リポ多糖の腸粘膜バリアー違反の後微生物由来製品の入り口を模倣するマウスに注射

この実験の全体的な目標は、腸のバリアが破られた後の微生物由来製品の侵入を模倣するモデルを提示することです。このモデルは、微生物の侵入後の免疫応答を調べるために使用できます。この方法は、腸上皮透過性の増加を特徴とする制御不能な炎症など、炎症性腸疾患分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、定義されたポンプを使用するだけでなく、手術を必要とせず、あらゆる実験室環境で使用できる単純なアプローチであることです。この手順を実演するのは、私とポスドクのRachel Mak'Anyengo、博士課程の学生であるBerna Kayaです。マウスを優しく、しかししっかりと扱い、片手で動物を拘束します。

マウスがしっかりと保持され、正常に呼吸できることを確認してください。マウスの鼻を床に向かって少し傾けて、注射のために腹部を露出させます。腹部の正中線の位置を特定し、左下または右側に必要な量のLPSを注入します。

誤注入を避けるために、針が腹腔に入るようにすることが非常に重要です。また、内臓の損傷を避けるために、針が腹腔に深く入りすぎないようにする必要があります。動物を家のケージにそっと戻します。

注射時およびその後2時間ごとに8時間、エンドトキセス血症の発生と重症度についてマウスを監視します。.観察結果を添付のスコアシートに記録します。1.4 mmのセラミック球をあらかじめ充填した2 mmのチューブに、1 m1 mLのシングルステップRNA単離試薬を加えて、コレクションチューブを調製します。

マウスを安楽死させて放血した後、はさみを使用して皮膚と筋肉層を切断し、腹腔と内臓を露出させます。脾臓、肝臓、結腸を慎重に解剖します。各臓器の脂肪をきれいにしてから、氷の上にPBSを置きます。

次に、ハサミまたはメスを使用して、各臓器から0.5センチメートルの長さのピースを切り取ります。紙ティッシュペーパーで組織を短時間乾燥させ、採取チューブに入れて、RNA単離試薬に完全に浸されていることを確認します。次に、高速ベンチトップホモジナイザーで組織を均質化します。

脾臓、肝臓、結腸などの軟組織の場合は、1サイクルの均質化を高速で30秒間使用します。均質化後、サンプルを室温で5分間インキュベートします。チューブを液体窒素に慎重に浸して、組織溶解液をスナップフリーズします。

急速凍結したライセートは、RNAが単離されるまでマイナス80°Cで保存してください。凍結組織ライセートを氷上で解凍することにより、RNAの単離を開始します。解凍後、サンプルをGの1000倍で摂氏4度で5分間遠心分離し、残っている可能性のある残りの組織粒子をペレット

遠心分離後、上清をヌクレアーゼフリーの新しい1.5ミリリットルチューブに移し、RNA単離試薬1ミリリットルあたり200マイクロリットルの氷冷クロロホルムを追加します。すぐにグリッシーを10〜15秒間振ってください。室温で2〜3分間サンプルをインキュベートした後、摂氏4度で15分間Gの12,000倍で遠心分離します。

サンプルには、下部赤色フェノールクロロホルム相、中間相、および上部無色の水相の3つの相が含まれます。RNAを含む上部水相を採取し、ヌクレアーゼフリーの新しい1.5ミリリットルチューブに移します。RNAを沈殿させるには、RNA単離試薬1ミリリットルあたり0.5ミリリットルの氷冷イソプロパノールを加え、チューブを5〜6回反転させて穏やかに混合します。

室温で10〜15分間インキュベートした後、摂氏4度で10分間Gの12,000倍で遠心分離します。遠心分離後、ペレットを乱さずにイソプロパノールを含む上清を完全に除去します。次に、最初の溶解に使用したRNA単離試薬1ミリリットルあたり1ミリリットルの氷冷75%エタノールでペレットを洗浄し、サンプルを短時間ボルテックスします。

サンプルを7500または12, 000倍Gで摂氏4度で5分間遠心分離した後、ペレットを乱さずに上清を完全に除去します。開いたチューブをケミカルフードの下に3〜5分間放置し、RNAペレットを室温で風乾します。次に、RNAペレットを20〜50マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に、ピペッティングで慎重に上下させて溶解します。

次に、サンプルを摂氏55度で10〜15分間インキュベートして、RNAの溶液をさらに改善します。最初にヌクレアーゼフリーの水を最大10マイクログラムのRNAに加えて、汚染されたDNAを消化し、バッファーと酵素を添加した後の最終容量が50マイクロリットルになるようにします。次に、サンプルごとに5マイクロリットルの10X DNase 1バッファーと1マイクロリットルの組換えDNase 1を加え、ピペッティングで上下させて穏やかに混合します。

摂氏37度で20〜30分間インキュベートします。インキュベーション後、活性化試薬でDNaseをボルテックスし、サンプルに5マイクロリットルを加えてよく混合します。室温で5分間インキュベートし、時々手で混合します。

10, 000倍Gで1分半遠心分離した後、DNAフリーRNAを含む上清を新しいヌクレアーゼフリーチューブに移します。最後に、分光光度計でRNAの濃度と品質を測定します。LPSの注射後、動物の外観と活動、目の開き方、呼吸数と質の評価を含む疾患スコアを、X軸の時間に対してY軸にプロットしました。

サイトカイン発現を定量するためのQPCRでは、LPSを脾臓と結腸に注射してから2時間後、肝臓にIl6を注入してから4時間後にピークに達することが明らかになりました。Il1 β、Tnf α、および Il10 の発現は、すべての組織で注射の 4 時間後にピークに達しました。8時間以内に、Il6、Il1ベータ、Tnfアルファ、およびIl10の発現はベースラインレベルに戻りました。

手順を試行する際には、LPSの投与量、マウスの衛生状態、実験終了の時点、そして最も重要なのは、マウス系統の遺伝的背景を考慮することを忘れないでください。このビデオを見れば、バリア突破後に細菌由来の化合物が宿主に入る方法を模倣する方法を十分に理解できるはずです。マウスに系統的に注射されたLPSの低致死用量は、炎症誘発性サイトカインのアップレギュレーションを誘導し、これはRGQ PCR分析によって定量されます。