ホール マウントIn Situハイブリダイゼーションによる目盛りの腸内微生物叢の可視化

この方法は、ダニの生存可能な細菌の存在を空間的および時間的に評価するなど、ダニの昆虫学に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ダニの切片化や高価な機器を必要としないこと、および遺伝子転写産物の空間的および時間的な視覚化を可能にすることです。一般的に、この手法に不慣れな人は、複数のステップと試薬が必要なため、苦労するでしょう。

ただし、この手法は面倒ではありません。完了するまでに約3日かかる場合がありますが、ハンズオン時間は毎日わずか数時間です。準備として、腸の収集の48〜72時間前に収集したダニに餌を与えます。

ダニから腸を解剖するには、きれいなスライドガラスに20〜30マイクロリットルのMEMFA溶液を追加します。次に、ティックをMEMFAに配置し、フォーカスをティックの頭に調整します。現在、滅菌済みの高炭素鋼のかみそりの刃のペアを使用して、ダニの体を無傷のままにして、胚盤の頭の領域を切り落とします。

次に、体をそっと押して、腸憩室と唾液腺を体のキューティクルから押し出します。次に、腸を傷つけずに、唾液腺から慎重に分離し、切り傷をかみそりの刃に慎重にすくい取ります。採取したすべての腸を500マイクロメートルのMEMFAの1.5ミリリットルチューブに集めます。

その後、チューブを室温で静かに揺さぶりながら1時間インキュベートします。翌日、テキストプロトコルに示されているように組織を脱水し、摂氏マイナス20度で保存します。メッシュバスケットを準備するには、まず、メスで加熱された片刃を使用して、2ミリリットルまたは5ミリリットルのスナップトップ遠心チューブの底を切り取ります。

カットが完了する前に、ブレードを数回再加熱する必要がある場合があります。次に、新しい開口部よりもわずかに大きい110ミクロンのナイロンメッシュの正方形を切り取ります。次に、中火/弱火に設定されたホットプレートでチューブをメッシュに軽く押し込み、良好なシールが得られるまでメッシュを開口部に接着します。

冷めたら、余分なメッシュをトリミングし、隙間がないことを確認します。これらのバスケットを24個作って、24ウェルプレートに合わせます。次に、24ウェルプレートのカバーに穴を開け、サンプルバスケットのリップが穴をつかんで落ちないようにします。

完了すると、組み立てられたサンプルバスケットはウェルの奥まで収まるはずです。さて、この取り付けられたバスケットホルダーを使用して、in situハイブリダイゼーションを通じて比較的簡単にバスケットを1つのプレートから別のプレートに移します。このようなプレートを2つ使用して、サンプルが一方でインキュベートされている間に、もう一方が次の洗浄に備えられるようにします。

このセクションでは、in situハイブリダイゼーションの特定のステップについて説明します。詳細な説明については、テキストプロトコルを参照してください。まず、各固定組織サンプルをラベル付きのサンプルバスケットに移します。

実験条件ごとにプレートを整理し、条件ごとに少なくとも5つの腸を染色します。まず、サンプルをやさしく水分補給します。各洗浄でPBS-Tとエタノールの比率を徐々に増やして、気泡の侵入を防ぎます。

初日は、2時間のプレハイブリダイゼーションステップの後、ハイブリダイゼーションバッファーを廃棄する代わりに、アッセイ中に将来使用するために保存してください。その後、サンプルをプローブハイブリダイゼーション溶液で処理するときは、溶液の蒸発を防ぐためにプレートをアルミホイルでぴったりと覆います。2日目に、予約したハイブリダイゼーションバッファーを24ウェルプレートにロードし、プレートを摂氏60度まで温めます。

その日の後半に、プローブとハイブリダイゼーションバッファーの痕跡をすべて除去するために、サンプルを2x SSCで2回、1回の洗浄につき3分間洗浄します。次に、サンプルを2x SSCで3回、摂氏60度で20分間洗浄します。次に、ブロッキングバッファーで一次抗体を調製します。

この混合物の500マイクロリットルを各ウェルにロードします。ブロッキングステップ後、室温で約4時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。3日目に、発色基質で色反応を実行します。

サンプルプレートをアルミホイルで覆います。また、反応中は、解剖顕微鏡で定期的に過染色がないか確認してください。4日目には、ライトボックス上でインキュベートして漂白することが重要です。これにより、サンプル中の色素沈着やBouinの溶液からの色が除去され、プローブシグナルが強化されて明確な視覚化が可能になります。

次に、SSCで洗浄した後、バスケットを新しい24ウェルプレートに反転させて、腸サンプルを慎重に移します。井戸にいる間、70%エタノールを使用してバスケットを十分に洗い流します。次に、サンプルのイメージングを行います。

RNAプローブを使用する前に、その品質を推定することが重要です。プローブはホルムアルデヒドゲルでチェックできます。それらが明るく離散的なバンドとして表示される場合、それらは高品質です。

染色時には、生物学的複製物間および個々の腸の7対の憩室間で分布の多少の変動が正常です。したがって、平均的な染色パターンを把握するには、条件ごとに少なくとも5つの腸を染色するのが最善です。全体的な成功度は、各疾患のセンスサンプルとアンチセンスサンプルの染色を比較することで最もよく測定できます。

どちらも同じ時間開発する必要があります。センスサンプルは紫色が最小限またはまったくない必要がありますが、アンチセンスサンプルは最小限のバックグラウンドで堅牢な染色を示す必要があります。重要なことに、均一に露出するためには、組織が汚れに完全に浮き出している必要があります。

色反応の過度の発達を避けることが重要です。これにより、バックグラウンドの染色が大量に発生し、センスサンプルがアンチセンスサンプルのように見え始める可能性があります。結果に影響を与えるもう一つの要因は、事前にダニがどれだけ供給されるかです。

給餌されていない、または24時間しか給餌されていないマダニは、扱いにくいです。彼らの腸はより傷つきやすく、汚れがよくありません。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば、2日半から3日で行うことができます。

この手順を試行する際は、実験を開始する前に、試薬と材料の表に記載されているすべての消耗品を準備しておくことを忘れないでください。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。