全体のマウントの蛍光抗体法と培養マウス卵巣の卵胞の定量化

シリアルセクショニングせず若いマウスの培養の卵巣内の卵胞を定量化するためのプロトコルを紹介します。全臓器の蛍光抗体法と組織をクリア使用して、、光学セクショニングに置き換えられます物理的な区分します。試料調製及び可視化のこのメソッドでは、オルガンの整合性を維持し、特定のセルの自動定量評価を容易に。

この手順の全体的な目標は、自動卵胞定量化に適合する培養全卵巣の画像を取得することです。この方法は、さまざまな条件が卵巣の適応度をどのように妨げるかなど、生殖生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、労働集約的ではなく、臓器の3次元構造を維持することです。

この方法は、生後5日目のマウス卵巣培養に最適化されていますが、生殖腺胚や若いマウス精巣など、他の年齢や組織にも適用できます。清潔な作業面から始めます。10パーセントの漂白剤で拭き取り、漂白剤を作業エリアの表面に少なくとも5分間残します。

5分後、清潔なペーパータオルと70%のエタノールで余分な漂白剤を取り除きます。70%のエタノールで解剖顕微鏡を完全に洗浄し、乾いたペーパータオルをステージに置きます。きれいな鉗子とはさみを70%エタノールで湿らせたペーパータオルで包みます。

次に、円錐形のチューブに50ミリリットルの卵巣培養培地を作り、摂氏37度の水浴で温めます。培地が温まったら、まず35mmの組織培養プレートに1ミリリットルの卵巣培養培地を加えて、プレートとインサートを準備します。次に、約0.55ミリリットルの培地を24ウェル組織培養プレートのウェルに加え、培地を含む各ウェルにインサートを置きます。

メンブレンがメディアに接触していることを確認します。35mmプレートと24ウェルキャリアプレートを摂氏37度、二酸化炭素5%、大気酸素インキュベーターに入れます。次に、解剖スコープの隣にホットプレートを置き、温度を摂氏37度に設定します。

組織培養インキュベーターが解剖領域の近くにない場合は、卵巣培養培地が入った35mmの組織培養皿の1つをホットプレートに置きます。次に、安楽死させたばかりの女性に70%のエタノールをスプレーし、解剖顕微鏡の下で乾いたペーパータオルの上に置くことから解剖を開始します。腹腔内を切開した後、腸を押し出し、卵巣を見つけます。

卵巣を取り出し、35ミリメートル皿の培地に入れます。卵巣を解剖したら、解剖顕微鏡の倍率を上げて、卵巣と付着した組織をよりよく視覚化します。きれいな細い先端の鉗子で、卵巣を傷つけることなく、滑液包や脂肪組織などの卵巣以外の組織をすべて取り除きます。

次に、卵巣の各ペアをあらかじめ浸した細胞培養インサートに置き、培地の容量を調整して、臓器を完全に沈めることなく湿った状態に保つのに十分であることを確認します。摘出した臓器を摂氏37度、二酸化炭素5%、大気中の酸素インキュベーターに入れます。所望の実験時点で、卵巣培養培地をプレートから取り出し、新たに調製した4%PFA溶液で組織を覆うことにより、培養した卵巣をインサートに固定します。

プレートの端をパラフィンフィルムでシールして蒸発を防ぎ、サンプルを摂氏4度で一晩置きます。70パーセントのエタノールでティッシュを3回すすいでください。その後、70%エタノールを4°Cで充填したシンチレーションバイアルに、さらなる処理まで保存します。

バイアルから70%のエタノールを取り出し、固定組織をPBSで室温で最低4時間振とうしながら洗浄することにより、染色を開始します。PBSを除去した後、卵巣を完全に沈めるのに十分な透過化溶液を追加します。オービタルシェーカーに載せ、室温で4時間インキュベートします。

透過化溶液を、卵巣を完全に沈めるのに十分なブロッキング溶液に交換します。次に、密封されたバイアルを室温でオービタルシェーカーで最低12時間インキュベートします。ブロッキング後、インサートを24ウェルプレートにセットし、約750マイクロリットルの一次抗体溶液を加えて、卵巣が完全に沈むようにします。

次に、密封されたプレートをオービタルシェーカーに置き、室温で4日間インキュベートします。4日後、一次抗体を取り出し、洗浄液をたっぷりと加えます。卵巣を一晩洗います。

翌日、新しい洗浄液と交換し、オービタルシェーカーで2時間以上インキュベートします。洗浄後、二次抗体溶液を添加します。サンプルを光から保護し、オービタルシェーカーで室温で2日間インキュベートします。

2日後、サンプルから二次抗体溶液を取り出し、洗浄液を加えます。まず、ScaleS0クリアリング溶液の準備から始めます。溶液を反転して混合し、摂氏50度で30分間インキュベートします。

ScaleS0クリアリングソリューションのガスを抜きます。次に、免疫染色された卵巣から洗浄液を取り出します。クリアリングソリューションを追加します。

プレートをアルミホイルで覆い、オービタルシェーカーに戻します。染色と透明化のステップでは、辛抱強く待つことが非常に重要です。組織が透明になったら、細い先端のメスを使用して、培養卵巣を含むインサート膜を慎重に取り除きます。

サンプルをスライドガラスの上に置き、カバースリップでサンプルをそっと覆います。次に、光学切片化が可能な顕微鏡でサンプルをイメージングします。この画像は、出生後5日目の卵巣を示していますが、これはクリアされていません。

ここでは、清澄溶液を添加した1時間後に卵巣が示されています。卵巣は、清澄溶液に沈められてから数分以内に半透明になり始めます。培養卵巣を透明化せずに光学的に切片化することは可能ですが、組織の深部にある細胞はバックグラウンドと区別しにくいシグナルを持っているため、適切な卵子の定量が妨げられています。

対照的に、この代表的な画像は、臓器全体の卵子の定量が可能な透明なサンプルを示しています。この手順を試みる際には、抗体が組織全体に拡散する必要があることを覚えておくことが重要です。したがって、組織が厚いほど、インキュベーション時間が長くなります。このビデオを見た後、卵巣全体を培養、染色、および画像化する方法をよく理解しているはずです。

このテキストでは、単純な卵胞の定量化に使用できるフリーソフトウェアであるFiji ImageJの使用について説明しています。パラホルムアルデヒドとアジ化ナトリウムの取り扱いは危険な場合があり、この手順を実行する際には、ドラフトや個人用保護具の使用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。