電気穿孔法によるマウス膀胱尿路上皮にプラスミド DNA 配信法

この方法の全体的な目標は、DNA プラスミドを生体内の生きたマウスの膀胱尿路上皮に導入し、遺伝子の過剰発現またはゲノム編集を行うことです。この方法は、さまざまな遺伝子変異が膀胱がんの進行をどのように促進するかなど、膀胱がん分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ウイルスベクターに関連する安全性の懸念や技術的な障壁なしに、遺伝子を膀胱に迅速かつ便利に送達する方法を提供することです。

最初に思いついたのは、DNA送達に人工的な関連ウイルスを使おうとするこの方法でしたが、膀胱にはうまくいきませんでした。この技術の意味合いは、エレクトロポレーションが尿路上皮細胞へのDNAプラスミドの効率的な送達を達成できるため、遺伝子治療にも及ぶ可能性があります。この手順を実演するのは、私の研究室のOfir StefansonとYueli Liuです。

この手順を開始するには、すべての手術器具をオートクレーブし、70%エタノールでワークスペースを滅菌します。手術器具と手袋に70%エタノールを頻繁にスプレーして、その後の手順を実行して無菌状態を維持します。.まず、マウスに麻酔をかけ、手術部位を剃ります。

尿を枯渇させるには、カテーテルに潤滑剤を塗布し、その外面が完全に覆われていることを確認します。次に、カテーテルをマウスの尿道開口部に挿入し、膀胱に到達するまでゆっくりと押します。腹部をやさしく押して、尿の枯渇を助けます。

その後、ピペットで尿を廃棄物ビーカーに捨て、次に80マイクロリットルのPBSをカテーテルの外側の端にピペットで入れ、もう一方の端はまだ膀胱に入れます。次に、1mmシリンジをカテーテルに慎重に取り付けます。シリンジをそっと押して、PBSを膀胱に注入します。

膀胱に気泡が生じないように、カテーテルにPBSをいくらか残しておきます。その後、シリンジを取り外し、PBSが膀胱から排出されるのを待ちます。腹部をそっと押してPBSを排出し、ピペットでカテーテル内のPBSを廃棄物ビーカーに捨てます。

PBS洗浄をさらに2回繰り返します。トランスフェクションする膀胱ごとに、1マイクロリットルあたり1マイクログラムで少なくとも20マイクロリットルのDNAプラスミドを調製します。次に、20マイクロリットルのプラスミド溶液に1マイクロリットルのトリパンブルーを加え、1.5ミリリットルの微量遠心チューブとピペットでよく混ぜます。

プラスミドを送達するには、70%エタノールを腹部に塗布します。.膀胱の上の腹部の皮膚を開くために、1センチメートルの垂直切開を行います。次に、筋肉層を切って膀胱を露出させます。

プラスミドとトリパンブルー溶液を少なくとも20マイクロリットルをカテーテルの外側端にピペットで入れ、シリンジに取り外します。.次に、プラスミド溶液を膀胱に注入します。膀胱が青色に変われば、注射は成功です。

膀胱に気泡が入らないように、カテーテルに液体を残しておきます。その後、外部尿道口をつかみ、カテーテルとシリンジを取り外します。紐を使用して、外部尿道開口部を締めます。

紐で2つのループを作り、次に2つの結び目で結びます。これは、2人の協力が必要な重要なステップです。プラスミドが漏れないように、結び目がきつく

次に、エレクトロポレーションジェネレーターの電源を入れます。2つの電極で膀胱をつまみ、フットペダルを押してエレクトロポレーションを行います。膀胱を支えておくには、ピンセットで腹部切開部の背面をつまむことができます。

ピンセットと電極が接触すると、火花が発生する可能性があるため、避けてください。それが完了したら、腹部と皮膚の開口部を滅菌済みの外科的縫合糸で縫合します。紐を外し、クリップを適用します。

創傷にヨウ素を塗布し、次に動物をイソフルラン系から取り出します。ブプレノルフィン鎮痛薬を皮下投与して、術後の痛みを軽減します。動物を加熱パッドに置き、完全に回復した後、自宅のケージに戻します。

切開が治癒するまで、正常な可動性、飲酒および摂食行動、および感染の兆候がないことについて、少なくとも1日1回動物を確認してください。そして、1週間後にクリップを取り外してください。動物がグルーミングの減少、攻撃性の増加、発声などの痛みの症状を示している場合は、ブプレノルフィン鎮痛薬のその後の注射を投与します。.

膀胱尿路上皮への遺伝子導入の成功を実証するために、20マイクロリットルのpCAG-GFPプラスミドとトリパンブルー溶液を尿道から注入し、5つの電気パルスを投与しました。ここに示されているのは、48時間後に膀胱を緑色に変えた成功したエレクトロポレーションですが、エレクトロポレーションを受けなかった陰性コントロール膀胱はGFP信号を示さなかった。切片化された膀胱組織の免疫蛍光染色は、CK5、CK18、およびGFP抗体を用いて行いました。

GFPシグナルは、アンブレラ細胞、中間細胞、および基底細胞に存在することが観察されましたが、筋肉層には存在しず、尿路上皮へのプラスミド送達の特異性が良好であることを示しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば15分で実行できます。この技術の開発後、この技術は、膀胱がんの分野の研究者が疾患の進行メカニズムを研究するための新しい自家マウスモデルを構築する道を開きます。