超音波の利用ガイド生物学的関連性の転移性腫瘍の異種移植片の確立のため組織指示細胞注入

この方法の目標は、前臨床試験のための生物学的に関連性のある癌同所異種移植片を確立することです。患者由来の神経芽腫細胞は、開腹手術や長期の回復を伴わずに、超音波ガイダンスによりマウス副腎に注入されます。この方法は、がん生物学や、腫瘍の進化、天然微小環境および転移における治療応答の研究など、トランスレーショナルリサーチにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。

このような知見は、前臨床試験の信頼性を大幅に向上させ、創薬を促進するでしょう。この技術の主な利点は、患者由来で、組織指向で、効率的で、信頼性の高い状態で、がん治療研究のための同所性ゼノグラフモデルを作成できることです。この手順の重要なステップを実演するのは、シニア技術者でラボマネージャーのSahiti Chukkapalliと、ラボの研究員であるTina Thomasです。

腫瘍解離キットを使用して、腫瘍組織から患者由来のがん細胞懸濁液を1つ生成します。まず、約半グラムの腫瘍組織を、5ミリリットルの酵素添加RPMIバッファーを含む100ミリメートル細胞培養皿に移します。次に、はさみと組織鉗子を使用して、腫瘍を2〜4ミリメートルの小片にミンチします。

腫瘍混合物を解離チューブにピペットで移し、チューブを閉じます。チューブを反転させ、組織解離者のスリーブに取り付け、適切なプログラムを使用して組織を解離します。解離後、腫瘍細胞懸濁液を37°Cの回転ラック上で1時間インキュベートします。

インキュベーション中は15分ごとに細胞懸濁液を粉砕します。インキュベーション後、細胞懸濁液を新しい50ミリリットルの円錐管に移し、10ミリリットルのRPMIを加えます。次に、細胞懸濁液を314gで5分間遠心分離します。

遠心分離後、上清を取り除き、ペレットを5ミリリットルのRPMIに懸濁します。細胞懸濁液を40ミクロンの細胞ストレーナーに通し、濾した溶液を新鮮な50ミリリットルのチューブに集めます。ストレーナーを5ミリリットルのRPMI培地で洗浄した後、細胞懸濁液を314gで5分間遠心分離し、ペレットを回収します。

血球計算盤を使用して細胞をカウントします。次いで、ペレットをRPMIに懸濁して、10マイクロリットル体積当たり5細胞の4倍の最終濃度を得る。この細胞懸濁液を1回の注射で5マイクロリットルを新しいチューブに移し、同じ量の基底膜マトリックスを1回の注入で10マイクロリットルの細胞溶液を作り、氷の上に置きます。

腹部を下にしてマウスをイメージングプラットフォームに移します。イソフルラン麻酔を維持するために、ノーズコーンを取り付けて固定します。脱毛ローションとシェーバーを使用して、適切に麻酔された6〜8週齢の免疫不全NSGマウスの背中と脇腹を脱毛するための移植手順を開始します。

乾燥を防ぐために、動物の目に光学軟膏を塗布します。次に、マウスを所定の位置にテープで固定して、不注意な動きを防ぎます。次に、超音波の視覚化を使用して、マウスの肝臓、大静脈、脾臓、左腎臓、および隣接する左副腎を特定します。

小さな穴の針を取り付けた冷やしたハミルトンシリンジに、10マイクロリットルの細胞溶液をロードします。次に、超音波ガイド下で、冷やした22ゲージのカテーテルを皮膚と背筋から左副腎に直接そっと挿入し、細胞注射用のチャネルを提供しました。針を取り外し、カテーテルを所定の位置に置いておきます。

カテーテルの挿入中に副腎を可視化し、針とその軌跡を可視化することは、周囲の構造や臓器への損傷を最小限に抑え、マウスの罹患率を下げるために不可欠です。次に、副腎の中央に配置されたカテーテルにシリンジを通します。シリンジがカテーテルを通って導かれるとき、カテーテルの安定性を維持し、針が前進するのを見ることが重要です。

針自体はカテーテルの終端から約2ミリメートル伸びており、その位置は超音波で容易に確認できることに注意してください。標的の副腎組織に細胞を注入します。針を1〜2分間そのままにして、基底膜マトリックスを固めます。

基底膜マトリックスが固まったら、ゆっくりと針を取り外し、続いてカテーテルを取り外します。最後に、マウスを回復ケージに入れ、胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまでしてから、ホームケージに戻ります。超音波画像診断は、in vivo腫瘍の進行を監視します。

この画像は、注射の 1 週間後の副腎の超音波画像を示しています。ここでは、注射の1週間後にマウスを注射した神経芽腫の発光イメージングは、腫瘍の生着を示さない測定値を示しています。2週間後、超音波画像検査では腫瘍の生着と約40平方ミリメートルの領域への進行が見られます。

注射後2週間の生物発光は、10から7分の1の輝度を示し、これは細胞の取り込みと腫瘍の成長が超音波所見と相関していることを示唆しています。注射後8週間の超音波画像検査では、100平方ミリメートルを超える面積測定で腫瘍の成長が継続していることが示されました。ここでも、生物発光により、輝度レベルが10から9に増加した超音波所見が確認されました。

腫瘍の3D超音波画像では、当研究室が前臨床治療試験の開始に利用するベースラインである100立方ミリメートルを超える体積が示されました。切除された腫瘍は、サイズが1センチメートルを超える大きさで総的に測定され、超音波測定値および発光信号と相関しています。このメディアは、超音波ガイダンスを利用して、患者由来の神経芽腫細胞を用いた副腎同所性ゼノグラフを成功裏に確立する方法のデモンストレーションを提供します。

この手法を習得すると、適切に実施されれば、1回の注入につき12分以内に行うことができます。