Name: 人間から退化的な Tenocyte を取得するためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学ぶ ヒトの退行性テノサイトを外側上顆炎手術中に採取し培養する方法。組織学的・免疫細胞化学的分析により腱症の病態と治療法開発の基礎を解明する貴重なプロトコルです。

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本研究は、技術研究開発プロジェクトを通じて、韓国保健産業開発研究所 (KHIDI)、韓国の福祉・厚生省によって資金を供給された韓国医療からの助成金によって支えられた (許可番号: HI16C1559)。

ヘルシンキ宣言に従ってプロトコルを行いプロトコルは CHA 盆唐医療センター制度検討委員会によって承認されました。
1 患者から変性腱組織の収穫
<ol><li>医療の歴史を物理的な検査所見を使用してによって外側上顆炎の診断: 外側上顆; 近くに腱の起源上の圧痛手首関節の抵抗の拡張により誘発される痛み。</li>
	<li>次の基準を使用して: 18 歳以上の;6 ヵ月以上の外側上顆炎の歴史非手術治療の難少なくとも 3 カ月を過ぎたコルチコステロイド、多血小板血漿、またはボツリヌス毒素の注射</li>
	<li>次の除外: 妊娠中の女性。頚椎疾患、肘関節炎、リウマチ性疾患、肘、周辺神経のわなに掛ける事の症候群; 手術の既往がある患者患者の組織に寄付することを拒否します。</li>
	<li>
手術手技 注:図 124を参照してください。<ol>
<li>イソフルランと気管内挿管による全身麻酔後テーブルに腕を置いて、止血します。腕全体と無菌手術シートとドレープに betadine エージェントを適用します。</li>
		<li>第 15 手術用メス刃だけ前外側上顆と関節のレベルに近位で 3-5 cm 切開外側肘を公開します。</li>
		<li>視覚的に伸尺橈側手根筋 (実験) および伸筋腱膜インターフェイスを識別し、分割切開 2-3 mm は、識別されたインターフェイスで第 15 手術用メス刃を持つ ECRL と伸筋腱の間の深度。</li>
		<li>以下病的伸尺橈側手根筋ブレビス (ECRB) 起源をもたらす視界に直接前方に, 実験を抽出します。</li>
		<li>その特徴的な鈍い灰色色によって病理学的変性組織と通常浮腫と砕けやすい組織を視覚的に識別します。</li>
		<li>識別後、慎重に鋭く号 15 手術メスとミニ ブレードを使用してすべての変性組織を切除します。</li>
		<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) にすぐに (約 1 cm3) 切除組織を埋め込み、約 10 mL の PBS に慎重に腱組織を除くすべての周囲の組織をできるだけ早く削除します。</li>
		<li>外側上顆の骨性外骨腫症症例、外骨腫、rongeur を使用してを削除して、やすりで滑らか。複数のドリル穴を作る (直径 1.6 mm、約 6-8 穴) 血管供給を強化する前外側顆で。これはオプションです。</li>
		<li>層非吸収性縫合糸を使用して傷を閉じます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
健康管理 tenocyte
	<ol>
<li>前十字靱帯再建時に自動ハムスト リングや自動膝蓋骨腱の残りの腱から健康線を入手して次の実験25のコントロールとして使用します。 注: 本研究で使用されるサンプル数は各グループで 3 つでした。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 組織学
<ol><li>化学の発煙のフードまたはそれと同等の中性緩衝 10% ホルマリンで収穫された組織の約半分を格納します。</li>
	<li>組織をパラフィン ブロック (4-5 mL) に埋め込むし、4-5 μ m のセクションでセクションの歯肉。</li>
	<li>
コントロールとヘマトキシリンとエオシン染色 (H & E) と 2.5 の pH でアルシアン ブルー染色変性腱からのセクションを染色します。H & E 染色自動染色機次のように実行します。
	<ol>
<li>キシレンを使用して deparaffinize (3 回、5 分、それぞれ)。</li>
		<li>水 (100% アルコール、4 分 100% アルコール、3 分 95% アルコール、2 分; 70% アルコール、1 分; 水、2 分) に傾斜アルコールからメタンハイド レートします。</li>
		<li>5 分 2 分の水でよく洗浄をヘマトキシリンで染色します。</li>
		<li>1% アルコールに酸を区別する (1% 70% アルコールで HCl) 3 s の 3 分を水でよく洗う。</li>
		<li>10 0.5% アンモニア浸漬による塩酸を中和する s、3 分水洗浄が続きます。</li>
		<li>5 分の Eosion で染色します。</li>
		<li>アルコールによる脱水 (80% アルコール、30 の 100% アルコール 1 分、100% アルコール; 95% アルコール、1 分 2 分)。</li>
		<li>キシレンのクリア (3 時間、2 分、2 分、3 分、それぞれ)。</li>
		<li>カバー スライドをマウントします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunohistochemitry (IHC) 製造元の指示に従って結合ポリマーを絞り込む検出キットを用いたマイナーな修正を実行します。
	<ol>
<li>Deparaffinization キシレンを使用して後に、、100 ° C で 30 分間結合エピトープ検索ソリューションを使用して抗原検索手順を実行します。結合エピトープ検索ソリューションでは、基づくクエン酸バッファーと界面活性剤 (1 L、pH 5.9-6.1) も含まれています。</li>
		<li>5 分間、過酸化水素とティッシュの孵化によって内因性ペルオキシダーゼを癒します。</li>
		<li>血管内皮増殖因子 (VEGF) (1: 200)、tenomodulin (レバレッジ) またはモホーク (レバレッジ) に対して一次抗体と周囲温度 (21-22 ° C) で 15 分のセクションを孵化させなさい。</li>
		<li>二次抗体のビオチン フリー高分子西洋わさびペルオキシダーゼ リンカー抗体の共役システムとタグ付けを実行します。<ol>
<li>使用二次ウサギ抗マウス抗体をローカライズするのには Tris バッファー saline/0.09% 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one ソリューションで 10% (v/v) 動物の血清中 igg 抗体をマウスします。</li>
			<li>ポリ HRP IgG 高分子抗家兎を使用 (< 25 μ G/ml) ウサギ抗体をローカライズするのには Tris バッファー saline/0.09% で 10% (v/v) 動物血清を含みます。</li>
			<li>3, 3'-ジアミノベンジジン tetrahydrochloride 水和物茶色の沈殿物によって複合体を可視化する安定剤のソリューションを使用します。</li>
			<li>対比染色に < 0.1% ヘマトキシリン (ブルー) 細胞核を視覚化します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>H で染色スライドを観察すると、E、アルシアン青い汚れと IHC VEGF、tenomodulin、モホーク族の人に光学顕微鏡の下で、各スライドを 1 つ強拡大 (400 倍) での代表的な顕微鏡画像を得る。</li>
</ol>3. Tenocyte 文化
<ol><li>
ティッシュの準備
	<ol>
<li>マイクロ剪刀、鉗子で徹底的にすべての周囲の組織を削除することによって腱のサンプルを準備します。</li>
		<li>PBS で洗浄し、小さな断片 (1 mm3程度以下) にミンチします。</li>
		<li>1 h で 30 mL ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 37 ° C で 30 mg/ml のコラゲナーゼ II 補完のための組織を消化します。</li>
		<li>100 μ m の細胞ストレーナーを細胞を通過します。</li>
		<li>ウシ胎児血清 (FBS) の 1 つの mL を追加することによりコラゲナーゼ II を非アクティブ化します。</li>
		<li>5 分の 196 × g で遠心分離機します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞培養
	<ol>
<li>100 mm ディッシュに 3 x 10 の5セルをシードし、1 週間 10 %fbs と 1% 5% CO2インキュベーターで 37 ° C で抗生物質抗真菌薬ソリューション DMEM で文化します。</li>
		<li>80% の合流が発生するまで 3 日培養培地を変更します。4 つの通路まで健常者と変性細胞サンプルを文化し、実験に使用します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 各種 (ICC)
<ol><li>チェンバー スライドの 8 つの井戸に培養細胞 (2 x 10 の5セル) の 200 μ L を転送し、1 日新鮮なメディアの追加で合流するセルを育てなさい。</li>
	<li>PBS のセルを洗浄し、500 μ L/ウェル 4% のホルムアルデヒドを修正します。</li>
	<li>0.5% とスライドを孵化させなさい膜の透過性の 10 分のための PBS のトリトン X-100。</li>
	<li>0.05% と 1% ウシ血清アルブミンを PBS でブロック モヒカンと tenomodulin、トゥイーン 20 それぞれ。</li>
	<li>マウス抗モホーク モノクローナル抗体 (1: 100 希釈) と 4 ° C でヤギ抗 tenomodulin 抗体 (1: 100 希釈) 暗闇の中で一晩インキュベートします。</li>
	<li>(Alexa 555 アンチ山羊 (レバレッジ) tenomodulin; のための二次抗体を孵化します。モホーク族の人のアレクサ 488 抗マウス (レバレッジ)) 室温で 1 時間暗闇の中で。</li>
	<li>蛍光取付中の 0.5 μ L をマウントします。</li>
	<li>蛍光顕微鏡 (400 倍) を使用して分析します。</li>
</ol>5. 拡散の試金
<ol><li>
水溶性テトラゾリウム (WST)-1 を使用してセル目を測定します。
	<ol>
<li>120 h、72、24 ウェルあたり 2 × 103セルの密度で 96 ウェル プレートに健康や変性細胞を播きます。</li>
		<li>インキュベーション後、各ウェルに 10% WST 1 溶液 10 μ L を追加します。</li>
		<li>5% CO2の 37 ° C で 3 時間版を孵化させなさい。</li>
		<li>450 の光学密度を測定マイクロ プレート リーダーを使用して nm。各サンプルのすべての時点で、少なくとも 3 回の測定値を取る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
メジャー細胞の DNA 量 BrdU アッセイを用いたします。
	<ol>
<li>健全な種子し、96 に変性細胞も 120 h、72、24 ウェルあたり 2 x 10 の3セルの密度でプレートします。</li>
		<li>インキュベーション後、各ウェルに 10 %brdu 溶液 10 μ L を追加します。</li>
		<li>5% CO2の 37 ° C で 3 時間版を孵化させなさい。</li>
		<li>固定/変化させるソリューションの 100 μ L/ウェルを追加 (60-70% エタノール、0.1-0.5% 水酸化ナトリウム) し、30 分間室温でプレートを維持します。</li>
		<li>100 μ L/ウェルに備える 1 h 検出抗体溶液し室温でプレート x 1 を追加します。</li>
		<li>ソリューションを削除し、洗浄バッファー × 1 で 3 回プレートを洗ってください。</li>
		<li>100 μ L/ウェル準備 1 x HRP 標識二次抗体のソリューションを追加し、30 分間室温でプレートを維持します。</li>
		<li>3 回洗浄バッファー x 1 とソリューションと洗浄のプレートを取り外します。</li>
		<li>50 %tmb 基板の 100 μ L を追加します。</li>
		<li>室温で 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>停止液を 100 μ L を追加します。</li>
		<li>450 の光学密度を測定マイクロ プレート リーダーを使用して nm。 注: 測定値を取る少なくとも 3 回すべての時にポイント各サンプルの。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 統計解析
<ol><li>収集し、SPSS を使用してデータを分析します。</li>
	<li>平均の平均 ± 標準誤差でデータを表してください。</li>
	<li>使用マン-ホイットニーの U テスト。</li>
	<li>P値が 0.05 より小さい場合に統計的に有意な違いを考慮 (p < 0.05)。</li>
</ol>

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先行研究の数は、コラゲナーゼや kartogenin 注入、トレッドミルを実行して、多くの26,27など異なるプロシージャを使用して慢性 tendinopathic 動物モデルを作成する方法を報告しています。数多くの研究は、これらの動物のモデルに基づいて有望な治療効果を示しが人間退化的な tenocyte を用いた実験重要になる寛解の分野で治療の効果を再現するために。この資料では、正常に収穫し、一貫して人間の退化的な線を文化プロトコルを設立しました。両方収穫腱組織、培養 tenocyte 変性腱と tenocyte7,28の一般的な特徴を示した。
我々 の経験で成功した組織収穫のため不可欠だ変性腱の形態学的変化を理解し、正確に手術中にその領域を記述します。変性組織は通常灰色または茶色色および組織の薄い、壊れやすい、および緩いテクスチャーで解体。プロト...

寛解は、体のさまざまな部分で成長する慢性退行性筋骨格の条件です。最近では、寛解の症例数は、レクリエーション スポーツ、高められた平均余命1,2への参加の増加開発の世界で大きく増加しました。寛解の原因は多因子になると考え、これらの原因は、虚血、酸素フリーラジカル傷害、神経-規制3 への変更、内部マイクロの涙は、血管収縮と血管拡張神経支配間の不均衡 ,4,5,6,7,8。寛解のほとんどの治療は、その症状だけを和らげます。また、組織再生せず治療はリハビリテーションに必要な長い時間、医師9の臨床的課題を課す負傷した腱からの限られた応答を達成するため。
変性腱の治癒能力が欠如している現在の治療法の選択肢の無能さには代替治療戦略を探るに関心の鉛の研究者。最近、新しい研究は成長因子を用いた寛解腱の治癒的効果を高めるため多くの有望な結果を報告、幹細胞ベースの治療と遺伝子療法10、11,12。
文献レビューを通じて関与する研究材料の解析に基づく 2 つのカテゴリ分けることができることがわかった: 動物はラット、マウス、ウサギ; などモデル人体モデル。に関して動物モデル、現在は寛解を生成する 2 つの人気のある技術: 傷害または機械的にオーバー ロード モデルの化学的誘導。ただし、各動物モデルは、複雑な人間の寛解病理13,14の再現に限られていた。
ひと試料を使用してほとんどの論文の組織学的検討を行ったまたは体外実験による変性 tenocyte15,16,17,18ではなく健全な人間 tenocyte,19,20,21. 論文が少ない報告彼らが人間退化的な tenocyte を使用が、彼らは詳しく書いてありません人間22,23から変性 tenocyte を取得するためのプロトコル。この文脈では、それに注意してください人間の有効性や効果的な投与のため複雑なプロセスであり、病因は腱の変性、動物モデルまたは健康な組織/tenocyte のいずれかの成功結果が必ずしも予測しません。まだ完全に理解しました。
総称して、ドナーへの副作用を引き起こすことがなく人間のティッシュから変性 tenocyte を取得するための標準プロトコルを記述するため必要です。この資料は、人間の退化的な tenocyte を取得する方法のプロトコルを説明します。プロトコルを検証するため、収穫された組織は組織学的に分析しました。その後、培養細胞は、免疫細胞化学 (ICC)、リアルタイムの量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qRT PCR)、および実行可能性の試金を使用して変性 tenocyte として確認されました。

<table><tbody><tr><td>メス</td><td>キサンビオ</td><td>KS-Q0306-15</td><td>No. 15</td></tr><tr><td>ミニブレード</td><td>ビーバー</td><td>374769</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグルス培地 (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>牛胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>50 mM アスコルビン酸-2-リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌剤溶液</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>4% ホルムアルデヒド</td><td>バイオ溶液</td><td>BP031</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>X100-100ml</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Rdtech</td><td>C0082</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P9416-100ml</td><td></td></tr><tr><td>MKX (C-5)</td><td>サンタクルスバイオテクノロジー</td><td>sc-515878</td><td></td></tr><tr><td>テノモジュリン (N-14)</td><td>サンタクルーズ</td>バイオテクノロジー <td>sc-49325</td><td></td></tr><tr><td>蛍光実装媒体</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>WST-1 同</td><td>人堂 Molecular Technologies</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>BrdU Cell Proliferation Assay Kit</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#6813</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Hs02786624_g1</td><td></td></tr><tr><td>COL3A1</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Hs00943809_m1</td><td></td></tr><tr><td>ACTA2</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Hs00426835_g1</td><td></td></tr><tr><td>TAC1</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td>Hs00243225_m1</tr><tr><td>TACR1</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>Hs00185530_m1</td><td></td></tr><tr><td>PTGS2</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Hs00153133_m1</td><td></td></tr><tr><td>ACTB</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Hs99999903_m1</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー (100 & micro;m)&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>100mm 培養皿</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>8188207</td><td></td></tr><tr><td>8 ウェル チャンバー スライド</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル クリア フラットボトム ポリスチレン TC 処理マイクロプレート</td><td>コーニング</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>ニコン エクリプス 50i 顕微鏡&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VERSA max マイクロプレートリーダー&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン溶液 中性緩衝液 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Paraffins</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801340</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>純正化学</td><td>90303-2185</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>DAKO</td><td>CS70030-2</td><td></td></tr><tr><td>エオシン</td><td>ダコ</td><td>CS70130-2</td><td></td></tr><tr><td>アルシアンブルー</td><td>ダコ</td><td>AR16011-2</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>純生化学</td><td>25165-0430</td><td></td></tr><tr><td>内因性ペルオキシダーゼ&nbsp;</td><td>DAKO</td><td>S200380-2</td><td></td></tr><tr><td>カナダバルサム</td><td>純生化学</td>工業 <td>23255-1210</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトームブレード</td><td>FEATHER</td><td>A35</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>SUPERIOR</td><td>1000612</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>Marienfeld-superior</td><td>101050</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-7269</td><td></td></tr><tr><td>SPSS Software</td><td>IBM</td><td></td><td>Ver. 18.0</td></tr><tr><td>多目的遠心分離機</td><td>LABOGENE</td><td>1248R</td><td></td></tr></tbody></table>

人間から退化的な tenocyte を取得するためのプロトコル

A Protocol to Acquire the Degenerative Tenocyte from Humans

寛解、腱の変性に対応して開発して痛みの状態は身体活動と寿命向上のための開発された世界の上昇にあります。その普及にもかかわらず根本的な病因はまだはっきりしていないし、治療は一般に徴候を示す。最近では、成長因子、幹細胞、遺伝子治療など多くの治療オプションを変性腱の治癒力を高めることを期待して調べた。ただし、これらの調査の大半は動物モデルまたは健康な人間の線だけで行った。にもかかわらず、いくつかの研究は、病理の線を使用して、我々 の知識の限りで無い現在人間の退化的な線の入手方法を記述するプロトコル。本研究の目的は、人間の退化的な線を取得するための標準プロトコルを説明します。当初は、腱組織は、手術中に外側上顆炎患者から収穫されました。その後、生検採取した伸尺橈側手根ブレビス腱手術時の構造変化に対応するから。鈍い、灰色、砕けやすい、すべて収穫した腱の登場し、浮腫状になった健康なものから視覚的に異なる。線は、培養され、実験用します。一方、収穫された組織の半分は組織学的に分析した、寛解 (angiofibroblastic 異形成または過形成) の同じ特徴を共有彼らことが示されました。免疫細胞化学による二次分析確認モホークと tenomodulin の蛋白質のための肯定的な汚れを持つ細胞の大半と線を培養細胞にしました。線の退化的な天性の資質は、拡散の試金または qRT PCR を使用して健康な制御と細胞を比較することによって定量しました。退行性の tenocyte には、高い増殖率と過去のレポートを一致する寛解の類似の遺伝子発現パターンが表示されます。全体的にみて、この新しいプロトコルは、寛解の将来の研究のための便利なツールあります。

組織学的解析では、外側上顆炎から収穫された組織が tendinopathic 腱の特性を持っていたことを明らかにしました。寛解変性腱の H &amp; E セクションは、極性とまっすぐ、強くパック平行繊維構造の損失と組織を破壊されたコラーゲンのバンドルを明らかにしました。高い細胞型など典型的な紡錘形のない肥大核変性の病理組織学的所見は、サンプルで共通だった。また、変性腱のコラーゲンの束が比較的弱いエオシン H &amp; E 染色、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンの物質を増加を示すアルシアン ブルーで染色して積極的に。
すべてのケースで血管がみられたし、繊維の間に埋め込まれたスペースを占める骨材は通常スリット状血管と比較されました。IHC 染色変性腱の細胞制御のものの否定的な反応と比較して VEGF に細胞質の顆粒陽性反応を示した。総称して、これらの知見を確認外側上顆炎から収穫された組織が変性組織変性 tenocyte 文化に適した (<stro...

In vitro変性線の使用は、障害への新しい治療の有効性を調査するときに不可欠です。ただし、ほとんどの研究は動物モデルのみまたは健全な tenocyte を使用します。手術中に人間の退化的な線を分離する次のプロトコルを提案します。

人間から退化的な Tenocyte を取得するためのプロトコル

Tendinopathy, a painful condition that develops in response to tendon degeneration, is on the rise in the developed world due to increasing physical ...

この方法は、ヒトの変性テノサイトの単離と培養を詳細に説明した研究はほとんどないため、ヒトの変性テノシ細胞の生物学に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、標準的な上顆炎手術中に変性組織が獲得されるため、追加の患者の損傷なしにヒトの変性腱細胞を取得できることです。その手順を実演するのは、私のレベル3のハン・スホン博士、ベク・ミンジョン博士、キム・ヒョンギョン先生です。変性腱細胞組織サンプルを取得するには、15番の外科用メスを使用して、外側上顆のすぐ前方内側に3〜5センチメートルの皮膚切開を行い、関節のレベルに近位に切開して外側肘を露出させ、伸筋腱膜界面の橈骨手根伸筋を視覚的に特定します。メスを使用して、長橈側手根伸筋と界面の伸筋腱膜との間に深さ2〜3ミリメートルの分割切開を行います。橈骨手根筋を前方に収縮させた後、病理学的変性組織をその特徴的な鈍い灰色がかった色と通常は浮腫性で砕けやすい組織で特定し、メスとミニブレードを使用して、すべての変性組織を慎重に、しかし鋭く切除します。すべての組織が採取されたら、標準的なプロトコルに従って非吸収性縫合材料で創傷を閉じ、約1立方センチメートルの組織サンプルから周囲の組織をすべて慎重に除去し、きれいな腱組織をトリミングしたらすぐに10ミリリットルのPBSに入れます。次に、採取した組織の約半分を中性緩衝液10%ホルマリンに化学ドラフトで12時間固定します。テノサイト培養を行うには、採取したコントロール組織サンプルと変性組織サンプルの残りの半分を新鮮なPBSを含む個々の組織培養皿に移し、組織を1立方メートル以下にミンチし、30ミリリットルのDMEMで組織断片を消化し、組織群ごとに30ミリグラム/ミリリットルのコラゲナーゼを2つずつ、摂氏37度で1時間消化します。消化の最後に、個々の100ミクロンの細胞ストレーナーで細胞溶液をろ過し、チューブあたり1ミリリットルのFBSでコラゲナーゼを不活性化します。遠心分離により腱細胞を採取し、10%FBSおよび1%抗生物質、抗真菌剤溶液濃度を添加したDMEMの10ミリリットルあたり10〜5番目の細胞でペレットを再懸濁する。次に、細胞を1つの条件につき100cmの培養皿に播種し、摂氏37度および5%二酸化炭素インキュベーターで腱細胞を1週間培養し、80%のコンフルエントに達するまで3日ごとに培地を交換します。免疫細胞化学解析では、200マイクロリットルの新鮮な培地で5番目の細胞に10回2回、実験グループごとに1つの8ウェルチャンバースライドの各ウェルに移し、細胞を24時間コンフルエンスまで成長させます。翌日、細胞をPBSで洗浄し、続いてウェルあたり500マイクロリットルの4%ホルムアルデヒドで固定し、PBSで0.5%トリトン×100で10分間透過化します。非特異的結合をブロックするには、実験的に適切な方法で、細胞を1%ウシ血清アルブミン、およびPBS中の0.05%Tween 20とインキュベートし、その後、蛍光標識の付いた目的の一次抗体を4°Cで一晩インキュベートし、光から保護します。翌朝、光から保護した室温で1時間、適切な二次抗体で細胞を標識し、チャンバーごとに0.5マイクロリットルの適切な蛍光封入剤でサンプルをマウントします。次に、蛍光顕微鏡でサンプルを400倍対物レンズでイメージングします。組織の病理学的分析のためには、形式的で固定された制御および変性腱組織サンプルを4〜5ミリリットルのパラフィンに埋め込み、各パラフィンブロックから4〜5ミクロンの切片を取得します。エオシン中のヘマトキシリン、またはH&E染色の場合は、キシレンに5分間3回浸漬してサンプルを脱パラフィンし、続いてエタノール浸漬と水道水洗浄を2分間行い、サンプルを脱パラフィンします。次に、サンプルをヘマトキシリンで5分間標識し、続いてさらに2分間の水洗浄を行います。すすぎたサンプルを1%塩酸と70%エタノールに3秒間浸し、続いて3分間水洗いします。0.5%アンモニアに10秒間浸して酸を中和し、続いてさらに3分間の水洗いを行います。中和したサンプルをエオシンで5分間標識し、H&Eで染色したサンプルをグレーディングエタノール浸漬液で脱水します。キシレンを3回浸漬した後、適切な封入剤とカバースライドを使用してサンプルをマウントします。組織サンプルの免疫組織化学分析を行うには、メーカーの指示に従って、以下のわずかな変更を加えたボンドポリマー精製検出キットを使用してください。示されているようにキシレンで脱パラフィンした後、抗原賦活化のためにサンプルを100°Cで30分間結合エピトープ賦活化溶液に浸し、続いて過酸化水素に5分間インキュベーションして内因性ペルオキシダーゼをクエンチします。次に、切片を室温で15分間、目的の一次抗体で標識します。インキュベーションの終了時に、適切なビオチンフリー高分子西洋ワサビペルオキシダーゼリンカー二次抗体標識システムで、室温で50分間サンプルを標識します。次に、カバースリップで切片を適切な封入剤に封入し、400倍の倍率でサンプルを光学顕微鏡でイメージングします。H&Eの分析は、変性した外側上顆炎から採取された組織が、極性が失われ、微細でまっすぐで強く詰まった平行線維構造を伴う無秩序なコラーゲン束を示していることを明らかにしています。実際、コラーゲン束は、変性組織切片におけるアルシアンブルー染色に陽性であり、損傷した組織内でのプロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンの存在が増加していることを示しています。変性した腱の免疫組織化学的分析は、制御された健康な腱組織サンプルでは観察されない血管内皮増殖因子に対する細胞質顆粒陽性反応も示しています。どちらのタイプの培養組織サンプル細胞も、免疫蛍光化学によって腱細胞として確認でき、ほとんどの培養細胞はモヒカンタンパク質やテノモジュリンタンパク質などの代表的な腱細胞マーカーを発現し、細長い外観を示しています。注目すべきは、変性腱細胞は、健康な対照から採取された腱細胞と比較して、培養中の増殖率が高く、腱鞘炎の発症に関連することが知られている複数の遺伝子の発現が高いことも示していることです。結論として、変性腱細胞を使用したこの検証済みのプロトコルは、腱生物学の将来の研究と新しい介入のテストへの道を開きます。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

ここでは、Tfap2c、Gata3、Eomes、Ets2の10日間の過剰発現により、マウス胚性線維芽細胞を完全に機能的で安定した栄養膜幹細胞に直接変換するためのプロトコルを紹介します。...

栄養膜幹細胞へのマウス胚性線維芽細胞の直接変換するためのプロトコル

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神経系の再構築、変調、モデリングのための解剖学的にインスパイアされた3次元マイクロ組織工学ニューラルネットワーク

プロトコルを提案ここで各体節の誘導体 (筋節、椎板、皮膚分節、syndetome)...

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

骨格筋生検組織から得られたヒト原発性筋前駆細胞(hMpAc)を分離、培養、特徴付け、分化する技術を提示する。これらの方法によって得られ、特徴付けられたhMpPCは、その後、ヒトの筋形成および骨格筋再生に関連する研究の質問に対処するために使用することができる。...

骨格筋生検手順からのヒト筋前駆細胞の単離、培養、特徴付け、分化

三次元単軸的な機械的刺激バイオリアクターシステムは、腱由来幹細胞の形質特異的分化およびネオ腱形成のための理想的なバイオリアクターである。...

腱由来幹細胞の発熱分化を誘導する三次元単軸機械刺激バイオリアクターシステムの適用

このプロトコルは、皮膚線維芽細胞を筋芽細胞に変換し、その分化を筋管に変換することを記述する。細胞株は神経筋疾患の患者に由来し、病理学的メカニズムを調査し、治療戦略をテストするために使用することができる。...

神経筋障害の治療法を調査するヒト線維芽細胞の筋芽細胞への直接リプログラミング

ここでは、標識された神経細胞をヒト大脳オルガノイドに移植および追跡するためのプロトコルについて説明します。...

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本稿では、レンチウイルスベクターを用いた強膜の過剰発現と2Dバイオリアクター による...

強膜過剰発現と2D一軸張力 の組み合わせによる 人工多能性幹細胞由来iTenocytesの生成

ここでは、荷重を支える腱コア組織と、病気や損傷によって活性化された細胞集団を含む外因性区画との間の腱細胞のクロストークを模倣する集合体モデルシステムを紹介します。重要なユースケースとして、外因性内皮細胞の疾患関連活性化を調査するためにシステムをどのように展開できるかを示します。...

腱の集合体を工学的に研究し、疾患と修復における細胞のクロストークを探る

ここでは、腱の基礎研究に有望なツールと、腱組織工学のための潜在的な足場のない方法を提供する3ステップオルガノイドモデル(2次元[2D]拡張、2D刺激、3次元[3D]成熟)を実証します。...

ヒト真皮線維芽細胞を用いた自己組織化細胞シート培養の実証と3次元腱・靭帯様オルガノイドの手動生成

私たちは、ヒト腎臓全体を処理して一次腎近位尿細管上皮細胞を単離および培養するための最適化されたプロトコルと、これらの細胞を3次元、マイクロ流体、微生理学的プラットフォームで適用して腎近位尿細管を再現するためのプロトコールを提示します。...

初代ヒト近位尿細管上皮細胞の単離と腎近位尿細管の微生理学的モデルの作成におけるそれらの使用

学ぶ ヒトの退行性テノサイトを外側上顆炎手術中に採取し培養する方法。組織学的・免疫細胞化学的分析により腱症の病態と治療法開発の基礎を解明する貴重なプロトコルです。

人間から退化的な Tenocyte を取得するためのプロトコル

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