い豊かさと高い質量と 2 つのピークに対応するナトリウム付加体の示される。図 4Bは、デコンボリューション アルゴリズムによって見つけられるように化合物メインの異なる荷電種を示しています。たとえば、1148.11 m/z でピークが 6 倍の荷電粒子に対応 ([M + 6 H]6 +)。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig4.jpg"> 図 4.(4R) を含む組換えナイシンの IMAC 精製変形の LC ESI TOF 質量分析法-fluoroproline。(A)ナイシン変形 (4R) (まだリーダーを運ぶ) の質量分析のクロマト グラムの (左下の縮小) を Deconvoluted-fluoroproline (大衆 (Da) を予想: 【 M + H 】+ = 6882.05 [M+na]+ = 6904.03、[M + 2Na]2 += 6926.02)。(B)複合種 [M + H]+のスペクトルです。大衆 (Da) を予想: 【 M + 5 H 】5 + = 1377.41、[M + 6 H]6 + = 1148.01、【 M + 7 H 】7 + = 984.15、[M + 8 H]8 + = 861.26、【 M + 9 H 】9 + = 765.67、【 M + 10 H 】10 + = 689.21、[M + 11 H]11 + = 626.64、【 M + 12 H 】12 + 574.50 を =。<a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
蛍光顕微鏡 組換えナイシンと ncAA を含むバリアントの抗菌活性は、蛍光顕微鏡を介して L. 乳酸菌インジケーター歪みの直接観察によっても表示できます。ナイルの赤、高疎水性蛍光色素は、細菌の細胞膜を染色する使用されました。図 5は、単一細胞の形態、細胞培養の凝集状態の質的な変化を示しています。細胞は、ナイルの赤に染まった, 顕微鏡カバー スライド上に堆積.上段は、初めに直接セルを示して ときバッファー、組換えの野生型ナイシン、ナイシンを含む (4R)-fluoroproline、または (4R)-ヒドロキシプロリンが追加されました。下のパネルは、インキュベーションの 20 分後に対応するイメージを示しています。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig5.jpg"> 図 5.組換えナイシンに及ぼすグラム陽性細胞の蛍光顕微鏡像。30 μ L L. 乳酸菌インジケーターひずみの顕微鏡画像 (外径600 = 1) ナイル川 (上部パネル) の前に撮影された赤でマークされた後 (下段) 1 μ L バッファー (A)、0.3 μ L 組換え野生型ナイシン (B) 20 min 培養と(4R) を含む 0.6 μ L ナイシン亜種-fluoroproline (C) と (4R)-ヒドロキシプロリン (D)。青い円は、蛍光膜片の拡散を観察できる領域に集計または変形した細胞、青い矢印ポイントを持つ領域をマークします。<a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
図 5Aは観測の 20 分以内のセルの一般的な外観を変更しないように示しています。時間ローズの中に堆積したセルの数だけと細胞の量を大きく、観測地域の 80 μ x 80 μ m 内で表示されます。図 5Bことを示しグラム陽性の細胞出現集計ぼやけて (青い円で示されて) 野生型ナイシンに露出の 20 分後、たとえ低量 (ここで 0.3 μ L の IMAC 溶出) を追加しました。また、軽い素材は、ナイルが付いて赤い膜の断片が (青い矢印で示されます) 期間中に動員されたことを示す、バッファーに細胞から拡散。これらの調査結果は、ナイシン6,49で治療時に発生することが示された、セル換散を示します。同様の効果は、- fluoroproline (図 5C) とナイシン (4R) を含む-(4R) のナイシン バリアント含有培養後観察されたヒドロキシプロリン (図 5D) 両方を示す大規模な歪んだと集計セル コントロールのサンプル (図 5A) と好対照で、20 分後の金額。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>コンポーネント</td>
			<td>濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>(NH4)2だから4 </td>
			<td>7.5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化ナトリウム</td>
			<td>8.5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>22 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2HPO4
</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4
</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-グルコース</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>すべての標準的なアミノ酸 (交換を除く)</td>
			<td>50 mg/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ca2 +
</td>
			<td>1 μ G/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fe2 +
</td>
			<td>1 μ G/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>微量元素 (Cu2 +Zn2 +Mn2 +MoOH2 +)</td>
			<td>0.01 μ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>チアミン</td>
			<td>10 μ G/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ビオチン</td>
			<td>10 μ G/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1。手順 2 に従って準備の後 NMM19 化学的に定義された細菌の増殖培地の組成物。

プロトコルを提示大腸菌-lactococcal ・抗菌ペプチド ・ ナイシンに非正規アミノ酸類 (ncAAs) の選択的な圧力の取り込みをベースします。そのプロパティは、定義された成長媒体の目的の ncAAs で組換え発現を介して置換中に変更できます。結果として得られる活性変化は成長阻害アッセイ、蛍光顕微鏡でマップされます。

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

この方法論の全体的な目標は、非標準アミノ酸をリボソーム合成された抗菌ペプチドに組み込むことです。新しい変性ペプチドを作製し、ncAAの存在を確認し、寒天拡散アッセイを使用して抗菌活性をテストします。この方法は、作用機序や耐性発現における特定のペプチド位置の役割など、抗菌薬や細菌の分野におけるいくつかの重要な質問に答えるのに役立ちます。より少ないペプチドなどのさまざまなフロップと同じ原理に従って、または生成することができ、MRSAなどの病原体に対して検出性をテストできます。自然界では新しいペプチドを作製することで、病原体に対抗するための抗菌薬の開発や、抗菌薬の不足を克服することができます。この手法の主な利点は、遺伝的レベルでの変更を必要とせずに、さまざまな非標準アミノ酸を並行してテストできることです。その結果、複数の修飾ペプチドを並行して作製することは比較的容易です。この手順を開始するには、抗生物質と1パーセントのグルコースを含む25ミリリットルのLB培地を100ミリリットルの三角フラスコに調製します。新たに形質転換された細菌細胞のコロニー、または凍結細胞ストックの細胞を使用して接種します。細胞を摂氏37度、200rpmで一晩インキュベートします。翌日、1リットルの滅菌新鮮な培地に10ミリリットルの一晩培養物を加えます。培養物を2リットルの三角フラスコでそれぞれ2つの500ミリリットルの培養物に混合して分割し、摂氏37度と200rpmで2時間インキュベートします2時間後、ブランクとして滅菌培地を使用してOD600を測定します。インキュベーションを継続し、OD 600が0.5に等しくなるまで、ODを一定の間隔で測定します。続いて、細菌培養物の両方を引き出し、摂氏4度と4,500 x gで15分間遠心分離します。次に、上澄みを注ぎ、捨てます。抗生物質と1パーセントグルコースを含むNMM19の20ミリリットルを入れた氷上に置いた遠心分離バケツに細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液を50ミリリットルのチューブに移し、摂氏4度と4,500×gで10分間遠心分離します。次に、セルペレットを氷上の同じ新鮮な培地の5ミリリットルに再懸濁します。細胞懸濁液を500ミリリットルの新鮮な培地に移し、摂氏30度、200rpmで1時間インキュベートします。1時間後、培養物を個々のフラスコで2等分し、各ncAAまたはコントロールごとに1つずつ分けます。各培養物に、ストックncAAを最終濃度1ミリモルに添加し、野生型コントロールにL-プロリンストックを1ミリモルに添加します。次に、1ミリモルのIPTGを用いて標的遺伝子の発現を誘導します。培養物を摂氏28度、200rpmで一晩インキュベートします。翌日、ODを測定し、活性アッセイのために各培養物1ミリリットルを服用します。各培養物の残りの細胞を摂氏4度と5, 000 x gで20分間繰り返し遠心分離することにより、収集します。毎回、すべての細胞が収集されるまで、上清を取り除いて廃棄します。ペプチド精製まで、細胞ペレットを摂氏マイナス80度で保存します。GM17寒天プレートを調製するには、まず、25ミリリットルの三角フラスコに1パーセントグルコースと1ミリリットルあたり5マイクログラムのクロラムフェニコールを含むM17ブロス中の凍結グリセロールストックからインジケーター株の5ミリリットルの一晩培養物を準備します。30°Cを振らずにインキュベートします。翌日、GM17培地をブランクとして使用して外径を測定し、新しいフラスコに5ミリリットルの新鮮な培地を加えます。0.1に等しいOD600に接種し、インキュベーションを続けます。2時間後、値が0.4〜0.6に達するまで、ODを一定の間隔で測定します。次に、プレカルチャーを氷の上に置いて保管します。ガラス製培地ボトルに4.5グラムの寒天を量り、1.5パーセントの寒天を作ります。300ミリリットルの二重蒸留水を加え、次に混合してオートクレーブします。300ミリリットルの二重蒸留水とオートクレーブに2 x M17ブロスを準備します。1ミリリットルのラクトコッカス・ラクティス前培養液を、1ミリリットルあたり10マイクログラムのクロラムフェニコールと2パーセントのグルコースを含む25ミリリットルの2 x M17ブロスに加えます。次に、25ミリリットルのぬるま湯入り寒天ミックスを加え、大きなシャーレに溶液を注ぎます。無菌状態を保ちながら、プレートを10〜15分間乾燥させます。次に、ガラスパスツールピペットの端を炎で滅菌しますピペットが冷えたら、その広い端を使用して固化した寒天に穴を開けます。各サンプルのペトリ皿の底部に対応する穴の位置の隣にラベルを付けます。活性アッセイのために、大腸菌生産培養物の1ミリリットルのサンプルを採取し、残りの培地を吸引し、ピペッティングによって500マイクロリットルのリン酸ナトリウム緩衝液に細胞ペレットを再懸濁する7,000×gでそれらを遠心分離します。次に、ソニケータープローブの先端を細胞懸濁液に浸すことにより、サンプルを氷上で超音波処理します。超音波処理を開始します。次に、細胞溶解物を13, 000 x gで10分間遠心分離し、細胞破片をペレット化します。上清を氷上の新しい反応チューブに移します。上清を、採取した細胞密度に対して0.6に等しいOD 600の1ミリリットルに希釈して正規化し、リン酸ナトリウム緩衝液と混合物で溶解します。抗菌活性をテストするには、正規化されたサンプルの40マイクロリットルをインジケーター寒天の指定された穴に追加します。すべてのサンプルが寒天に拡散するまで待ちます。プレートを摂氏30度で一晩インキュベートします。翌日、フラットベッドスキャナーまたはデジタルカメラを使用して寒天プレートの写真を撮ります。成長阻害ハローサイズは、手作業またはソフトウェアを使用して測定できます。蛍光顕微鏡法では、DMSO中に10ミリモルのナイルレッドストック溶液を調製します。活性アッセイでは、指示株をOD 600に1に等しいように培養します。1ミリリットルの培養物を4°Cおよび5, 000 x gで3分間遠心分離し、その後、上清を廃棄し、サンプルを1ミリリットルのPBSに再懸濁する。その後、サンプルを遠心分離し、再度懸濁します。続いて、1マイクロリットルのナイルレッドストック溶液を加え、穏やかに混ぜます。顕微鏡画像取得には、520ナノメートルで励起しながら、カバースライドに30マイクロリットルの細胞調製物を追加します。取得時間を 0.2 秒、キネティック シリーズを 0.1 ヘルツ、シリーズ長を 200 画像に設定します。次に、0.3〜1.5マイクロリットルの細胞溶解物または精製ペプチドサンプルを添加します。560ナノメートル以上の波長での蛍光発光を監視および記録します。画像シーケンスをaviファイルとして保存し、ImageJで画像を解析します。この図は、プロリン類似体を含む組換え抗菌ペプチドによる細菌指示株の増殖阻害を示しています。寒天溶接拡散アッセイの一環として、サンプル位置の周囲に阻害ハローが見えるようになります。このビデオは、抗菌ペプチドを添加せずにインジケーター株のタイムラプス蛍光顕微鏡法を示しています。時間が経つと、カバースライド上に細菌細胞が沈着し、緩衝液のみが添加されたため、観察から20分以内に細胞の外観は変化しない。この蛍光顕微鏡のタイムラプスは、抗菌ペプチドが指示株の細胞に及ぼす影響を示しています。時間の経過とともに、細菌細胞は、矢印で強調表示されているように、非標準的なアミノ酸である4Rヒドロキシプロリンを含むナイシンバリアントに曝露された後、凝集してぼやけて見えます。円でマークされた光の物質が細胞からバッファーに拡散し、膜断片が動員されたことを示しています。この図は、野生型ナイシンまたは非標準アミノ酸を含有する変異体の存在下における指示株のインキュベーション後の影響を示している。抗菌ペプチドに曝露した後、細菌細胞は円で示されるように凝集します。細胞が溶解することを示すと、矢印で示されているように、細胞の周囲に軽い物質が見えます。ネガティブコントロールとは対照的に、20分間のインキュベーション後には、歪んで凝集した細胞が大量に存在します。一度習得すれば、このテクニックは4日で実行できます。これには、ncAA修飾ペプチドの作製、寒天溶接拡散アッセイおよび蛍光顕微鏡を用いた活性試験が含まれます。この手順を試みる際には、新鮮な細菌培養物と適切な増殖培地を使用し、それらを慎重に取り扱うことを忘れないでください。アクティビティテストでは、常に適切なポジティブコントロールとネガティブコントロールを含めます。この手順に続いて、アフィニティークロマトグラフィーおよび/またはHPLCによるペプチド精製の他の方法を実施することができる。質量分析は、非標準アミノ酸の取り込みを証明するために必須です。開発後、この技術は、研究者が他の抗菌性または微生物宿主をさまざまなペプチドでの生産や抗菌活性の試験に使用できる新しい抗菌ペプチドを探索する道を開きました。このビデオを見れば、非標準アミノ酸を抗菌ペプチドに組み込む方法について十分に理解できるはずです。

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JoVE Journal

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