Name: 全体のマウントの蛍光抗体法と培養マウス卵巣の卵胞の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 学ぶ 培養マウス卵巣の全体マウント蛍光抗体法による卵胞定量化。組織透明化と光学セクションで三次元構造を保持し、自動計測を可能にする生殖生物学の効率的な手法です。

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有用な提案や技術支援、レベッカ ・ ウィリアムズとコーネル BRC イメージングからヨハンナ Dela クルスとアンドリュー Recknagel に感謝します。この作品は国立衛生研究所健康補助金に支えられた (コーネル大学のイメージング施設) に S10 OD018516、J.C.B. に T32HD057854、J.C.S. に R01 GM45415

コーネル大学の制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、議定書 2004-0038 JCS にここでは、記載されているすべてのメソッドを承認しました。
1. 楽器及び培地の調製
<ol><li>ワイプ作業領域 10% の漂白剤できれいにでき、漂白剤を少なくとも 5 分作業エリア表面上に残ります。5 分後に、きれいなペーパー タオルと 70% のエタノール (エタノール) 余分な漂白剤を削除します。きれいに徹底的に 70% で解剖顕微鏡江藤。 注: 作業領域が少なくとも半器官培養の汚染を避けるため無菌であることが重要です。</li>
	<li>70% で湿らせた紙タオルできれいな鉗子、はさみをラップ使用時までエタノール。 注: 理想的な解剖ツールは卵巣の年齢やサイズによって異なります。1 つ鋭いマイクロ解離シザー、2 つファインチップ鉗子 (いずれか 5 または 55 号) を使用して最高の結果が得られますと 1 つマイクロ アイリス シザーを解剖します。</li>
	<li>コニカル チューブ 50 mL 卵巣文化メディアと 37 ° C の水浴の暖かいを確認します。<ol>
<li>子房培養培地4をするためには、補足 10% 胎仔ウシ血清 (FBS)、25 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES)、100 単位/ml ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、0.25 μ g/mL 最小重要な媒体 (MEM) x 1アムホテリシン B (FBS、HEPES、1.25 mL とペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシン B の 100 x の在庫の 0.5 mL と例えばMEM、45 mL、5 mL の熱不活化)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プレートと子房培養前挿入を準備します。<ol>
<li>ティッシュ文化フードの 35 mm の組織培養プレートに卵巣培養液 1 mL を追加します。</li>
		<li>事前ソークは、培養液で膜を挿入します。よく 24 ウェル キャリア組織培養プレートと場所細胞培養に挿入さて、あたり約 0.55 mL、通常十分なメディアを追加します。挿入の膜に触れるメディアであることを確認します。</li>
		<li>35 mm プレートと実験で卵巣の数に従ってセル文化を挿入して井戸の数を準備します。文化メディアと文化メディアと 37 ° C、5% CO2の大気中の O2インキュベーターの挿入を含む 24 ウェル キャリア プレートの 1 つの mL を含む 35 mm プレートを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>郭清範囲の隣のホット プレートを配置し、37 ° C に温度を設定37 ° C、5% CO2を保つため、大気中の O2インキュベーター解剖室に近い。</li>
</ol>2. 卵巣郭清及び器官培養
注: 卵巣は、非理想的な温度への露出が最低限ある限り、室温で切り裂かれます。
<ol><li>1 つずつ斬首で産後 5 日目で雌マウスを安楽死させます。 注: 安楽死は IACUC ガイドライン研究が実行されている施設の存在により実施する必要があります。</li>
	<li>スプレー動物 70 %etoh。解剖顕微鏡の下で乾燥したペーパー タオルの上に動物を配置します。解剖顕微鏡に近い卵巣文化メディアを含む 35 mm の組織培養ディッシュを配置します。</li>
	<li>鉗子や顕微解剖アイリス シザー、腸に切らないように注意を使用して動物の腹腔内に皮膚を切開を行います。腹腔内から腸をプッシュし、卵巣を探します。卵巣を抽出し、培地を含む 35 mm の組織培養皿にそれらを置きます。</li>
	<li>卵巣は、動物から解剖されている、一度卵巣と付属の任意の組織を見やすくために解剖顕微鏡の倍率を増やします。ファインチップ鉗子をきれい、滑液包、脂肪組織など、すべての非卵巣組織を削除します。添付の非卵巣組織を除去するとき、卵巣を壊さないように注意します。</li>
	<li>卵巣が分離されたら、キャリア 24 ウェル プレートの漬け細胞文化挿入ペアを配置 (1.4.2 と 1.4.3 の手順を参照してください) と器官の潤いを保つのに十分であることを確認する媒体のボリュームを調整 (なし完全に水没して)。 注意: は、卵巣を転送するときに細胞培養インサートの膜に穴を突くように注意してください。</li>
	<li>場所は仔 37 ° C、5% CO2の大気中の O2インキュベーターの臓器です。</li>
	<li>2.1 2.6 各動物の卵巣を切除し、細胞培養に配置するまで卵巣培養培地を含む 24 ウェル プレートの挿入手順を繰り返します。</li>
	<li>変更を使用して卵巣培養培地 2 日おきは 37 ° C の水浴から卵巣メディア因数を加温し、目的実験時点でプロトコルのパート 3 に進みます。</li>
</ol>3. ティッシュの固定
<ol><li>15 mL の円錐管にリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) × 1 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を準備 (6 mL の 1x PBS に 16 %pfa 電子顕微鏡グレードの 2 mL の追加など)。 注意: PFA は有害物質で、化学のフードの下で処理する必要があります。</li>
	<li>作りたての 4 %pfa ソリューションと組織を覆うことによって文化の挿入から組織を削除せず培養卵巣を修正します。(蒸発を避けるため) にプラ用接着剤で板の端を密封、4 ° C でサンプルを一晩します。 注: 組織性処理を促進するためにプロシージャ全体でセル文化挿入から卵巣を変位を避けます。チップの表面に付着した培養卵巣処理に有利な損傷臓器を失うことがなく。</li>
	<li>リンス組織 3 x 70 %etoh, いずれかが 4.1 または満ちているシンチレーション バイアルでストアをステップへ進みます 70 %etoh まで 4 ° c をさらに処理します。 注: 内生的組織を用いた場合 70% サンプルを保存の蛍光蛋白質を表現するエタノールを大幅に減らします信号。また、組織を洗浄して、0.2% アジ化ナトリウム (NaN3) と PBS に格納できます。ナン3は、しかし、非常に有毒な深刻な吸入の危険性を提起します。ヒューム フードの原液を行い処理研究室コートとニトリル手袋など適切な保護具を着用します。</li>
</ol>4. 全体のマウント蛍光
<ol><li>4.3 透過ステップ前に 4 h 以上の RT で 1 × PBS で固定ティッシュを置きます。</li>
	<li>透過溶液及びブロッキング溶液を準備します。<ol>
<li>透過ソリューションを準備しています。1 × PBS に 0.2% ポリビニル アルコール (PVA)、0.1% ナトリウム水素化ホウ素 (NaBH4) (から 12 wt.% 14 M 水酸化ナトリウム (NaOH) ソリューションで、ソリューションと 1.5% ポリエチレング リコール-tert-ブチルオクチルフェニル エーテル (非イオン性界面活性剤の洗剤) を追加します。50 mL の円錐管に PBS x 10 の 5 mL、0.1 グラム、PVA、NaBH4の 50 μ L、非イオン性界面活性剤の洗剤の 750 μ L を追加し、超純水を追加 50 mL を水し、混合物がソリューションに完全なるまで室温でよく攪拌します。</li>
		<li>ブロッキング液を準備しています。1 × PBS に 2.5 M グリシン pH 7.4 の洗剤、0.15% 0.1% 非イオン性界面活性剤を追加、10% ヤギ血清、3% ウシ血清アルブミン (BSA)、0.2% ナン3、100 単位/ml ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、0.25 μ g/mL アムホテリシン b. のストック溶液を調製2.5 超純水水 50 mL に 5 g を溶解して純水 500 mL 最終巻 (pH 7.4) にグリシンの 93.8 g と 10% ナン3の原液を溶解することにより M グリシン50 mL の円錐管に 5 mL の 10 x PBS、非イオン性界面活性剤の洗剤、グリシン原液、ヤギ血清、BSA の 1.5 g、ナン3ストック溶液 1 mL の 5 mL の 750 μ L の 50 μ L を追加することによってブロックのソリューションを準備して、、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシン B の 100 x の在庫の 0.5 ml。超純水水 50 mL とシリンジ フィルターの最終巻までに最終的なソリューションを追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>削除しバイアルから 1 × PBS を破棄し、卵巣が完全に水没する十分な透過ソリューションを追加します。室温で 4 h 用のシェーカー (例えばnutator) を軌道上で透過ソリューションにサンプルを配置します。 注: インキュベーション時間は、臓器の厚さに応じて異なる場合があります。</li>
	<li>卵巣が完全に水没する十分なブロッキング液で透過ソリューションを置き換えます。プラスチック接着剤でバイアルを密封し、軌道のシェーカーで室温で 12 時間以上培養組織を残します。</li>
	<li>メーカーのデータシートに従ってブロッキング液で一次抗体希釈を準備します。 注意: すべての抗体が決済エージェントと互換性があります。サンプルごとに必要な平均ボリュームは、約 750 μ L です。<ol>
<li>卵母細胞定量用 TAp63 (核卵母細胞マーカー)、mvh 遺伝子 (細胞の生殖細胞マーカー)。 注: 蛍光画像で使用される抗体は、マウス抗 p63 とウサギ抗-mvh 遺伝子)。第一抗体溶解液は再利用 2 をすることができます x 以上の汚損のプロトコル間の 4 ° C で保存および細菌の成長を避けるために正しく処理される場合。</li>
	</ol>
</li>
	<li>24 ウェル プレートで組織を含む挿入を置き、一次抗体溶液の約 750 μ L を追加します。卵巣が完全に水中に沈むことを確認します。蒸発を最小限に抑え、軌道シェーカーで室温で 4 日間の培養組織を残すプラスチック接着剤で板をシールします。</li>
	<li>洗浄液を準備します。<ol>
<li>洗濯ソリューションを準備しています。1 x PBS を作る 0.2 %pva と 0.15% 非イオン界面活性剤の洗剤を追加します。50 mL の円錐管に 5 mL の PBS x 10、PVA の 0.1 g、非イオン性界面活性剤の洗剤と純水 50 mL の最終巻までの 75 μ L を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>一次抗体の希釈を削除し、洗浄液の寛大な量を追加します。常に卵巣が水没することを確認します。軌道のシェーカーで室温で一晩溶液中浸漬する卵巣を許可します。</li>
	<li>洗浄液を交換し、2 h 以上の軌道のシェーカーで孵化させなさい。</li>
	<li>4.9 の手順を繰り返して 1 つの追加の時間。</li>
	<li>ソリューションをブロックで二次抗体希釈を準備します。 注: 使用される二次抗体、抗マウス 488 の蛍光色素は、ヤギとヤギで発生した反ウサギ 594 蛍光染料で発生します。4.5 の手順を参照してください。平均ボリュームのサンプルごとに必要です。</li>
	<li>洗濯ソリューションを卵巣から削除し、二次抗体溶液を追加します。光 (アルミ箔ラップ プレート) からサンプルを保護し、蒸発を最小限に抑えるためのプラスチック接着剤で板をシールします。2 日間室温で軌道シェーカーでサンプルをインキュベートします。 注: その後インキュベーションのすべての手順の中にアルミ箔を使用して光からサンプルを保護を続行します。</li>
	<li>サンプルから二次抗体溶液を削除し、洗浄液を追加します。8 h の軌道シェーカーで孵化させなさい。 注: 4, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 染色が必要な場合は、最初の洗浄のステップ (~ 8 時間培養) に DAPI の 50 ng/mL を追加します。</li>
	<li>一晩洗浄の洗浄ソリューションを取り付けます。</li>
	<li>準備中にクリア ソリューション (セクション 5 を参照) で、洗浄液の新鮮な一晩を置き換えるし、軌道のシェーカーでサンプルを室温で維持します。</li>
</ol>5. 卵巣クリアとイメージング
<ol><li>クリア ソリューション ScaleS(0) を準備します。<ol>
<li>ScaleS(0) 指定された割合で試薬を追加することによってソリューションの10をクリアの準備: 40 %d-(-) ソルビトール (w/v)、20% ジメチルスルホキシド (DMSO)、4.3 M 尿素 10% グリセリン pH 8.1 (例えば50 mL の円錐管にグリセリン、ソルビトールの 10 g の 2.5 mL を追加、DMSO、5 mL と 25 mL の容量のための 9 M の尿素の 12 mL。30 分間 50 ° c のインバージョンによるソリューションをミックスし、使用前にガス抜き)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>洗濯ソリューションを削除し、ソリューションをクリアするにサンプルが水没します。良い結果を得るのため、軌道シェーカーでサンプルを維持します。</li>
	<li>クリア ソリューション 2 を置き換える × 毎日ティッシュになる透明な (約 2 日) まで。</li>
	<li>組織がクリアされると、罰金と培養の卵巣を含む挿入膜を慎重に外してイメージングのためのサンプルを準備チップ メスとスライド ガラスのサンプルを載せています。</li>
	<li>イメージングの光学断面のできる顕微鏡のサンプルに進みます。</li>
</ol>6. 卵の定量化
注: セルを定量化することができる多くの異なった計算機プログラムがあります。下記は、フィジー ImageJ14非商用画像処理パッケージを使用して卵の定量化のためのプロトコルです。
<ol><li>イメージのドロップダウン リストに [種類]黒と白 8 ビット イメージにイメージを変換 (DAPI チャネル) なし興味の特定の細胞マーカーのz-スタック画像シリーズのフラットな最大強度投影を使用して、メニュー。</li>
	<li>画像のドロップ ダウン メニューの下で調整タブをハイライト表示し、しきい値を選択します。</li>
	<li>それぞれの個々 の卵母細胞を識別するレベルにしきい値を手動で調整するには。一度レベルを決定すると、黒と白のイメージを生成する適用をクリックします。完了すると、視線は楕円形またはフリーハンドのアイコンを使用してサンプルを定量化します。 注: フィジー ImageJ 粒子定量化に使用されるイメージを微調整する別のオプションがあります。例えば、プロセスの |バイナリ] タブで、どのようなカウントされますの検出を改善するために使用できるさまざまなオプションがあります。図 4、良い卵胞を個別に使用するオプションは、浸食、続いて穴を埋めると最後に流域だった。</li>
	<li>分析のドロップ ダウン メニューで、[分析粒子を選択します。目的の解像度によるとパラメーターを設定します。</li>
</ol>

<ol><li>O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Revised+Protocol+for+In+Vitro+Development+of+Mouse+Oocytes+from+Primordial+Follicles+Dramatically+Improves+Their+Developmental+Competence%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence.</a> Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li>
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<li>Laronda, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioprosthetic+ovary+created+using+3D+printed+microporous+scaffolds+restores+ovarian+function+in+sterilized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice.</a> Nature Communications. 8, ncomms15261 (2017).</li>
</ol>

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哺乳類の生殖に関する研究では、細胞培養に日常的に従順ではない特殊な細胞を定量化して、必要があります。ただし、体外培養システムは、卵巣と卵胞の生存率1,15を維持に効果的です。子房培養中に組織拡散を介して栄養素の交換のため表面積が必要です。したがって、5 日間の古いマウス卵巣のサイズが理想的との器官培養形状します。文化では、7 日間のために維持の卵巣をこのプロトコルを最適化した、特定の科学的な質問1,4によると卵巣文化長さを調整できます。わずか 3 日間の培養と 10 日 (データは示されていない)、限り卵巣でも 10 日間は大きく、文化として有効ですが、プロトコルの制限をこのように強調表示ではないかもしれないより古い動物から卵巣と同等の結果を実現しています。
前のヴィヴォ卵巣の培養が必要でない場合を修正し、変更はよ...

細胞構成と哺乳類の卵巣の形態学的特徴を研究するために科学者はしばしば免疫組織学的染色パラフィン埋め込まれた卵巣の続く生体内で実験に依存します。もっと最近しかし、完全な卵巣器官培養が技術することができますより良い可視化と結合するために卵巣機能1,2,3、4を勉強する効果的な代替であると証明し、数量化ツールです。伝統的に、卵巣の形態解析パラフィン埋め込まれた連続切片から、骨の折れる、時間がかかり、連続パラフィン埋め込まれたティッシュの区分であることに加えて再構築の三次元の卵巣アーキテクチャによって異なりますオルガンのない保証の適切な再建をしないとセクションがしばしば紛失またはプロセスで注文ミス。
シリアルセクショニングに関連する技術的な課題に加えて、日常的に卵巣5,6あたりの卵胞数を定量化するために使用方法の変化もあります。現在使用されている方法論的変動研究5,7を越え卵巣予備のメタ分析を損ないます。たとえば、異なる研究論文から卵胞数 10 倍以上特定のひずみ6内と同様の発達年齢間によって異なります。報告された卵胞定量化にこれらの大きな違いは混乱を招く可能性し、クロス研究比較を妨げています。セクションのあらかじめ定義された数の卵胞をカウントすることによって連続切片から卵胞定量化への従来のアプローチを実行する実験的に (例えば、すべての 5 番目、10 番目、または他のセクション)。このアプローチを使用して卵胞数の変動は、切片厚で連続切片5,6を生成する際に技術的な経験だけでなく、セクションはカウント、周期性変化からもを発生します。その変動に加え伝統的なティッシュの別の欠点は、若い動物から小さな卵巣の断面が特に挑戦的な組織向き8に大きく依存することです。
以下のプロトコルは日常的に使用される卵巣文化技術1を記述しますが、クリア組織の物理的な区分および共焦点顕微鏡8 を用いた光学セクショニングを置き換えることによって伝統的な卵胞の定量化に大幅に向上 ,9。クリアで、尿素およびソルビトール ベース組織浸漬 (経頭蓋灌流または電気泳動なし) を使用してソリューションを (例えば、 ScaleS(0)10)、免疫染色と互換性があることを証明し、の減少のため許可イメージングの深さを損なうことがなく時間をクリアします。その他の報告の方法 (例えばScaleA28,10、SeeDB11、ClearT12、および ClearT212) より多くの時間がかかるまたはサンプルの詳細な光学解像度を許可しません。光の断面は、以下の労働集約型であり臓器の三次元アーキテクチャ7、8を保持ため便利です。このアプローチの別の利点は、サンプルの準備組織をクリアする高価な試薬を必要としない比較的容易に行うことができます。
具体的には、説明されたプロトコルは生後 5 日目の培養マウス卵巣に最適化されていますが、生後 0 - 10 から卵巣を実施しました。メソッドでは、組織が自然にそれが培養、臓器処理や操作を促進する膜につく卵巣培養系。説明文化システムは、explanted 卵巣 10 日間までとどのように異なる実験条件を評価するためには、卵母細胞生存13を妨げる可能性を維持するために使用できます。定量化手順処理パッケージ フィジー ImageJ14非商用画像を使用してされるので、ほとんどのパーソナル コンピューターで行うことができます。さらに、将来のメタ分析することができます、科学的なコミュニティのため、定量化に使用するイメージを広く利用可能にすることができます。

<table><tbody><tr><td>マイクロ解剖はさみ 4.5インチ、まっすぐで鋭い点</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>マイクロ解剖はさみ</td></tr><tr><td>ジュエラーズスタイルの鉗子 4-3/8インチ、スタイル 5</td><td>インテグラ ミルテックス</td><td>17-305X</td><td>細い先端の鉗子</td></tr><tr><td>マイクロアイリスはさみ 4インチ、まっすぐで鋭い点</td><td>インテグラ ミルテックス</td><td>18-1618</td><td>マイクロ解剖虹彩はさみまたはマイクロ解剖スプリングはさみ</td></tr><tr><td>1X ミニマルエッセンシャルメディア (MEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serium</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Step 1.3.1</td></tr><tr><td>35mm Tissue Culture Treated Dish</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade;細胞培養インサート用24ウェルキャリアプレート</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>141006</td><td>細孔サイズ:8&mu;m</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>16% solution</td></tr><tr><td>1X Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Nutator mixer GyroTwister&trade;</td><td>Labnet</td><td>S1000-A-B</td><td>三次元シェーカー</td></tr><tr><td>正常なヤギの血清</td><td>VWR</td><td>103219-578</td><td></td></tr><tr><td>牛の血清卵白(BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム(NaN3)</td><td>ΣΣAldrich</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>水素化ホウ素ナトリウムの解決(NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452904-25ML</td> 解決を<td>、使用しない錠剤または粉末の形態&nbsp;</td></tr><tr><td>ポリビニルアルコール(PVA)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P8136-250G</td><td>冷水溶</td></tr><tr><td>性トリトン&貿易;X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><td>ポリエチレングリコール tert-octylphenyl エーテル</td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>725-2520</td><td>25mm</td></tr><tr><td>10mL シリンジ</td><td>BD</td><td>309695</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗 p63 抗体 (4A4)</td><td>Biocare Medical</td><td>CM 163A</td><td>希釈率 1:500</td></tr><tr><td>ウサギ抗 MVH 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab13840</td><td>希釈率 1:600</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; ヤギ抗マウス 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11032</td><td>希釈率 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; ヤギ抗ウサギ 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>希釈率 1:1000</td></tr><tr><td>4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)ソルビトール&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240850-100G</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>FIJI-ImageJ</td><td></td><td></td><td>画像処理ソフトウェア</td></tr><tr><td>使い捨てプラスチック転写ピペット</td><td>VWR</td><td>414044-034</td><td></td></tr></tbody></table>

全体のマウントの蛍光抗体法と培養マウス卵巣の卵胞の定量化

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

哺乳類の生殖生物学の分野の研究は、卵巣と精巣の全体的なヘルスを評価をしばしば伴います。具体的には、女性の卵巣のフィットネス頻繁の可視化と定量化卵胞と卵子によって評価されます。卵巣は、不透明な三次元組織は、従来のアプローチは苦心して全体の臓器中の細胞を可視化するために数多くのシリアル セクションにティッシュをスライスを必要です。さらに、このメソッドによって定量化は通常卵のおおよその直径で区切られたセクションのサブセットのみを得点を伴う、ので、不正確になりやすいです。ここでは、プロトコルは、全臓器組織の清算とマウス卵巣卵胞と卵子を視覚化するための免疫蛍光染色を代わりに利用した、説明します。伝統的なアプローチと比較して、このプロトコルは多くの理由で卵巣内の細胞を可視化するため有利である: 1) 卵巣試料調製及び処理全体はそのままセクションすることは困難である 2) 小さな卵巣は容易に調べることができます。3) 携帯電話の数量化をより容易にかつ正確に達成します。・ 4) イメージ全体の器官。

このプロトコルには、六つの主要なステップが含まれている次の卵巣の解剖図 1で説明したよう。図 2, 図 3, 図 4卵巣及びフィジー ImageJ を用いた全ティッシュ卵定量化のクリア組織の最適化を含むこのプロトコルの最も斬新な機能を強調表示します。図 2 aは、卵巣へ追加クリア ソリューション (は右) 後 (左) 前に、の教養 5 日生後固定卵巣と 1 h の画像を示しています。卵巣は、ソリューションをクリアで水没することの数分以内に半透明になるに開始されます。一度クリア、<strong class="xf...

シリアルセクショニングせず若いマウスの培養の卵巣内の卵胞を定量化するためのプロトコルを紹介します。全臓器の蛍光抗体法と組織をクリア使用して、、光学セクショニングに置き換えられます物理的な区分します。試料調製及び可視化のこのメソッドでは、オルガンの整合性を維持し、特定のセルの自動定量評価を容易に。

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

この手順の全体的な目標は、自動卵胞定量化に適合する培養全卵巣の画像を取得することです。この方法は、さまざまな条件が卵巣の適応度をどのように妨げるかなど、生殖生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、労働集約的ではなく、臓器の3次元構造を維持することです。この方法は、生後5日目のマウス卵巣培養に最適化されていますが、生殖腺胚や若いマウス精巣など、他の年齢や組織にも適用できます。清潔な作業面から始めます。10パーセントの漂白剤で拭き取り、漂白剤を作業エリアの表面に少なくとも5分間残します。5分後、清潔なペーパータオルと70%のエタノールで余分な漂白剤を取り除きます。70%のエタノールで解剖顕微鏡を完全に洗浄し、乾いたペーパータオルをステージに置きます。きれいな鉗子とはさみを70%エタノールで湿らせたペーパータオルで包みます。次に、円錐形のチューブに50ミリリットルの卵巣培養培地を作り、摂氏37度の水浴で温めます。培地が温まったら、まず35mmの組織培養プレートに1ミリリットルの卵巣培養培地を加えて、プレートとインサートを準備します。次に、約0.55ミリリットルの培地を24ウェル組織培養プレートのウェルに加え、培地を含む各ウェルにインサートを置きます。メンブレンがメディアに接触していることを確認します。35mmプレートと24ウェルキャリアプレートを摂氏37度、二酸化炭素5%、大気酸素インキュベーターに入れます。次に、解剖スコープの隣にホットプレートを置き、温度を摂氏37度に設定します。組織培養インキュベーターが解剖領域の近くにない場合は、卵巣培養培地が入った35mmの組織培養皿の1つをホットプレートに置きます。次に、安楽死させたばかりの女性に70%のエタノールをスプレーし、解剖顕微鏡の下で乾いたペーパータオルの上に置くことから解剖を開始します。腹腔内を切開した後、腸を押し出し、卵巣を見つけます。卵巣を取り出し、35ミリメートル皿の培地に入れます。卵巣を解剖したら、解剖顕微鏡の倍率を上げて、卵巣と付着した組織をよりよく視覚化します。きれいな細い先端の鉗子で、卵巣を傷つけることなく、滑液包や脂肪組織などの卵巣以外の組織をすべて取り除きます。次に、卵巣の各ペアをあらかじめ浸した細胞培養インサートに置き、培地の容量を調整して、臓器を完全に沈めることなく湿った状態に保つのに十分であることを確認します。摘出した臓器を摂氏37度、二酸化炭素5%、大気中の酸素インキュベーターに入れます。所望の実験時点で、卵巣培養培地をプレートから取り出し、新たに調製した4%PFA溶液で組織を覆うことにより、培養した卵巣をインサートに固定します。プレートの端をパラフィンフィルムでシールして蒸発を防ぎ、サンプルを摂氏4度で一晩置きます。70パーセントのエタノールでティッシュを3回すすいでください。その後、70%エタノールを4°Cで充填したシンチレーションバイアルに、さらなる処理まで保存します。バイアルから70%のエタノールを取り出し、固定組織をPBSで室温で最低4時間振とうしながら洗浄することにより、染色を開始します。PBSを除去した後、卵巣を完全に沈めるのに十分な透過化溶液を追加します。オービタルシェーカーに載せ、室温で4時間インキュベートします。透過化溶液を、卵巣を完全に沈めるのに十分なブロッキング溶液に交換します。次に、密封されたバイアルを室温でオービタルシェーカーで最低12時間インキュベートします。ブロッキング後、インサートを24ウェルプレートにセットし、約750マイクロリットルの一次抗体溶液を加えて、卵巣が完全に沈むようにします。次に、密封されたプレートをオービタルシェーカーに置き、室温で4日間インキュベートします。4日後、一次抗体を取り出し、洗浄液をたっぷりと加えます。卵巣を一晩洗います。翌日、新しい洗浄液と交換し、オービタルシェーカーで2時間以上インキュベートします。洗浄後、二次抗体溶液を添加します。サンプルを光から保護し、オービタルシェーカーで室温で2日間インキュベートします。2日後、サンプルから二次抗体溶液を取り出し、洗浄液を加えます。まず、ScaleS0クリアリング溶液の準備から始めます。溶液を反転して混合し、摂氏50度で30分間インキュベートします。ScaleS0クリアリングソリューションのガスを抜きます。次に、免疫染色された卵巣から洗浄液を取り出します。クリアリングソリューションを追加します。プレートをアルミホイルで覆い、オービタルシェーカーに戻します。染色と透明化のステップでは、辛抱強く待つことが非常に重要です。組織が透明になったら、細い先端のメスを使用して、培養卵巣を含むインサート膜を慎重に取り除きます。サンプルをスライドガラスの上に置き、カバースリップでサンプルをそっと覆います。次に、光学切片化が可能な顕微鏡でサンプルをイメージングします。この画像は、出生後5日目の卵巣を示していますが、これはクリアされていません。ここでは、清澄溶液を添加した1時間後に卵巣が示されています。卵巣は、清澄溶液に沈められてから数分以内に半透明になり始めます。培養卵巣を透明化せずに光学的に切片化することは可能ですが、組織の深部にある細胞はバックグラウンドと区別しにくいシグナルを持っているため、適切な卵子の定量が妨げられています。対照的に、この代表的な画像は、臓器全体の卵子の定量が可能な透明なサンプルを示しています。この手順を試みる際には、抗体が組織全体に拡散する必要があることを覚えておくことが重要です。したがって、組織が厚いほど、インキュベーション時間が長くなります。このビデオを見た後、卵巣全体を培養、染色、および画像化する方法をよく理解しているはずです。このテキストでは、単純な卵胞の定量化に使用できるフリーソフトウェアであるFiji ImageJの使用について説明しています。パラホルムアルデヒドとアジ化ナトリウムの取り扱いは危険な場合があり、この手順を実行する際には、ドラフトや個人用保護具の使用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

whole-mount-immunofluorescence-follicle-quantification-cultured-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このプロトコルは、新生児マウスと思春期前のマウスからの個々の卵胞から卵巣を使って、マウスの卵巣組織の初代培養/共培養を説明しています。培養技術は、卵巣上の外因性薬剤の効果の研究を可能にする、高度に生理的な方法で開発を支援し、卵胞の間の相互作用の。...

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卵巣の組織培養卵胞開発、排卵や卵胞閉鎖のモデルとして使用することができ、卵巣の動的過程の制御機構を示します。...

「マウス卵巣における現象を可視化する卵巣の組織培養

ここでは、固定マウス卵巣組織の正確な卵胞数を計算するための2つの異なる技術について説明し、比較し、対比する。...

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ここでは、ホールマウント免疫染色、多光子顕微鏡、および3D可視化および分析を使用した定量的および定性的な分析のために、卵巣全体をイメージングするための最適化されたプロトコルを紹介します。このプロトコルは、毒物学、臨床診断、および卵巣機能のゲノムアッセイに適用可能な、高スループットで信頼性が高く、再現性のある処理に対応します。...

マウスの発達中の卵巣保護区の定量的3D分析のための全卵巣免疫蛍光、クリアリング、および多光子顕微鏡

ここで説明するプロトコルは、転写因子の最小セットの過剰発現によるマウス胚性線維芽細胞における造血プログラムの誘導を詳述しています。この技術は、造血、血液疾患、造血幹細胞移植の将来の研究のためのプラットフォームを提供するために、人間のシステムに変換される可能性があります。...

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

我々は、マウスウォルフ管（WD）の単離および培養のための方法を提示します。また、蛍光タグ付けされた抗体を用いて培養/単離されたばかりのWDSのホールマウント免疫染色のための詳細な手順を示しています。一緒に、これらの技術は、WDの開発、コイリング、および分化の研究を可能にします。...

器官培養とマウスウォルフダクトの全マウント免疫蛍光染色

繊毛の開発は適切な器官形成に不可欠です。このプロトコルでは、ラベルを付けると、ゼブラフィッシュの繊毛細胞を可視化する最適化されたメソッドについて説明します。...

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

このプロトコルでは、シロイヌナズナの花と...

全体マウント クリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色

ここでは、全体のマウント蛍光マウス初期胚のイメージに基づく定量的容積測定分析のためのプロトコルについて述べる.定性的と定量的開発時に心臓の構造を評価し、他の器官に広く適応可能があることを提案する強力な方法としてこのテクニックを紹介します。...

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

ショウジョウバエ卵巣は、幹細胞ニッチの開発を研究するためのエクセレント モデル...

郭清およびショウジョウバエ蛹卵巣の汚損

学ぶ 培養マウス卵巣の全体マウント蛍光抗体法による卵胞定量化。組織透明化と光学セクションで三次元構造を保持し、自動計測を可能にする生殖生物学の効率的な手法です。

全体のマウントの蛍光抗体法と培養マウス卵巣の卵胞の定量化

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