糖タンパク質 x 線結晶構造解析および生物物理学的手法によって、免疫グロブリンフォールドのキャラクタリゼーション

この方法は、糖タンパク質分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。タンパク質の機能、N結合型糖鎖の役割、糖タンパク質を標的とする抗生物質のメカニズムと作用に関する洞察を提供します。この技術の主な利点は、関心のある任意の糖タンパク質に適用できることです。

幅広い糖タンパク質ターゲットの構造的および生物物理学的特性評価を促進します。この手続きを実演するのは、当研究室の研究プロジェクトコーディネーターであるHong Cuiです。まず、テキストプロトコルに概説されているように細胞を調製し、トランスフェクションします。

細胞を6,371倍のgおよび摂氏4度で20分間遠心分離することにより、細胞を回収します。上清を保持し、0.22ミクロンのフィルターを使用してろ過します。ろ過した上清を毎分 4 mL でベンチトップクロマトグラフィーシステムの Ni-NTA カラムにロードします。

この後、3〜4容量の洗浄バッファーでカラムを洗浄します。精製した糖タンパク質をカラムから溶出バッファーグラジエントを使用して希釈し、フラクションを収集します。逃れたピークを含むフラクションを、公称分子量制限が10キロダルトンの遠心ろ過装置で引き出します。

次に、Gの4,000倍と摂氏4度で15分間、またはサンプルが500マイクロリットルの容量に達するまで遠心分離して濃縮します。濃縮された糖タンパク質を500マイクロリットルのサンプルループに注入します。FPLCシステム上の4°Cの平衡化済み高性能サイズ排除カラムに糖タンパク質をロードし、フラクションを収集します。

この実行後、SDS-PAGEゲルを使用して、脱落した画分が糖タンパク質を含んでいるものを特定し、含んでいるものを引っ張ります。公称分子量制限が10キロダルトンの遠心ろ過装置を使用して、純粋な脱グリコシル化ECDをGの4,000倍、摂氏4度で所望の濃度が得られるまで濃縮します。蛋白質の集中を定める後塵および他の汚染物を取除くために12、000倍のGおよび4の摂氏温度で5分間サンプルを遠心分離機にすること。

次に、市販の結晶化スクリーンから80マイクロリットルの結晶化溶液を、96ウェルシッティングドロップ結晶化プレートの各リザーバーウェルに加えます。結晶化ロボットを使用して、タンパク質の滴を結晶化プレートのウェルに分注します。総液滴量200ナノリットルを、精製タンパク質と結晶化溶液の1対1の比率で使用。

この後、プレートをテープで密封します。密封されたプレートをプレートイメージャーに移し、可視光と紫外線による検査を行います。最初の糖タンパク質結晶ヘッドを与える条件を特定し、テキストプロトコールで概説されているように、これらの結晶をさらに最適化します。

結晶を20%グリセロールを添加した母液の溶液に浸して凍結保護します。次に、クリスタルをCryoLoopsにマウントします。液体窒素を使用して、データ収集前にマウントされた結晶を急速凍結します。

24ウェル結晶化プレートでウェルディファリング結晶を作製した後、pH 9.0で50ミリモルの配位子と20ミリモルのトリスを150ミリモルの塩化ナトリウムで調製します。このリガンド溶液を、ECD結晶を含む以前に調製した液滴にさまざまな濃度で加えます。インキュベーション時間の長さが5分から5日の間、液滴を密封します。

光学顕微鏡を使用して、結晶を視覚的に追跡し、形態の変化の可能性を特定します。インキュベーション後、CryoLoopsを使用して結晶をマウントし、20%グリセロールを添加した母液溶液で凍結保護します。Bio-Layer Interferometryを開始するには、テキストプロトコルに概説されているように、10X Kinetics Bufferから50 mmの1X Kinetics Bufferを調製します。

このバッファーの200マイクロリットルをプレウェッティングプレートに加えます。6つのNi-NTAバイオセンサーをプレートに移し、バッファー内で10分間水和させます。次に、Hisタグ付きECDを1ミリリットルの1X Kinetics Bufferで、最終濃度25ナノグラム/マイクロリットルで希釈します。

そして、精製されたFABの段階希釈液を調製します。次に、ここに示すように、試薬を96ウェルのマイクロプレートにアクアテートします。ここで、Bは1X Kinetics Buffer、LはHisタグ付き糖タンパク質負荷量、数値エントリは希釈されたFAB濃度、Rは再生バッファーを表します。

水和したバイオセンサーを1X Kinetics Bufferを含むウェルに60秒間移し、ベースライン化します。次に、糖タンパク質を1,000RPMで240秒間、マイクロリットルあたり25ナノグラムの濃度でロードします。バイオセンサーを1X Kinetics Bufferを含むウェルに60秒間戻し、2回目のベースラインを行います。

センサーをFABの段階希釈液を含むウェルに180秒間移します。この会合フェーズの後、バイオセンサーを1X Kinetics Bufferに戻し、180秒間の解離ステップを行います。次に、解析ソフトウェアを開きます。

タブ 1 で、データをインポートして選択します。タブ 2 のステップ 1 のデータ選択で、センサーの選択を選択します。リファレンスウェルをハイライト表示し、右クリックしてリファレンスウェルを設定します。

ステップ2の減算で、参照ウェルを選択します。この後、ステップ 3 の [Y 軸の整列] で [ベースライン] を選択し、0.1 秒から 59.8 秒の時間範囲を設定します。ステップ 4 で、ステップ間補正を選択し、分離に整列します。

次に、ステップ 5 で Savitzky-Golay Filtering を処理し、[データの処理] をクリックします。タブ3へのゲート。ステップ2では、1対1のモデルで解析し、関連付けと解離を選択し、グローバルフィットを選択し、色でグループ化します。

カーブを右クリックし、[色を設定]をクリックして、すべてのカーブを目的の色に設定します。この後、カーブのフィットを選択します。データが適切に適合している場合は、[レポートの保存] をクリックして結果をエクスポートします。

必要なすべての条件で実験を繰り返します。この研究では、CD22細胞外ドメインのいくつかのコンストラクトがpHL-sec発現ベクターにうまくクローニングされます。これらのコンストラクトは、その後、哺乳類のHEK293-FおよびHEK293-S細胞株で過剰発現します。

一方、1ミリリットルあたり約100万個および150万個の細胞を含む培養物は、非常に類似したレベルの糖タンパク質を発現した。ミリリットルあたりわずか50万個の細胞の培養物は、発現が著しく少なかった。この後、培養物を回収し、ECD糖タンパク質をアフィニティーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって単離し、すべてのコンストラクトをサイズ均一に精製します。

結晶化および生物物理学的研究のための高純度サンプルが得られます。これらの手順に続いて、全長の細胞外ドメインまたはタンパク質複合体の三次元構造に関する追加の質問に答えるために、特異粒子電子顕微鏡などの他の方法を実行できます。このビデオを見れば、糖タンパク質、そのリガンド、および標的抗体の発現、精製、構造的および生物物理学的特性評価の方法について十分に理解できるはずです。