人間から退化的な Tenocyte を取得するためのプロトコル

この方法は、ヒトの変性テノサイトの単離と培養を詳細に説明した研究はほとんどないため、ヒトの変性テノシ細胞の生物学に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、標準的な上顆炎手術中に変性組織が獲得されるため、追加の患者の損傷なしにヒトの変性腱細胞を取得できることです。その手順を実演するのは、私のレベル3のハン・スホン博士、ベク・ミンジョン博士、キム・ヒョンギョン先生です。

変性腱細胞組織サンプルを取得するには、15番の外科用メスを使用して、外側上顆のすぐ前方内側に3〜5センチメートルの皮膚切開を行い、関節のレベルに近位に切開して外側肘を露出させ、伸筋腱膜界面の橈骨手根伸筋を視覚的に特定します。メスを使用して、長橈側手根伸筋と界面の伸筋腱膜との間に深さ2〜3ミリメートルの分割切開を行います。橈骨手根筋を前方に収縮させた後、病理学的変性組織をその特徴的な鈍い灰色がかった色と通常は浮腫性で砕けやすい組織で特定し、メスとミニブレードを使用して、すべての変性組織を慎重に、しかし鋭く切除します。

すべての組織が採取されたら、標準的なプロトコルに従って非吸収性縫合材料で創傷を閉じ、約1立方センチメートルの組織サンプルから周囲の組織をすべて慎重に除去し、きれいな腱組織をトリミングしたらすぐに10ミリリットルのPBSに入れます。次に、採取した組織の約半分を中性緩衝液10%ホルマリンに化学ドラフトで12時間固定します。テノサイト培養を行うには、採取したコントロール組織サンプルと変性組織サンプルの残りの半分を新鮮なPBSを含む個々の組織培養皿に移し、組織を1立方メートル以下にミンチし、30ミリリットルのDMEMで組織断片を消化し、組織群ごとに30ミリグラム/ミリリットルのコラゲナーゼを2つずつ、摂氏37度で1時間消化します。

消化の最後に、個々の100ミクロンの細胞ストレーナーで細胞溶液をろ過し、チューブあたり1ミリリットルのFBSでコラゲナーゼを不活性化します。遠心分離により腱細胞を採取し、10%FBSおよび1%抗生物質、抗真菌剤溶液濃度を添加したDMEMの10ミリリットルあたり10〜5番目の細胞でペレットを再懸濁する。次に、細胞を1つの条件につき100cmの培養皿に播種し、摂氏37度および5%二酸化炭素インキュベーターで腱細胞を1週間培養し、80%のコンフルエントに達するまで3日ごとに培地を交換します。

免疫細胞化学解析では、200マイクロリットルの新鮮な培地で5番目の細胞に10回2回、実験グループごとに1つの8ウェルチャンバースライドの各ウェルに移し、細胞を24時間コンフルエンスまで成長させます。翌日、細胞をPBSで洗浄し、続いてウェルあたり500マイクロリットルの4%ホルムアルデヒドで固定し、PBSで0.5%トリトン×100で10分間透過化します。非特異的結合をブロックするには、実験的に適切な方法で、細胞を1%ウシ血清アルブミン、およびPBS中の0.05%Tween 20とインキュベートし、その後、蛍光標識の付いた目的の一次抗体を4°Cで一晩インキュベートし、光から保護します。

翌朝、光から保護した室温で1時間、適切な二次抗体で細胞を標識し、チャンバーごとに0.5マイクロリットルの適切な蛍光封入剤でサンプルをマウントします。次に、蛍光顕微鏡でサンプルを400倍対物レンズでイメージングします。組織の病理学的分析のためには、形式的で固定された制御および変性腱組織サンプルを4〜5ミリリットルのパラフィンに埋め込み、各パラフィンブロックから4〜5ミクロンの切片を取得します。

エオシン中のヘマトキシリン、またはH&E染色の場合は、キシレンに5分間3回浸漬してサンプルを脱パラフィンし、続いてエタノール浸漬と水道水洗浄を2分間行い、サンプルを脱パラフィンします。次に、サンプルをヘマトキシリンで5分間標識し、続いてさらに2分間の水洗浄を行います。すすぎたサンプルを1%塩酸と70%エタノールに3秒間浸し、続いて3分間水洗いします。

0.5%アンモニアに10秒間浸して酸を中和し、続いてさらに3分間の水洗いを行います。中和したサンプルをエオシンで5分間標識し、H&Eで染色したサンプルをグレーディングエタノール浸漬液で脱水します。キシレンを3回浸漬した後、適切な封入剤とカバースライドを使用してサンプルをマウントします。

組織サンプルの免疫組織化学分析を行うには、メーカーの指示に従って、以下のわずかな変更を加えたボンドポリマー精製検出キットを使用してください。示されているようにキシレンで脱パラフィンした後、抗原賦活化のためにサンプルを100°Cで30分間結合エピトープ賦活化溶液に浸し、続いて過酸化水素に5分間インキュベーションして内因性ペルオキシダーゼをクエンチします。次に、切片を室温で15分間、目的の一次抗体で標識します。

インキュベーションの終了時に、適切なビオチンフリー高分子西洋ワサビペルオキシダーゼリンカー二次抗体標識システムで、室温で50分間サンプルを標識します。次に、カバースリップで切片を適切な封入剤に封入し、400倍の倍率でサンプルを光学顕微鏡でイメージングします。H&Eの分析は、変性した外側上顆炎から採取された組織が、極性が失われ、微細でまっすぐで強く詰まった平行線維構造を伴う無秩序なコラーゲン束を示していることを明らかにしています。

実際、コラーゲン束は、変性組織切片におけるアルシアンブルー染色に陽性であり、損傷した組織内でのプロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンの存在が増加していることを示しています。変性した腱の免疫組織化学的分析は、制御された健康な腱組織サンプルでは観察されない血管内皮増殖因子に対する細胞質顆粒陽性反応も示しています。どちらのタイプの培養組織サンプル細胞も、免疫蛍光化学によって腱細胞として確認でき、ほとんどの培養細胞はモヒカンタンパク質やテノモジュリンタンパク質などの代表的な腱細胞マーカーを発現し、細長い外観を示しています。

注目すべきは、変性腱細胞は、健康な対照から採取された腱細胞と比較して、培養中の増殖率が高く、腱鞘炎の発症に関連することが知られている複数の遺伝子の発現が高いことも示していることです。結論として、変性腱細胞を使用したこの検証済みのプロトコルは、腱生物学の将来の研究と新しい介入のテストへの道を開きます。