Name: その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソ フォームの Heterodimerization の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学ぶその場で近接結紮アッセイ（PLA）を用いたタンパク質ヘテロ二量体化の検出法。固定細胞内でMST1/MST2相互作用を高感度に可視化し、細胞シグナル伝達メカニズムを解明する手法です。

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最適化と特定のマリア ラドゥとガリーナ Semenova で、このプロトコルの検証に貢献する検査室全体のチャーノフに感謝いたします。また、フォックスチェイスがんセンターの細胞イメージング施設のアンドレイ エフィーモフを感謝いたします。この作品は、JC に NIH (R01 CA148805) からの助成金によって支えられました。

1. 溶液の調製
<ol><li>固定液の準備: 1 × PBS で 4% パラホルムアルデヒド (PFA)。10 mL の 16% の 2.5 mL を取る PFA 7.5 mL の 1x PBS を追加。 の危険性:PFA は、低用量で発がん性があります。ガスや皮膚への接触は危険です。-20 ° C にてストア</li>
	<li>透過ソリューションを準備: 0.1 %1 × PBS でトリトン X-100。溶液 100 mL、100 mL の 1x PBS にトリトン X-100 の 100 μ L を追加します。常温 (RT) を格納します。</li>
	<li>1 x TBST 洗浄バッファーを準備します。。1 L 用 10 x TBS 100 mL、dH2O, 890 mL と 10 mL の Tween 20 (10%) を取る。</li>
	<li>キットによって提供されたブロッキング液を準備します。また、1 x PBS 溶液 2 %bsa を使用します。</li>
	<li>キットによって提供された抗体希釈液を準備します。また、1 x PBS 溶液 1 %bsa を使用します。</li>
</ol>2. 細胞のめっき
注:本研究で我々 は不死化ヒト シュワン細胞 (iHSC) と人間の萌芽期の腎臓 293 の細胞 (HEK 293); を使用ただし、付着性のセルの多くの種類のこのメソッドを使用することができます。
<ol><li>文化 10 %dmem の HEK 293 FBS、0.2% グルコース、2 mM L グルタミン、100 U/mL ペニシリン G、100 μ g/mL 5% CO2の 37 ° C で培養処理板のストレプトマイシン。FBS/DMEM 補完ペン/連鎖球菌と 2 μ M フォルスコリン 10% で iHSC を維持します。マイコ プラズマの細胞を定期的にテストします。セルの行の認証は行われませんでした。</li>
	<li>10 μ G/ml 自然マウス ラミニン, 0.01% ポリ L リジン溶液 50 μ L で 16 ウェル チェンバー スライドをコートし、5% CO2の 37 ° C で 30 分間インキュベートします。0.04% トリプシン-EDTA を使用してセルを分割します。</li>
	<li>プレート iHSC と 80% 合流 (15,000-25,000 細胞/ウェル) に媒体の 100 μ L の HEK 293。</li>
	<li>12 細胞をインキュベート-24 時間加湿、37 ° C で 5% CO2インキュベーター。</li>
</ol>3. 固定・透過
<ol><li>井戸からメディアを取り出して、1 x pbs 100 μ L で洗います。サンプルを削除する危険性を最小限に抑えるためにマイクロ ピペットで吸い出しなさい。</li>
	<li>4 %pfa あたりも、撹拌せず常温では、10 分間インキュベートの 50 μ L を追加することによって、セルを修正します。細胞が剥離に敏感、セルに直接ソリューションをピペッティングをしないように。</li>
	<li>0.05% 血球を洗浄 3 回各 5 分の TBST。サンプルを削除する危険性を最小限に抑えるためにマイクロ ピペットで吸い出しなさい。</li>
	<li>10 分間室温撹拌せず透過ソリューション (1x PBS で 0.1% トリトン x-100) とセルを扱う</li>
	<li>3 回の撹拌で各 5 分 tbst 細胞を洗います。</li>
</ol>4 ブロック
<ol><li>(マイクロ ピペット) で非常に軽く TBST オフをタップします。セルのまま接続されているかどうかを参照してくださいするには顕微鏡でスライドを視覚化します。</li>
	<li>各サンプルに x ブロック ソリューション 1 の一滴 (50-60 μ L) を追加します。</li>
	<li>予熱して 37 ° c 湿度チャンバー (水と空のヒント ボックス) と 37 ° C で 1 時間のスライドを孵化させなさい</li>
</ol>5. 一次抗体
<ol><li>一次抗体 (1: 100) 抗体希釈剤で希釈 (材料の表を参照してください)。ウェルあたり 40 μ L 抗体溶液を準備します。</li>
	<li>スライドから液体をオフをタップしてブロック ソリューションを削除します。細胞を乾燥させるようにしてください。</li>
	<li>渦、各ウェルに抗体溶液の 40 μ L を追加。</li>
	<li>予熱した湿度チャンバーで 37 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
</ol>6. 近接結紮測定プローブ
注: PLA プローブは、キットの一部として提供されます (材料の表を参照してください)。プローブの選択は興味の蛋白質を検出するために使用する一次抗体の種によって決まります。
<ol><li>2 つの PLA プローブ (抗マウス マイナスとプラス抗家兎) を希釈抗体希釈で 1:5。各サンプルは、PLA プローブの 40 μ L を準備します。室温に 20 分間混合物を孵化させなさい</li>
	<li>スライドから一次抗体溶液をタップします。室温 2 回洗浄バッファーで各 5 分用のスライドを洗う</li>
	<li>軽くスライドから洗浄バッファーのタップし、井戸 (40 μ L/ウェル) に希釈の PLA プローブ ソリューションを追加します。</li>
	<li>37 ° C で 1 時間予熱した湿度チャンバー内でスライドを孵化させなさい</li>
</ol>7. 結紮
注:の in situ検出試薬赤、リガーゼと結紮ソリューション キットの一部として提供されます (材料の表を参照してください)。
<ol><li>その場で検出試薬赤を使用します。</li>
	<li>直前に使用、渦および希釈 1:5 の高純度水結紮株式 x 5 の必要なボリューム。 注: は、希釈した試薬を保管しないでください。</li>
	<li>オフにスライドから PLA プローブ ソリューションをタップします。室温、5 分のために二度洗浄バッファー x 1 のスライドを洗う</li>
	<li>サンプルでは、加算の前にすぐに渦 1:40 にリガーゼを結紮ソリューションに追加および希釈と渦をもう一度。</li>
	<li>スライドから洗浄バッファーをオフにタップし、結紮/リガーゼ ソリューションを各ウェル (40 μ L/ウェル) に追加します。</li>
	<li>37 ° C で 30 分間予熱した湿度チャンバー内でスライドを孵化させなさい</li>
</ol>8. 増幅
注: 増幅在庫キットの一部として提供が (材料の表を参照してください)。試薬は光に敏感です。光にスライドを公開することを回避します。
<ol><li>渦と増幅株式高純度水の 1:5 x 5 の必要なボリュームを希釈し、ミックスします。</li>
	<li>オフにスライドから結紮/リガーゼ ソリューションをタップします。室温、2 分のために二度洗浄バッファー × 1 でスライドを洗う</li>
	<li>渦、再び 1/80 希釈と渦で増幅ソリューションにポリメラーゼを追加。</li>
	<li>洗浄バッファーをオフにスライドからタップし、増幅/ポリメラーゼ ソリューションを各ウェル (40 μ L/ウェル) に追加します。37 ° C で 100 分間予熱した湿度チャンバー内でスライドを孵化させなさい</li>
</ol>9. イメージングのための準備
注:これらは光の敏感な試薬です。スライドを光から保護をしてください。
<ol><li>スライドから増幅ポリメラーゼ ソリューションをオフにタップし、洗浄 10 分 2 回の x 室温洗浄バッファーごとに 1</li>
	<li>完全にチャンバーと井戸のまわりでシリコーンをスライドから削除します。かみそりでシリコンの残りのビットをオフにこすり。それぞれが分離スライドにグリッドを描くも。</li>
	<li>DAPI でメディアをマウントの ~ 40 μ L を追加します。カバー スリップの下で気泡を引っかけないように注意してください。カバー スリップの端は、マニキュアで密封することができます。</li>
	<li>共焦点顕微鏡を用いた画像解析を実行する前に、少なくとも 20 分待ちます。 注:プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
	<li>イメージング後に、、暗闇の中で-20 ° C でスライドを保存します。</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nore1B%2FMst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na%C3%AFve+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li>
<li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOBKL1A%2FMOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li>
<li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li>
<li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1%2FMst2Heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li>
<li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20-like+protein+kinase%2C+Mst1%2C+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li>
<li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li>
<li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li>
<li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li>
<li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

(14-16) 培養細胞での実験を実行する非常に便利だし、サンプルの顕微鏡分析中にすべての時間を変更する必要はありません、この実験用チャンバー スライド ガラスを使用すると便利だとわかった。抗体との交差汚染のリスクの増大など、いくつかの合併症が発生します。したがって、各ウェルを洗浄することをお勧め、実験の期間の増加にもかかわらずの Coplin jar を使用する代わりに個別に。さらに、シリコン挿入の除去、繊細な仕事であり、注意と忍耐で行う必要があります。細心の技術とも挿入を除去した後少量のシリコンの残骸を見ることが可能ことがあります。このため、1 つ削除する必要があるシリコン挿入綿密、あまり外しシリコーンは顕微鏡の中に共焦点距離を変えることができるよう必要に応じて、黒人を使用しています。顕微鏡下で細胞を見つけるためにシリコン カバーの取り外し後井戸の境界線として線を描画することもできます。
非交差反応性一次抗体それぞれが、ヘテロダイマーの 1 つだけメンバーを認識することが不可欠です (例えば、 MST1 抗体必要がありますも認識 MST2 と逆</em...

MST1/カバ シグナリングパスの中断は、発達障害や発癌1に接続されています。哺乳類で MST2 と MST1 キナーゼをアクティブ化 (リン酸化) MOB1 と LATS1/2、後者の場合、廃止し、転写コアクチベーターはい関連タンパク質 (ヤップ)2を不活性化します。アクティブ (ペプタイド) 形式でヤップは発癌性活動は、細胞増殖の遺伝子のトランスクリプションを高める逆に、ヤップはカバ経路による不活化、細胞増殖の抑制し、アポトーシス促進3。体内では、MST1 と MST2 アクティブな homodimers として主に存在しますが、発癌刺激 MST1/MST2 ヘテロのレベルを増やすことができます、このようなヘテロ非アクティブ4。ただし、MST1/MST2 heterodimerization の規制方法の不十分な理解ままです。両方ホモ ・ ヘテロが仲介経由MST1 の C ターミナル コイルド コイル領域と相互 MST2 サラ ドメイン5として知られています。を使用して、その場でPLA は人間シュワン細胞 (HSC) と人間の萌芽期の腎臓の細胞 (HEK 293) に MST1/MST2 ヘテロの存在を示すこの資料で説明します。PLA は、他のタンパク質・ タンパク質相互作用検出方法上の利点を識別して定量化導入遺伝子発現の必要性または epitope の札の使用なしで内因性のタンパク質の相互作用を検出できるので6。
シグナル伝達経路はタンパク質の条件付きの協会によって主制御されます。たとえば、ほとんど受容体チロシンキナーゼの刺激は、ホモまたはヘテロ二量化し追加の細胞内シグナル伝達タンパク質は、自身と後続の協会、さらに錯形成をつながる.PLA 法の目的は、蛋白質がより小さい 30-40 nm 離れて細胞、タンパク質間の距離を可視化することです。タンパク質近接は通常種で発生した適切な一次抗体と細胞を培養して、検出 (e.g、ウサギおよびマウス) 各相互作用の蛋白質に対する種特異的な二次抗体を追加する。短い事前結合 DNA プローブします。DNA プローブは近接、特定リンク DNA のオリゴヌクレオチドの in situ PCR またはローリング サークル メカニズムによって増幅するためのプラットフォームを形成、これらのプローブの両方を同時にバインドできます。増幅反応に追加された蛍光タグにより容易に定量化およびセル7,8,内の特定の領域にローカライズできる蛍光ドットとして表示される相互作用の蛋白質の可視化9,10。

<table><tbody><tr><td>チャンバースライド</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>178599</td><td>16 well、スライド</td></tr><tr><td>ガラス PLA プローブ Anti-Mouse Minus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td>1x ブロッキング溶液、1x 抗体希釈剤</td></tr><tr><td>PLA プローブ Anti-Rabbit PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td>1x ブロッキング溶液、1x 抗体希釈液</td></tr> 洗浄<tr><td>バッファー、Flurescence</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>を含むDUO82049</td><td>Wash Buffer AおよびWash Buffer B</td></tr><tr><td>Mounting Medium with DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>Detection Reagents Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92008</td><td>5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase</td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9102s</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>5726s</td><td>pERK抗体</td></tr><tr><td>MST2抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>3952s</td><td></td></tr><tr><td>Krs-2 (RJ-5)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-100449</td><td>MST1</td></tr><tr><td>抗体 16%パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td>PBS中のPFAに希釈して溶液を固定する</td></tr><tr><td>Triton x100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP 151-500</td><td>透過化溶液</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Leica TCS SP8, 63x</td><td></td><td>ImageJ ソフトウェアによる画像解析</td></tr></tbody></table>

その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソ フォームの heterodimerization の検出

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

規制の蛋白質蛋白質の相互作用は多くのシグナル伝達イベントの基本理念と、このようなイベントの検出はそのような経路の編成方法と動作を理解する上で重要な要素。細胞のタンパク質-タンパク質相互作用を検出する多くの方法がありますが、比較的少数は内因性のタンパク質間相互作用を検出する使用できます。そのようなメソッドは、近接結紮アッセイ (PLA) には、その使用をお勧めするいくつか利点があります。タンパク質-タンパク質相互作用解析の他の一般的な方法と比較して、PLA は、比較的高い感度と特異性、最小限の細胞操作と、本明細書に記載されているプロトコルに実行できます、ターゲット固有の唯一の 2 つが必要です。種に由来する抗体 (e.g, マウスおよびウサギから) と 1 つの特殊な試薬: 共有リンク特定のオリゴヌクレオチドは、二次抗体のセット、互いの近くになったときに作成、。in situ PCR やローリング サークル増幅の増幅プラットフォーム。このプレゼンテーションでは、固定細胞における MST1 と MST2 近接の変化を視覚化する PLA 手法を適用する方法を示します。本稿で説明する手法は、細胞のシグナル伝達研究の分析に特に当てはまります。

HEK 293 の iHSC MST1 と MST2 の相互作用をテストするのに PLA の試金を使用しました。セルが固定、グリセリン、および PLA プロトコル (図 1) によるとその場で増幅後、種々 の抗体で染色します。MST1/MST2 heterodimerization のレベルを文書化するには、細胞は MST1 MST2 抗体 (図 1 a、1 C、1 G) で染色しました。肯定的な制御としてまた、ERK を使用し、特典の抗体と細胞に近接する予想されるアクティブ化 ERK (図 1 bおよび1 階)。MST1 と MST2 に欠けているセルは PLA 信号 (図 1) を示さない。細胞の 2 つの抗体の 1 つだけのステンド グラスは、同...

ここでは、近接結紮の試金 (PLA) を使用して感度が高い固定細胞における MST1/MST2 heterodimerization を視覚化する方法を示します。

その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソ フォームの Heterodimerization の検出

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

近接ライゲーションアッセイまたはPLAにおける、タンパク質、貼り付けられた組織、および細胞間の相互作用を検出することができる技術である。タンパク質間の関連は、トランスジェニック発現や追加技術を必要とせずに同定および定量することができる。唯一の要件は、DNAオリゴヌクレオチドで修飾することができる特定の高効率抗体の入手可能性です。組織ではMST1およびMST2は主に活性ホモダイマーとして存在するが、発癌性刺激はMST1 MST2ヘテロ二量体のレベルを増加させることができ、そのようなヘテロ二量体は非活性である。目的のタンパク質に対する特異的プライマー抗体とのインキュベーションに続いて、特殊な特異的二次抗体は、それぞれ、それに結合したユニークで短い、無料のDNA鎖に結合し、一次抗体に結合するためにスロットに添加される。質問中のタンパク質がヘテロ二量体化されている場合、一次抗体とそれらに結合した二次抗体の両方が近接します。この状態では、第2抗体上に付着したDNA鎖は、その後2つの他の2つの円形成DNAオリゴヌクレオチドを添加して相互作用することができる。DNA円の数百倍の複製は、増幅反応後に起こり得、蛍光シグナルは、レベルの高い無料のオリゴヌクレオチドプローブによって生成される。そのため、検出された各信号は、顕微鏡画像に基づいて特定の細胞内の位置に割り当てることができる個々の蛍光ドットとして可視化されます。実験の前日に、マウスラミニンまたはポリLリジンの50〜100マイクロリットルを加えて16の十分にチャンバースライドをコーティングし、摂氏37度でインキュベートします。冷たい溶液を30分除去した後、トリプシンとプレート15,000〜25,000細胞を用いて細胞を16個の十分にチャンバースライドに分割した。加湿した5%の二酸化炭素インキュベーターで37°Cの細胞を24時間インキュベートする。24時間後、ウェルから培地を取り出し、PBSで細胞を静かに洗います。マイクロピペットを使用してサンプルのリスクテイクを最小限に抑え、PBSを吸引し、1ウェルあたり4%PFAの50マイクロリットルを加えて細胞を固定し、攪拌せずに室温で10分間インキュベートします。細胞の剥離をもたらす可能性があるため、溶液を細胞に直接ピペットしないでください。固定後、TBSTで細胞をそれぞれ5分間3回軽い撹拌で洗浄します。次に細胞を透過させ、攪拌することなく室温で10分間インキュベートする。透過性が完了した後、TBSTで細胞を3回洗浄して、1回5分間攪拌します。TBSTを取り外した後、各ウェルにブロッキング溶液の1滴を追加し、摂氏37度で1時間予熱湿度チャンバーにスライドをインキュベートします。希薄な一次抗体。マイクロピペットを使用してブロッキング溶液を取り除きますが、スライドを乾燥させないでください。ボルテックスを適当なウェルに40マイクロリットルの希釈抗体溶液を加え、予熱湿度チャンバーで37°Cで1時間インキュベートします。インキュベーション中に、2つのPLAプローブを抗体希釈剤で希釈します。各サンプルに対して40マイクロリットルのPLAプローブを調製します。1時間のインキュベーションの後、抗体溶液を吸引し、室温でTBSTでスライドを5分間2回洗浄する。スライドからTBSTをそっと取り出し、各ウェルに40マイクロリットルのPLAプローブ溶液を加えます。予熱湿度室でスライドを摂氏37度で1時間インキュベートします。使用直前に高純度水で、結紮ストック1~5の必要量をボルテックスで希釈する。各ウェルに対して40マイクロリットルのライゲーション溶液が必要である。インキュベーション後、スライドからPLA溶液を取り出し、攪拌で室温で5分間TBSTで2回洗浄します。冷凍庫からリガーゼを取り除く場合、細胞に加える直前に凍結ブロックを使用し、結紮溶液で希釈します。スライドからTBSTを取り出し、各ウェルに40マイクロリットルのライゲーションリガーゼ溶液を加えます。予熱湿度室で30分間、摂氏37度でスライドをインキュベートします。インキュベーションの後、溶液を吸引し、攪拌で室温で5分間TBSTで2回洗浄する。試薬は光に敏感なので、明るい光に井戸を露出させないようにしてください。最後の洗浄時に、ボルテックスを使用する直前に高純度水で必要量の増幅液を希釈します。ポリメラーゼを氷の上または冷却ブロックに入れ、細胞の渦に加える直前に、増幅溶液で希釈します。ウェルからTBSTを吸引し、各ウェルに40マイクロリットルの増幅溶液を加えます。暗い予熱湿度室で37°Cで100分間スライドをインキュベートします。インキュベーション後、スライドから増幅ポリメラーゼ溶液を吸引し、室温でTBSTでそれぞれ10分間20分洗浄する。スライドからウェルの周りのチャンバーとシリコーンを完全に取り除きます。シリコーンの残りのビーズをカミソリで削り取ります。スライド上にグリッドを描画し、各ウェルを区切ります。DAPIで約40マイクロリットルの取り付け媒体を加え、カバースリップの下に気泡が引っ掛からないようにします。マニキュアを使用してカバーガラスを固定します。顕微鏡解析は、固定後20分で行うことができますが、実際には、次の日に画像解析を行うことが最も便利です。サンプルを分析するために、Leica SP8構成レーザー走査顕微鏡を使用します。ここに示されているのは、パネルAからDのヒト胚性腎臓細胞におけるMST 1とMST2タンパク質の間の近接を視覚化するその場合の近接ライゲーションアッセイの例であり、パネル H.In E内のヒトシュワン細胞はDAPIによって青色に染色され、赤色点は示されたタンパク質間の近接性に起因する陽性近接ライゲーションアッセイシグナルを示す。パネルAはMST1とMST2の近接性を示し、パネルBは、これらのエピトープが同じタンパク質上にあるため、ERKとホスホエルKの近接性を示す。パネルCは、MST1およびMST2およびパネルDのようなこれらの細胞が互いに近接するとは予想されないMST1およびERKに対する抗体で染色された第2の陰性対照を表すので、陰性対照を表す。パネルEおよびFは、シュワン細胞におけるホスホエルクを有するMST2およびERKとのMST1の近接性を示す。パネルGおよびHは、MST1抗体またはMST1およびERK抗体でのみ染色される陰性対照である。ヘテロダイマーの1つのメンバーのみを認識する必要がある非交差反応性の一次抗体を使用することが不可欠です。また、一次抗体とPLAプローブの交差汚染を避け、ウェルの底部に触れないように、サンプルに直接ピペットを避けるために、異なるヒントを使用することを忘れないでください。このビデオを見た後、固定細胞のタンパク質二量体化を研究するために現場でPLAを使用する方法をよく理解する必要があります。.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ここでは、骨形成タンパク質（BMP）固定された細胞のシグナル伝達を可視化する抗体の組み合わせで近接ライゲーションアッセイ（PLA）を、使用する方法を示します。このテクニックは、私たちは、内因性BMP活性化エフェクター複合体の核内蓄積を追跡し、BMP4刺激下で時間をかけて自分のレベルを定量することができました。...

使用BMP4のエフェクター-錯体のダウンストリームシグナリングの検出その場で PLA、近接ライゲーションアッセイ

このビデオでは、線虫細胞におけるin...

In Situタンパク質間相互作用を研究するための近接ライゲーションアッセイ

このプロトコルは、近接ライゲーションアッセイは、ショウジョウバエの幼虫神経筋接合部で、その場のタンパク質-タンパク質相互作用に検出するために使用することができる方法を示しています。この技術では、大規模で胡-LIの太極拳シャオディスクは、シナプス後の領域に、以前に共免疫沈降を介して同定関連を複合体を形成することが示されている。...

の検出その場でタンパク質 - タンパク質複合体ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部

ここでは、固定された細胞内小胞体とミトコンドリアの間に内因性の相互作用を視覚化し、高感度で定量化するための手順について説明します。プロトコルは、ミトコンドリア関連膜界面での75 /電位依存性アニオンチャネル/シクロフィリンD複合体イノシトール1,4,5-三リン酸受容体/グルコース調節タンパク質を標的と現場での近接連結アッセイに最適化されています。...

小胞体とミトコンドリアの相互作用の研究によって、<em&gt;その場で</em固定された細胞における&gt;近接ライゲーションアッセイ

タンパク質間相互作用は、細胞の核と細胞質の両方で発生する可能性があります。これらの相互作用を調べるために、従来の共免疫沈降と最新の近接ライゲーションアッセイが適用されます。本研究では、これら2つの方法を比較して、核と細胞質におけるNF90-RBM3相互作用の分布を可視化します。...

共免疫沈降により核および細胞質画分中のタンパク質間相互作用の可視化と<em&gt;その場で</em&gt;近接ライゲーションアッセイ

ここでは、 in situ Proximity Ligation Assay（PLA）を使用して、遺伝毒性ストレスに曝された懸濁細胞培養におけるATMとp53との間の直接タンパク質 - タンパク質相互作用の検出および可視化を実証する。...

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

ここでアセンブリと biolayer 干渉計 (結合) による炭疽菌毒素の分解を監視するためのプロトコルを提案する.次のアセンブリ/分解バイオ...

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオ センサーから解放

このプロトコルでは、蛋白質ホモ重合体外に基づく商業光走査顕微鏡を用いた蛍光揺らぎを定量化するための校正無料のアプローチについて説明します。正しい取得の設定と解析方法が表示されます。...

多量ホモ測定器と無料、フリー、オープン ソースの明るさ解析ソフトウェアを使用しての体外校正無料定量化

コグネートJドメインタンパク質はHsp70シャペロンと協力して、タンパク質の折りたたみから分解に至るまで、無数の生物学的プロセスを支援します。ここでは、細菌、酵母およびヒト細胞におけるこれらの一時的に形成されたシャペロン機械のモニタリングを可能にする、その場近近性ライゲーションアッセイについて説明する。...

細菌、酵母、ヒト細胞における一過性形成分子シャペロンアセンブリのモニタリング

このプロトコルは、C.エレガンス生殖細胞リンにおけるその場でのタンパク質相互作用をプローブするための近接ライゲーションアッセイの使用を実証する。...

近接ライゲーションアッセイを用いたC.エレガンス生殖細胞系列におけるリボヌクレオプロテイン複合体集合体のSITU検出

D-ループキャプチャー(DLC)およびD-ループ伸長(DLE)アッセイは、近接ライゲーションの原理と定量的PCRを利用して、...

出芽酵母における近接ライゲーションと定量PCRによる相同組換え中間体の検出

学ぶその場で近接結紮アッセイ（PLA）を用いたタンパク質ヘテロ二量体化の検出法。固定細胞内でMST1/MST2相互作用を高感度に可視化し、細胞シグナル伝達メカニズムを解明する手法です。

その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソフォームの Heterodimerization の検出

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その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソ フォームの Heterodimerization の検出

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