Name: 糖タンパク質 x 線結晶構造解析および生物物理学的手法によって、免疫グロブリンフォールドのキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学ぶ糖タンパク質のX線結晶構造解析と生物物理学的手法による免疫グロブリンフォールドの特性評価。バイオレイヤー干渉法、等温滴定熱量測定を用いて、糖タンパク質の構造と機能を詳細に解析する方法です。

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ビームライン 08 ID、08 BM 技術革新・自然科学・ エンジニア リング研究評議会カナダのカナダの財団によってサポートされているカナダの光源で本稿で説明した x 線回折実験を行い、カナダ保健研究機構、国立研究評議会カナダ西部経済の多様化カナダ サスカチュワンの政府サスカチュワン大学ITC とバリの商品へのアクセスの病気の子供のため構造 & 生物物理の中核施設、病院を確認したいと思います。J.E.O. は、バンティング博士研究フェローシップ BPF-144483 健康の研究のカナダの協会からサポートされていました。T. s. は受信者のカナダ大学院奨学金修士賞および健康の研究のカナダの協会からヴァニエ カナダ大学院奨学金。この仕事は、営業 PJT 148811 (j. p. j.) 健康の研究のカナダの協会からの助成金によって支えられました。一部では、カナダの研究の椅子プログラム(j. p. j.)からの資金のおかげで、この研究がうけた。

著者は競争の興味を宣言しません。

膜糖タンパク質細胞機能のために重大、魅力的な治療上のターゲット。ここで、両方単独でそして小分子リガンド複合体膜糖タンパク質の ECD の構造と特性のプロトコルを提案し、Fab フラグメントします。我々 は正常に人間 CD2228、チェック79体液性免疫を維持に関与する B 細胞の重要な共受容体の細胞外の部分の 3 つの N ターミナルほとんど Ig ドメインの結晶構造を決定するのにこのプロトコルを使用しています。またその天然リガンドの α 2-6/シアリルラクトースと CD22 の結合部位を特徴として人間 CD22 に向けて治療用抗体の認識のモードを定義します。これらの結果は、B 細胞と新しい CD22 のターゲットを絞った小分子と抗体を用いた開発に向けた分子ロードマップの表現が制限されている Siglecs 家族の主要メンバーの構造と機能の関係に洞察力を提供します。治療。このプロトコルは Ig 含有 B 細胞受容体を正常に使用されますが、異なるドメインの組織とすべての膜の糖蛋白質の構造と特性評価のためのアプローチを適用できることを提案します。このような場合は、設計とコンビナトリアル N 型糖鎖構造の結晶成長と高分解能回折に適したを見つけるため (Gln または Ala のいずれか) の突然変異を評価できるを構築します。
均一な純粋な糖タンパク質サンプルを取得下流生物物理学的特性だけでなく、結晶成長と x 線回折のため非常に重要です。N リンク糖鎖糖タンパク質の存在は本質的に不均一し、結晶の形成を抑止することができます糖内構造および化学的不均質性を引き起こすことができます。このマイクロの不均一性を減らすためには、ハーバーの N 結合糖鎖、または endoglycosidases (遠藤) などによる治療が続く突然変異細胞株 (HEK293S) などを使用して、予測した Asn 残基を削除する点変異を導入する戦略がかなり結晶化成功15,21,22を向上します。このプロトコルでは可溶性糖タンパク質・細胞培養上清中に分泌される工場の浄化をについて説明します。糖タンパク質の分泌は、セル換散の必要性や過酷な化学物質や洗剤の添加なしの純度への比較的単純なルートを提供します。細胞培養上清、得られた次セル収穫は (例えば、 Ni 国税庁彼の付けられた糖蛋白質、またはすてきなフラグメントの LC の親和性のため) の興味の蛋白質のための親和性を持つ列の上に直接実行されます。ただし、使用、細胞培養上清 (例えばpH) の条件の列によって列に興味の蛋白質のバインディング機能が影響されるかもしれない。この場合、集中し、バッファーの列へのバインドを改善するために細胞培養上清を交換する必要があります。さらに、浄化中の品質管理手順が蛋白質の純度を評価するために採用するを強くお勧めします。SDS ページのゲルまたは (の前に、中に、浄化のステップの後) すべてのサンプルの西部のしみを実行するかどうか提案された浄化方式は興味の蛋白質に洞察力を得ることができます。汚染バンドは SDS のページに表示された場合、またはいくつかの種は精製時に得られる (例えば、サイズ排除上のいくつかのピーク)、追加精製の手順を実行する必要があります考慮するを得るために、例えば、イオン交換クロマトグラフィー下流の結晶化80の純度と増加のチャンス。
高分子結晶化の結晶のヒットを見つけることができます多数の高蛋白濃度で潜在的な結晶化条件のスクリーニングのために興味の蛋白質の高収率を取得する重要です多くの場合。一般的には、HEK293 細胞株に記載 (HEK293F と HEK293S) は堅牢な表現システム、必要に応じてより多くのサンプルを生成するためのスケール アップ。ただし、興味の蛋白質可能性がありますこれらの細胞内で十分に表現できないことが可能です。これらのケースで Expi293 細胞81,82, などの他の細胞は蛋白質の表現の優れたレベルを示すことが判明し、代替手段として考慮されるべき。
整然、回折結晶が次の高純度にもかかわらず興味の蛋白質のいくつかの構造の試験を得られない場合は、結晶の形成を促進する結晶化技術を拡大する必要があります。それは、抗体と nanobodies の Fab 断片が優れた結晶化エンハンサーをするでき、よく整理されたクリスタル83,84,85を包装を促進する示されています。これらのフラグメントの表現し、同質性に浄化され、興味の蛋白質との複合体の結晶化を促進するために使用することができます。重要なは、Fab 断片セクション 10 で説明されているように生成することができます非機能的な LC ダイマー86を形成する傾向があります。これらの汚染物質をおよび精製中に削除する必要があります。我々 の経験で LC ダイマーしばしばサイズ排除に別の保存ボリュームがあるイオン交換クロマトグラフィーに明瞭なピークとして溶出や削除できるから Fab 浄化 - しかし、これは常にそうではありません。これらの技術は工場の精製から LC ダイマーを削除するための十分な G タンパク質の親和性の浄化などの他の浄化方法は、純度を向上させるために使用できます。
Fab 断片と co 錯形成する代わりに、ランダム行列 microseeding など定評の技術は、よく整理された結晶63,70を得ることのチャンスを向上できます。このメソッドは、結晶の結晶成長を促進するために核を提供する結晶化条件に粉砕、準結晶の少量の付加を含みます。これは、ドメイン アーキテクチャ及び三次構造が類似したものや、興味の蛋白質の結晶を使用して実行できます。さらに、単独で、タンパク質を結晶化しよう、Fab フラグメントまたは関心の低分子との複合体は、ランダム行列 microseeding を実行できます。クライオ電子顕微鏡の最近の進歩はまたこの手法に適切な機能87,88、分子の高分解能構造情報を取得するための x 線の結晶学への魅力的な代替手段を作る 89,90,91。
氏によって失敗すると x 線回折データセットの段階的に廃止、浸漬 HA を異常分散または同形置換による位相問題を解決するために必要かもしれない。タンパク質のアミノ酸配列の検査は、バインディングの最適 pH を含む HA の誘導体化の戦略についての手がかりを提供できます。特に、対になっていないシステイン蛋白質の内で特に水銀 HA 化合物をバインドできます。ネイティブ結晶 HA 化合物を浸漬は、最適な HA 化合物の id、その濃度および必要なインキュベーション時間を決定するための反復的なプロセスです。浸漬の初期の試みには、よく回折結晶段階に適した HA を含む譲歩しない場合、は、HA 結合確率と異常信号を改善するアミノ酸置換を導入する必要があります。などの変異体を効率的に位相の異常に使われた大腸菌セレノ メチオニン補足のメディアの異常な段階の Hg、Au、Pt や Pb タンパク質の発現をバインドする無料のシステイン残基が含まれてしかし、。セレノ メチオニンが確実に組み込まれた同等のシステムはサスペンション92,93, 哺乳類セルの容易に利用可能ではないと将来の開発の領域です。
興味の糖タンパク質のリガンド非結合構造を取得した後、小分子リガンドと結晶を沈める免疫受容体-リガンド複合体の構造を取得する実行できます。これらのデータより具体的かつ高親和性リガンド糖蛋白の生物学的機能に高解像度の洞察力を提供と同様、低分子治療薬として使用することができます合理的な設計の青写真を提供します。興味の小分子リガンド糖タンパク質結晶を吸収しようとすると、リガンド非結合状態の結晶構造の検査は浸漬で可能かどうかを指定できます。場合すぐ水晶パッキング連絡先リガンド結合部位の周りがあるまたはリガンド結合に伴う構造変化を受けると予想される地域では、問題が発生する可能性が高いを浸漬します。この場合、タンパク質-リガンド複合体の共晶析法など他の方法を実行する必要があります。

表面タンパク質は、細胞の機能に重要な役割を果たします。細胞外ドメインをこれら膜タンパク質は、細胞間相互作用、接着、トランスポートおよび1,2の信号を調節することが。これらの蛋白質の細胞局在化させるがんと自己免疫疾患3,4,5を含む病気の広い範囲の治療薬の開発のための魅力的なターゲット,6,7. ひと膜タンパク質 ectodomains の最も一般的なひだの 1 つは、7 つ以上の β ストランド 2 つの β シート8,9に配置によって形成される免疫グロブリン様 (Ig) 倍。通常、Ig 含有糖タンパク質、細胞外膜タンパク質10部に配置された順番に Ig ドメインとマルチ ドメイン構造です。これらの細胞表面タンパク質、特に N と O リンク糖の翻訳後修飾は、折りたたみ、分泌および機能11それらの規制に重要な役割を再生する示されています。技術が必要な機能とそれらを対象とするより良いデザイン治療に理解を改善するために、その詳細な分子特性を可能にします。今回、生物物理を可能にする技術の組み合わせ (biolayer 干渉法 (結合) と等温滴定型熱量計 (ITC)) と Ig 含有細胞外ドメインの構造 (x 線回折) の評価膜糖蛋白、だけで、複雑な生体関連配位子と治療上の分子 (図 1)。
N リンク糖鎖は哺乳類タンパク質は、最も一般的な翻訳後修飾の一つし、小胞体とゴルジ体12,13内タンパク質成熟中に発生します。人間の萌芽期の腎臓 (HEK) 293 細胞などの細胞は、糖タンパク質14,15の大量の組換え発現のため開発されています。スケール付着性のセルラインに比べて大量にタンパク質の生産アップのしやすさでは、サスペンションの形式でこの細胞ラインを開発しました。2 HEK293 細胞を利用するここでは、: HEK293F と HEK293 Gnt 私-/- (HEK293S)、私が N アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ トランスフェラーゼの有無によって異なる (Gnt 私) 後者で。ターンでは、(に見られる HEK293F) として複雑な糖鎖の生産は不可能であり、代わりに高マンノース型糖鎖 (主に男5GlcNAc2) 存在の N 型糖鎖のサイト18,19,20.同時にこれら 2 つのセルラインを使用して生物学的機能と治療ターゲットに及ぼす糖鎖の大きさや複雑さを勉強できます。確かに、糖タンパク質 HEK293F の細胞で生産されるだろう HEK293S 細胞で生産される同じ糖蛋白と比較して大きくより複雑な糖鎖HEK293S 細胞で生産される糖タンパク質の N 結合糖鎖の減らされた化学と構造の不均質性のため、結晶化に向いています。Crystallizability をさらに向上させるため、HEK293S (しかしない HEK293F) 細胞で生産される糖タンパク質は酵素エンドグリコシダーゼ高マンノース糖鎖の開裂の結果このような H (遠藤 H) を扱うことができるだけである、単一 n-アセチルグルコサミン (GlcNAc)部位は各糖鎖の N リンク サイト21,22のままです。他の方法は、kifunensine23を含む糖蛋白中に糖転移酵素阻害剤の添加などの細胞内の N 型糖鎖の処理を制限する使用できます。代替アプローチは、(HEK293F 細胞) のネイティブ糖タンパク質のペプチド N 各種グリコシダーゼ F (PNGaseF) を用いた酵素の糖鎖切り出し続いて式を含みます。ただし、PNGaseF と糖鎖切り出しの原産の条件およびいくつかの蛋白質の増加の集計の下でより少なく有効であること示されています。場合蛋白質のまま治療後、水溶性を取得アスパラギン酸24アスパラギン残基の脱あみどのため表面に負電荷、結晶化について有害な可能性もあります。アラニンやグルタミン残基、これらのサイトで N リンク グリコシル化反応を防ぐために、均質性の高い糖タンパク質サンプルを生成するためにほとんどの場合、N 糖鎖が予測も変異することができます。また、糖タンパク質は、酵母、昆虫、植物システム チャイニーズハム スター卵巣 (CHO) 細胞16,17など他の哺乳類セルラインなど他の真核生物細胞培養で製作できます。
PHLsec を含む多くの哺乳類発現ベクター細胞中25に組換え糖タンパク質 ectodomains の分泌を可能にします。HEK293 細胞から糖タンパク質の分泌細胞の換散を必要とせず簡便・迅速な浄化が可能です。精製タグの追加 (例えば、彼タグ、タグ、連鎖球菌フラグ-タグ、Myc タグ、HA タグ) ターゲットの N または C 末端に糖タンパク質によりシングル ステップ アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーによって浄化。その後、サイズ排除クロマトグラフィーは、構造と生物の単分散のサンプルを生成する使用できます。
適切な条件の下で高純度、均一な糖タンパク質サンプルは、よく回折結晶で起因できます。このような結晶による x 線回折データセットを取得すると、初期段階は糖タンパク質の電子密度を計算する決定する必要があります。構造蛋白質のデータ ・ バンク (PDB) で数増え、おかげで段階的に廃止のため最もよく使用されるメソッドまで関連タンパク質の構造を使用して初期段階の26を取得する分子置換 (氏) となっています。しかし、氏は、時折マルチ Ig ドメイン糖タンパク質27,28,29のためのケースをされている位相問題を解決するために失敗した場合、別の方法が必要です。この記事は、CD22 外部ドメイン28の構造を解決するために必要でした、段階的に廃止の重い原子 (HA) と結晶を吸収する方法を詳しく説明します。段階的に廃止のため右 HA を識別するは、与えられた結晶格子と結晶化ソリューション30,31糖蛋白質で使用可能な原子 HA 反応性に依存する反復的なプロセスです。糖タンパク質は、他の原子に十分に高い比率で存在する場合と十分に高い冗長性32、x 線回折データを収集できるのシステインとメチオニン残基の自然硫黄原子を使用ことができますまた、 33。
膜糖タンパク質の生物学的機能しばしばによるタンパク質-タンパク質相互作用やタンパク質-リガンド相互作用など、炭水化物。リガンド認識を理解する糖タンパク質-リガンド共結晶構造を取得する成功はリガンドが結晶格子の糖蛋白結合部位にソリューションから拡散するには十分に小さいと、浸漬実験できます。
ここに示すプロトコルは合成治療配位子34,35 ・抗体治療36,37表面糖タンパク質の相互作用を理解することも。構造情報と組み合わせると、動力学および熱力学をバインディングは強力な理解し、それらの作用メカニズムを改善できます。抗体医薬品の糖蛋白に結合の速度論的解析では、1 つの手法は、バリ38,39です。バリは、最終的に平衡解離定数 (KD) を決定するバインドのパートナーと協会・解離動態を測定するのに固定化リガンドとバイオ センサーを使用します。糖タンパク質の少量が必要なので、バリは魅力的なアプローチ (< 100 μ g)、実験時間は高速 (10 ~ 15 分ごとに実行)、自動化できます。ITC はまた糖タンパク質と結合パートナー40,41,42,43の間の類似性を調べる場合に役立ちます。ITC は、多くの時間と集中的な試薬ですが、(ΔG、ΔH、ΔS、および化学量論) の相互作用の熱力学に関する貴重な情報を取得できます。ITC は、配位子に表面糖タンパク質の一過性のバインディングに関連付けられては、しばしば弱い相互作用を研究するため便利ですも。さらに、これらの技術は、さまざまなコンストラクトのバインディングの異なる N リンク従って細胞の糖蛋白質を表現することから得られる効果を評価すると共に使用できます。HEK293F、HEK293S で生産され、遠藤 H で治療は糖タンパク質とバリと ITC を実行する生物学的活性と治療的関与の糖鎖の役割の詳細なビューを提供できます。
我々 は正常に人間 CD22 の28、糖タンパク質ファミリのメンバー、シアル酸結合 Ig のようなレクチン (Siglecs)44 B 細胞の恒常性を維持するために不可欠な細胞外ドメイン (ECD) を特徴づけるこれらのプロトコルを適用.結晶化を容易にするために詳細な構造設計を行い段階的に Hg で浸漬 ha x 線データセット。我々 はまた CD22 結晶そのリガンドのシアル酸 (α 2-6/シアリルラクトース) 免疫受容体-リガンド複合体の構造を取得するを浸漬し、したがって糖ヒューマンミメティック最前線45,46の構造に基づく設計のための青写真を提供します。さらに、私たちはバリでの親和性を決定するため抗 CD22 抗体 epratuzumab - 非ホジキン リンパ腫47の第 III 相臨床試験で現在治療候補 - のフラグメント抗原結合 (Fab) を生成し、糖鎖特異的に ITC CD22 ECD を構築します。これらの研究では、B 細胞の機能不全 CD22 認識のための潜在的な影響と epratuzumab 婚約の N 結合糖鎖の重要な役割を明らかにしました。

<table><tbody><tr><td>0.22 以上 μ;m Steritop</td><td>フィルターEMDミリポア</td><td>SCGPS02RE</td><td></td></tr><tr><td>10ウェル 4-15%グラジエントSDS-PAGEゲル</td><td>バイオ・ラッド</td><td>4561084</td><td></td></tr><tr><td>10xグリコバッファー 3</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>P0702S</td><td>遠藤H試薬が付属</td></tr><tr><td>10x キネティクスバッファー</td><td>PALL Fort&eacute;Bio</td><td>18-1092</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 丸底 96 ウェルブロック</td><td>ThermoFisher</td><td>260251</td><td></td></tr><tr><td>22 mm カバースリップ</td><td>Hampton research</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>96-3 well INTELLIPLATE&nbsp; Low Volume reservior</td><td>Art Robbinsインスツルメンツ</td><td>102-0001-03</td><td></td></tr><tr><td>AgeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0552S</td><td></td></tr><tr><td>&Auml;KTAピュア</td><td>GEヘルスケア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml;KTAスタート&nbsp;</td><td>GEヘルスケア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アミコンウルトラ 15 遠心ろ過装置 10KDa MWCO</td><td>ミリポア</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>アミコンウルトラ 4 遠心ろ過装置 10KDa MWCO</td><td>ミリポア</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>Auto-iTC200</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL マイクロチューブ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm</td><td>ハンプトン研究</td><td>HR4-945</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm</td><td>ハンプトン研究</td><td>HR4-947</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm</td><td>ハンプトン研究</td><td>HR4-970</td><td></td></tr><tr><td>デジタルドライバス</td><td>Bio-Rad</td><td>1660562EDU</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌DH5&alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>Endo H</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702S</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer フラスコ (バッフルベース), ポリカーボネート, 滅菌済み, 500 mL, DuoCAP</td><td>TriForest Labware</td><td>FBC05000S</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer フラスコ 125 mL (バッフルベース), ポリカーボネート, 滅菌済み, 125 mL ベンテートキャップ付き</td><td>VWR</td><td>89095-258</td><td></td></tr><tr><td>Falcon ディスポーザブル滅菌血清学的ピペット, 非発熱性,10 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 使い捨て滅菌血清ピペット、非発熱性、25 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 使い捨て滅菌血清ピペット、非発熱性、5 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 使い捨て滅菌血清ピペット、非発熱性、50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>768180</td><td></td></tr><tr><td>FectoPRO DNA トランスフェクション試薬 Polyplus</td><td>VWR</td><td>10118-842</td><td></td></tr><tr><td>フリースタイル 293F 細胞</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R79007</td><td></td></tr><tr><td>フリースタイル発現培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12338001</td><td></td></tr><tr><td>ヘビーアトムスクリーン オー</td><td>ハンプトン研究</td><td>HR2-444</td><td></td></tr><tr><td>ヘビーアトムスクリーン Hg</td><td>ハンプトン研究</td><td>HR2-446</td><td></td></tr><tr><td>ヘビーアトムスクリーン M1</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-448</td><td></td></tr><tr><td>ヘビーアトムスクリーン M2</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-450</td><td></td></tr><tr><td>ヘビーアトムスクリーン Pt</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-442</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293S</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap アフィニティカラム</td><td>GE ヘルスケア</td><td>17525501</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap KappaSelect アフィニティカラム</td><td>GE Healthcare</td><td>17545811</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap LambdaSelect アフィニティカラム</td><td>GE Healthcare</td><td>17548211</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-1 クリスタルスクリーン 1.7 mL ブロック</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-1</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-2 クリスタルスクリーン 1.7 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ブロックAnatrace</td><td>MCSG-3</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-4 クリスタル スクリーン 1.7 mL ブロック</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-4</td><td></td></tr><tr><td>塩化水銀</td><td>Σ</td><td>1044170100</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレート、96 ウェル、ポリプロペラ、平底、黒&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>Minstrel DT UV</td><td>Formulatrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro シェーカー</td><td>Infors HT</td><td>MP25-TA-CO2HB</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c 分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep 3K オメガ遠心装置</td><td>PALL ライフサイエンス</td><td>OD003C33</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA バイオセンサー</td><td>PALLフォート&eacute;Bio</td><td>18-5102</td><td></td></tr><tr><td>Octet RED96</td><td>PALL ForteBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oryx 4 crystallizaiton ロボット</td><td>Douglas Instrument</td><td>ORY-4/1</td><td></td></tr><tr><td>塩化プラチナ</td><td>Sigma</td><td>520632-1g</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210006</td><td></td></tr><tr><td>Quick Coomassie Stain</td><td>Protein Ark</td><td>GEN-QC-STAIN-1L</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip 滅菌 50 mL 使い捨て真空ろ過システム 0.22 & マイクロ;m Millipore Express</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17517201</td><td></td></tr><tr><td>臭化タンタルクラスター</td><td>イエナ バイオサイエンス</td><td>PK-103</td><td></td></tr><tr><td>Top96 結晶化スクリーン</td><td>リガク試薬</td><td>1009846</td><td></td></tr><tr><td>トリファンブルー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>VDX 24ウェル、シーラント</td><td>付きハンプトンリサーチ</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;2-6 シアリルラクトース</td><td>Σ アルドリッチ</td><td>A8556-1mg</td><td></td></tr></tbody></table>

糖タンパク質 x 線結晶構造解析および生物物理学的手法によって、免疫グロブリンフォールドのキャラクタリゼーション

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

細胞表面の糖タンパク質は、シグナリング、密着性と輸送を含む細胞の機能に重要な役割を果たします。白血球、免疫グロブリン (Ig) ひだを持っているこれらの糖タンパク質のいくつかと免疫認識と制御の中心であります。デザイン、表現、CD22 ヒト B 細胞受容体の細胞外ドメインの生物物理特性評価のためのプラットフォームを紹介します。これらのアプローチが広く Ig ドメインを含む哺乳類の糖タンパク質 ectodomains の評価に適用されることを提案します。2 懸濁液人間の萌芽期の腎臓 (HEK) 細胞ライン、HEK293F、HEK293S は、複雑で高マンノース糖鎖をそれぞれきょくひ糖タンパク質を表現する使用されます。異なる従ってこれら遺伝子組換え糖タンパク質糖鎖のサイズおよびリガンド結合の組成の影響を調査を許可します。動態と生体関連配位子および治療用抗体の候補者に糖タンパク質結合の熱力学的性質を研究するためのプロトコルについて述べる。HEK293S 細胞における組換えタンパク質結晶化糖鎖の均一性、減らされた柔軟性とエンドグリコシダーゼ H 治療への感受性のために適しています。重原子と小分子リガンド結合の解析と位相決定の糖タンパク質結晶をそれぞれ浸漬法を提案します。説明する実験的プロトコルはここでその機能への洞察力を与えるし、治療薬の作用のメカニズムを調査する哺乳類の糖タンパク質のキャラクタリゼーションのための約束を保持します。

CD22 ECD のいくつかの構造を正常に pHLsec の発現ベクターにクローン化し、哺乳類 HEK293F と HEK293S 細胞 (図 2および 3 a) で過剰に発現します。すべての構成要素はサイズ排除クロマトグラフィーによってサイズの同質性に浄化され、結晶化の研究 (図 3 b 3 C) の非常に純粋なサンプルが得られました。よく回折結晶につながった CD22 構築された HEK293S 細胞をそのようなだけで 5 つ、6 予測 N-糖鎖付加部位 (N67A、N112A、N135A、N164A、N231A)、翼に Asn から突然変異したのと d1 d3 切り捨て (残 20-330)、生産N101 が保持された位置にグリコシル化反応サイト (このコンス トラクターの名前は CD2220 330, 5 a)。結晶は MCSG 1 スパース マトリックス画面のいくつかの条件で得られたが、最高の結晶条件の 30% (w/v) ポリエチレング リコール 4000、塩化リチウム 0.2 M、0.1 M トリスを含む pH 8.5 から。これらのネイティブ結晶 2.1 Å 分解能の回折有機合成に関係するタンパク質の Ig ドメインの知られている構造を用いた MR 検索へのソリューションに至らなかった。
位相情報を取得するには、我々 は HA インキュベーション時間を 5 分から 1 d (図 4) の化合物の 1 〜 20 ミリメートルに至る濃度に Hg、Pt や Os、Ta、Br を含まれている HA 化合物のパネルとネイティブ結晶を浸した。我々 は結晶の形態の変化を監視し、発見急速な割れと結晶の溶解の結果結晶は HA 化合物 20 mM で浸漬します。第二水銀塩化水銀酢酸、塩化白金タンタル臭化クラスターでビショビショだったセット インキュベーション時間を次の形状を保持する 63 の結晶の合計を凍結しました。結晶カナダ光ソース (CLS) 08 BM ビームライン (サスカトゥーン、カナダ) 蛍光スキャンで異常信号を示した 30 分塩化第二水銀の 7 mM を浸したし、多波長異常分散単一の x 線データ収集を許可クリスタル。これらのデータセットは、CD22 の水銀部分構造を解決することができました5 a 20-330、明らかに単一の水銀原子位置 C308 無料システインにバインドされ、最終的に、CD22 の構造を構築することができました、段階的に20-330 5A電子密度マップ オートビルド78を使用しています。
リガンド非結合構造が解決された後、リガンドである α 2-6 siallylactose にバインド CD22 の構造の解決に興味を持っていた。我々 はまず、ITC を使用して相互作用の結合の熱力学を特徴付ける α 2-6/シアリルラクトースに向かって CD22 の親和性を計算されます。〜 280 μ M の親和性を観察し、初期濃度を識別するためにこの情報を使用 (~ 100 KDx) ネイティブ CD2220 330, 5 a水晶の浸漬に使用する配位子の。我々 は 5 分、2 時間、14 h、40 h と 5 d の 25 mM siallylactose で CD2220 330, 5 a水晶を浸漬し、結晶形態の変化の監視します。~ 75 結晶の合計は時間の様々 なポイントから冷凍され、CLS 放射光ビームライン 08-ID (サスカトゥーン、カナダ) リモート データ収集のために送信されます。6 x 線データセットの合計は、よく回折結晶から収集されました。各 x 線データセットの構造は、リガンド非結合型 CD2220 330, 5 aの構造を使用して最初の検索モデルとして氏によって解決されました。すべてのデータセットの結果の電子密度は、CD22 のバインディング サイト内 α 2-6/シアリルラクトースをバインドに対応する Fo Fc マップで肯定的な密度の検査された.驚くことに、すべてのデータセット、収集後インキュベーション時間の 5 分のみ含まれる結合部位でリガンドに対応する肯定的な密度を浸した結晶からであって。リガンド非結合状態とリガンド結合状態の CD22 の全体的な構造 α 2-6/シアリルラクトース浸漬実験の成功を説明するかもしれない最小限の構造変化と非常に類似していた。
我々 は次に CD22 バリと ITC の実験 (図 5) で抗体 epratuzumab によって認識される抗原の表面が特徴です。Epratuzumab 異なる従って CD22 コンストラクトする Fab バインディングの速度論と熱力学のプロファイルで小さい糖鎖 (327 nM 対 24 nM の親和性で 14-fold 改善まで N リンク糖鎖の減らされたサイズと CD22 に増加の親和性を明らかにでバリ;188 nM 対 58 nM ITC)。CD22 のシングル ポイント変異体を用いたバリと epratuzumab Fab CD22 d1 d3 共結晶構造28を解くことによってそのエピトープに対する抗体のアクセスを制限する CD22 N 型糖鎖が確認されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig1.jpg"> 図 1.生物物理構造と構造設計から糖タンパク質特性の概要。(1) 主要な代表的な糖タンパク質の解析。グレー、細胞外ドメイン (ECD);緑で、膜貫通 (TM) セグメント;青、糖タンパク質の細胞内ドメインで。予測された N 結合糖鎖が付いています。ECD の構成要素 (2) のクローニング。(ECD の式 3) は、哺乳類細胞で構築します。(4) 糖蛋白質の浄化。HEK293F タンパク質、複合糖鎖に含まれるタンパク質 HEK293S 高マンノース糖鎖を持っています。糖タンパク質の酵素治療は糖タンパク質 N リンク糖鎖修飾部位の部位でのみ GlcNAc の遠藤 H の結果と HEK293S 細胞で生産されます。(5 a) 糖タンパク質の抗体に結合する biolayer 干渉計 (結合) と等温滴定型熱量計 (ITC) によってテストされます。小さなリガンドへの親和性は、ITC が測定できます。均一 N 結合糖、いくつかのケースで遠藤秀 (6) と HEK293S と deglycosylated で表現したものなどの糖タンパク質の (5 b) 結晶化試行 N リンク糖鎖修飾部位の変異は、結晶を取得する必要です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig2.jpg"> 図 2.哺乳類細胞における発現の DNA を構築 CD22 外部ドメインの設計.A) CD22 ECD コンストラクト トランスフェクション用 pHLsec プラスミドの表現。上井、KpnI サイト クローニングに使用は、赤いボックスで示されます。B) 、CD22 ECD には 7 の Ig ドメイン (d1-d7) と (青) の 12 の予測の N 結合糖サイトが含まれています。4 つの構成要素は、CD22 ECD から設計されていた。C) pHLsec 哺乳類発現ベクターにクローニングに CD22 ECD の PCR 産物を示す 1% アガロースゲルを構築します。第 1 レーンには、1 kb の DNA マーカーが含まれています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig3.jpg"> 図 3.発現・精製糖タンパク質。A)式収量に及ぼす細胞密度。25 mL の小規模文化 HEK293F 懸濁細胞の糖蛋白 transfected セル (106セル mL-1x 0.5、106セル mL-1、x 1.0 および 1.5 倍の6セル 10mlの 3 つの異なる開始密度を使用して-1)。右側のパネルで定量的なバリ、SDS ページの左側のパネルのデンシトメトリーによる定量化を行った値は、1 つの糖蛋白質の準備の代表です。B)の最初の精製ステップのクロマト グラムを構築 CD2220 330, 5 aから Ni NTA のアフィニ ティー ・ カラムを使用して上清の 600 mL。糖タンパク質は、100% が 500 mM のイミダゾールを含む溶出バッファーに対応するイミダゾール (灰色の線) のグラデーションを使用して溶出しました。プールされた分数は垂直線で描かれています。C)サイズ排除クロマト グラムの構築 CD2220-330 5A高パフォーマンスを使用してゲルろ過カラム。溶出ピークからプールされた分数は垂直線で描かれています。Inset: Coomassie ステンド SDS-PAGE のゲルは、糖タンパク質の純度を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig4.jpg"> 図 4.クリスタル重原子で浸漬.A) サンプル ワークステーション HA 化合物とネイティブ結晶を浸すため。必要なすべてのツールが表示されます。B) の結晶を吸収する手順構築 CD2220 330, 5 aと HA の化合物。ステップ 1を開くも、結晶と HA の最終濃度範囲は 1-10 の mM から、結晶化条件で希釈した HA ソリューションを含むカバー スリップ上 0.2 μ L ドロップするループを用いた転送結晶を含みます。ステップ 2、結晶化プレートでドロップをシールし、異なる期間にわたって複合 HA 結晶を孵化させなさい。ステップ 3ループでずぶぬれのクリスタルを実装し、バック-ソーク 30 カバー スリップ上分配 20% (v/v) グリセロールを添加した母酒ソリューションを含む連続 0.2 μ l 値下がりで s。ステップ 4、フラッシュ凍結液体窒素でループ マウント結晶と放射光ビームラインに出荷のためのパックにそれを置きます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig5.jpg"> 図 5.Biolayer 干渉法と等温の滴定の熱量測定測定A)代表者バリ実験。上部パネル:次が分類される動力学実験のためプレート セットアップの例: 1 x 速度バッファー (B)、彼の6 の x-タグ糖タンパク質 (L) を読み込み、代表的なファブ濃度 (500、250、125、62.5 nM)、PBS + 500 ミリメートル再生バッファー (R) と中性化速度 x 1 バッファー (B)。まあ、溶液 200 μ L が含まれています。動力学実験のステップ数は、プレートの上部に表示されます。中間パネル:Ni 国税庁バイオ センサーを用いてバリ実験と上部パネルで説明板の代表的な生データです。手順番号は、基準 (1)、彼の6 x糖タンパク質 (2) を読み込み、基準 (3)、Fab (4) と (5) 解離のシリアル希釈で協会に対応します。再生の手順 (手順 6 ~ 7) を表します。底板:生協会と解離 (青線) 対応する 1:1 を示す代表的な分析データに適合 (赤線)。B) 上部パネル: 96 ウェル底ブロック ラウンドの 7 つの実験で自動化された ITC 楽器で単一 itc 代表プレート セットアップを実行します。各実験は 3 つの井戸ので構成されます。最初の井戸 (赤) がセル (400 μ L) のサンプルに対応して、シリンジ (120 μ L) のサンプルに対応する 2 番目の井戸 (緑)。3 番目はよく空になって、混合サンプルがこれによくテストの完了の後返されます。実験 1、2、および 7 は、バッファー コントロールのバッファーです。実験 3-5 は、セルと Fab や配位子 (L) シリンジ内で糖タンパク質 (P) と帳票の実験を表しています。実験 6 配位子熱希釈コントロールを表し、データ分析中に 3-5 の実験から減算する必要があります。底板:代表的な生 (上) と Fab (epratuzumab) CD22 ECD へのバインドを示す加工 (下) ITC データは HEK293F 細胞で生産されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

Biolayer 干渉計、等温滴定型熱量計、x 線結晶構造解析、免疫グロブリン倍で糖タンパク質の構造と特性評価のためのアプローチを提案します。

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

この方法は、糖タンパク質分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。タンパク質の機能、N結合型糖鎖の役割、糖タンパク質を標的とする抗生物質のメカニズムと作用に関する洞察を提供します。この技術の主な利点は、関心のある任意の糖タンパク質に適用できることです。幅広い糖タンパク質ターゲットの構造的および生物物理学的特性評価を促進します。この手続きを実演するのは、当研究室の研究プロジェクトコーディネーターであるHong Cuiです。まず、テキストプロトコルに概説されているように細胞を調製し、トランスフェクションします。細胞を6,371倍のgおよび摂氏4度で20分間遠心分離することにより、細胞を回収します。上清を保持し、0.22ミクロンのフィルターを使用してろ過します。ろ過した上清を毎分 4 mL でベンチトップクロマトグラフィーシステムの Ni-NTA カラムにロードします。この後、3〜4容量の洗浄バッファーでカラムを洗浄します。精製した糖タンパク質をカラムから溶出バッファーグラジエントを使用して希釈し、フラクションを収集します。逃れたピークを含むフラクションを、公称分子量制限が10キロダルトンの遠心ろ過装置で引き出します。次に、Gの4,000倍と摂氏4度で15分間、またはサンプルが500マイクロリットルの容量に達するまで遠心分離して濃縮します。濃縮された糖タンパク質を500マイクロリットルのサンプルループに注入します。FPLCシステム上の4°Cの平衡化済み高性能サイズ排除カラムに糖タンパク質をロードし、フラクションを収集します。この実行後、SDS-PAGEゲルを使用して、脱落した画分が糖タンパク質を含んでいるものを特定し、含んでいるものを引っ張ります。公称分子量制限が10キロダルトンの遠心ろ過装置を使用して、純粋な脱グリコシル化ECDをGの4,000倍、摂氏4度で所望の濃度が得られるまで濃縮します。蛋白質の集中を定める後塵および他の汚染物を取除くために12、000倍のGおよび4の摂氏温度で5分間サンプルを遠心分離機にすること。次に、市販の結晶化スクリーンから80マイクロリットルの結晶化溶液を、96ウェルシッティングドロップ結晶化プレートの各リザーバーウェルに加えます。結晶化ロボットを使用して、タンパク質の滴を結晶化プレートのウェルに分注します。総液滴量200ナノリットルを、精製タンパク質と結晶化溶液の1対1の比率で使用。この後、プレートをテープで密封します。密封されたプレートをプレートイメージャーに移し、可視光と紫外線による検査を行います。最初の糖タンパク質結晶ヘッドを与える条件を特定し、テキストプロトコールで概説されているように、これらの結晶をさらに最適化します。結晶を20%グリセロールを添加した母液の溶液に浸して凍結保護します。次に、クリスタルをCryoLoopsにマウントします。液体窒素を使用して、データ収集前にマウントされた結晶を急速凍結します。24ウェル結晶化プレートでウェルディファリング結晶を作製した後、pH 9.0で50ミリモルの配位子と20ミリモルのトリスを150ミリモルの塩化ナトリウムで調製します。このリガンド溶液を、ECD結晶を含む以前に調製した液滴にさまざまな濃度で加えます。インキュベーション時間の長さが5分から5日の間、液滴を密封します。光学顕微鏡を使用して、結晶を視覚的に追跡し、形態の変化の可能性を特定します。インキュベーション後、CryoLoopsを使用して結晶をマウントし、20%グリセロールを添加した母液溶液で凍結保護します。Bio-Layer Interferometryを開始するには、テキストプロトコルに概説されているように、10X Kinetics Bufferから50 mmの1X Kinetics Bufferを調製します。このバッファーの200マイクロリットルをプレウェッティングプレートに加えます。6つのNi-NTAバイオセンサーをプレートに移し、バッファー内で10分間水和させます。次に、Hisタグ付きECDを1ミリリットルの1X Kinetics Bufferで、最終濃度25ナノグラム/マイクロリットルで希釈します。そして、精製されたFABの段階希釈液を調製します。次に、ここに示すように、試薬を96ウェルのマイクロプレートにアクアテートします。ここで、Bは1X Kinetics Buffer、LはHisタグ付き糖タンパク質負荷量、数値エントリは希釈されたFAB濃度、Rは再生バッファーを表します。水和したバイオセンサーを1X Kinetics Bufferを含むウェルに60秒間移し、ベースライン化します。次に、糖タンパク質を1,000RPMで240秒間、マイクロリットルあたり25ナノグラムの濃度でロードします。バイオセンサーを1X Kinetics Bufferを含むウェルに60秒間戻し、2回目のベースラインを行います。センサーをFABの段階希釈液を含むウェルに180秒間移します。この会合フェーズの後、バイオセンサーを1X Kinetics Bufferに戻し、180秒間の解離ステップを行います。次に、解析ソフトウェアを開きます。タブ 1 で、データをインポートして選択します。タブ 2 のステップ 1 のデータ選択で、センサーの選択を選択します。リファレンスウェルをハイライト表示し、右クリックしてリファレンスウェルを設定します。ステップ2の減算で、参照ウェルを選択します。この後、ステップ 3 の [Y 軸の整列] で [ベースライン] を選択し、0.1 秒から 59.8 秒の時間範囲を設定します。ステップ 4 で、ステップ間補正を選択し、分離に整列します。次に、ステップ 5 で Savitzky-Golay Filtering を処理し、[データの処理] をクリックします。タブ3へのゲート。ステップ2では、1対1のモデルで解析し、関連付けと解離を選択し、グローバルフィットを選択し、色でグループ化します。カーブを右クリックし、[色を設定]をクリックして、すべてのカーブを目的の色に設定します。この後、カーブのフィットを選択します。データが適切に適合している場合は、[レポートの保存] をクリックして結果をエクスポートします。必要なすべての条件で実験を繰り返します。この研究では、CD22細胞外ドメインのいくつかのコンストラクトがpHL-sec発現ベクターにうまくクローニングされます。これらのコンストラクトは、その後、哺乳類のHEK293-FおよびHEK293-S細胞株で過剰発現します。一方、1ミリリットルあたり約100万個および150万個の細胞を含む培養物は、非常に類似したレベルの糖タンパク質を発現した。ミリリットルあたりわずか50万個の細胞の培養物は、発現が著しく少なかった。この後、培養物を回収し、ECD糖タンパク質をアフィニティーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって単離し、すべてのコンストラクトをサイズ均一に精製します。結晶化および生物物理学的研究のための高純度サンプルが得られます。これらの手順に続いて、全長の細胞外ドメインまたはタンパク質複合体の三次元構造に関する追加の質問に答えるために、特異粒子電子顕微鏡などの他の方法を実行できます。このビデオを見れば、糖タンパク質、そのリガンド、および標的抗体の発現、精製、構造的および生物物理学的特性評価の方法について十分に理解できるはずです。

characterization-glycoproteins-with-immunoglobulin-fold-x-ray

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