Name: ホール マウントIn Situハイブリダイゼーションによる目盛りの腸内微生物叢の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学ぶホールマウントインサイチュハイブリダイゼーションによる目盛りの腸内微生物叢の可視化法。空間的・時間的な細菌分布を評価し、高価な機器や切片を必要とせず、約3日で完了する実験手法です。

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彼の実験室のリソースの使用を提供する私たち心から感謝博士ムスタファ ・ Khokha、エール大学。優れたテクニカル サポートに呉明傑氏に感謝しております。EF は HHMI 捜査官です。この作品は、ジョン ・ Monsky、ジェニファー ヴァイス Monsky ライム病研究基金からの贈り物によって支えられました。

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</ol>

著者はある利益相反を開示します。

これは病原体の節足動物ベクトルの微生物叢を勉強する全体マウントの in situハイブリダイゼーション (WMISH) 技術の最初の使用。我々 のプロトコルは、カエル胚25,26、ショウジョウバエの研究に使われたから適応されました。全体マウント RNAの in situハイブリダイゼーションは、日常的に空間的の遺伝子の転写をローカライズに使用されている、一時的27と成績証明書の可視化することができる明るいフィールドまたは蛍光顕微鏡による。ティック腸内微生物叢の検出に向けて前者を採用しました。全体ダニの頭部が定着剤とハイブリダイゼーション溶液の浸透は成功しなかったように削除されましたを用いた全体マウントの in situハイブリダイゼーションを実行しようとするに注意してくださいすることが重要です。ここで説明されているプロトコルは、切り裂かれた根性を利用して、23</su...

節足動物ベクトルによって送信される人間と家畜の病原体が世界中1、しかし効果的な感染症の約 20% のグローバル アカウントし、安全なワクチンこれらの病原体のほとんどはご利用いただけません。総称マイクロバイ2、調節、およびほぼすべての多細胞動物3健康を形成して共生、環境共生・病原性微生物の重要な役割の私達の理解を拡大しています。今、またハーバー腸内細菌の病原体の節足動物ベクトル多様な媒介性病原体4,5に影響を与えるこれらのベクター関連微生物叢が示されていることが明らかです。節足動物のマイクロバイ真正細菌、古細菌、ウイルス、原虫、線虫、菌類6などの真核微生物で構成されます。ただし、優勢な研究の焦点されている真正細菌のため、一部では、マーカー遺伝子と細菌の特定のメンバーを識別するために参照データベースの可用性に。
イクソデススカプラリス、ボレリアブルグドルフェリ7,を含む複数の人間の病原体のベクターの目盛りを中心とライム病の病原微生物の可視化技術の最適化を目指したベクトル ・病原菌相互作用のコンテキストでティック腸内細菌の私達の理解を改善しています。ティック マイクロバイ フィールドで答えるべきいくつかの疑問が残っています。腸は、目盛りと水平方向に移された病原体; のコンテキストで受信の病原体との間の最初の拡張の出会いのサイトしたがって、ベクトル ・病原菌相互作用を調節することでベクトル腸内細菌の役割を理解すると、意味のある洞察が明らかになります。マダニは、吸血消化、血液の食事コンポーネントは処理場所8では細胞内のユニークなモードを持っています。栄養の消化と同化餌の数日中に結果として起きるの後補充や腸の内腔は一見ティック フィードとして血液の食事を含む容器として機能します。給餌中にダニによって取得した病原体に入る、吸血と共に腸内腔と内腔になるダニ、病原体、および常駐細菌間の相互作用のプライマリ サイト。消化の補充と脱皮マダニを通過、腸は構造と機能の変化9を経る。組成と腸内細菌の空間組織も変化する腸内環境とのコンサートでは異なる可能性が高いです。したがって、完全にダニ、病原体と腸内細菌の相互作用を理解する目盛りの腸内常在細菌のアーキテクチャを理解することが重要です。
ホスト関連付けられている細菌叢を日常的に記述するため分子技術は、増幅し、細菌の 16S リボソーム DNA (rDNA) をシーケンスに高スループット並列シーケンス戦略10を利用します。これらのシーケンスの戦略は、特定の細菌の無菌共生栽培を取得し、サンプルで表される細菌のすべてのメンバーの詳細な説明を提供する必要を回避します。それにもかかわらず、このような戦略は、善意の住民から環境汚染を区別する無力によって混同されます。さらに、サンプル サイズが小さいと、それゆえ低細菌固有の DNA が含まれているダニなどの評価の結果、環境汚染物質の増幅の可能性増加11とのあいまいな解釈の結果マイクロバイ組成物。特定の細菌の可視化と組み合わせて機能解析、したがって、重要になりますを定義し、時間的、空間的にダニのマイクロバイを識別します。私たちはこの目標に向かって交配その場全体マウント RNA を利用しました。このテクニックは、日常的に使用して臓器および胎仔の12,13,14の遺伝子発現パターンを評価する、目的の全体標本上式の半定量分析を可能します。これは交配技術従来の in situティッシュ セクションを利用し断面計算アセンブリ全体の臓器15で式を予測する材料の広範な解析は往々 に異なります。全体マウント一般的に全体の生物12を参照しますが、ここで全部マウントは全体の内臓や器官を指します。ティック腸内微生物叢のアーキテクチャを評価するために交配アプローチその場全体マウント RNA を使用する利点は、多重。ティック腸憩室の 7 ペア サイズ16の各ペアで構成されます。機能の違いこれら憩室の間で、いずれはダニの生物学の文脈で理解されていない場合は、細菌やダニ ・病原菌相互作用をチェックします。破裂腸憩室腸の操作は細菌叢腸内腔や腸内細菌叢の空間定位の誤解の結果と緩く関連付けられている内に存在を転置します。蛍光標識 RNAの in situハイブリダイゼーションを修正し、個々 の腸憩室プローブの交配を確保し、ボレリアをローカライズするティック腸成績17を調べる以前に利用されています。18全体ダニのパラフィン包埋の区分により成績証明書。これらの両方のアプローチでは、腸内細菌叢のアーキテクチャに影響を及ぼす交配前にティック組織の操作必要があります。
このレポートでその場で全部マウント交配 (WMISH) を使用して実行可能な目盛り腸内細菌を調べるプロトコル詳細に述べる。全体マウント RNAの in situハイブリダイゼーションの使用により、存在の国際理解と腸内のさまざまな地域で特定の腸内細菌の豊かさと病原体の植民地化のコンテキストでティック腸の生物学への新しい洞察に拍車をかける可能性があります。トランス ミッション。さらに、特定の細菌 RNA に対して指示される RNA プローブの使用が目盛りの腸内細菌の検出を可能します。

<table><tbody><tr><td>Sefar NITEX ナイロンメッシュ、110 ミクロン</td><td>Amazon</td><td>03-110/47</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T Easy Vector System</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>Digoxygenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>1209256910</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I(RNAse-free)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe SP6 RNA合成キット</td><td>New England Biolabs</td><td>E2070S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>Water, RNase-free, DEPC treated</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02128-00500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M, pH 8.0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド、37%</td><td>JT Baker</td><td>2106-01</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>DPBS、10X</td><td>Gibco</td><td>14300-075</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-25ML</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>トリエタノールアミン HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1502-100G</td><td></td></tr><tr><td>無水酢酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>ThermoScientific/Pierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>SSC、20X</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156-01000</td><td></td></tr><tr><td>トルラ酵母</td><td>由来の RNASigma Aldrich</td><td>R3629-5G</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン、ナトリウム塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Denhardt's Solution、50X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2532-5ML</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS 水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3023-1G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>マレイン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0375-100G</td><td></td></tr><tr><td>ブロッキング試薬</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン-AP、Fab フラグメント</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>塩酸レバミゾル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31742-250MG</td><td></td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ用発色基質</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>11442074001</tr><tr><td>Bouin's solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>Mallinkrodt Baker, Inc</td><td>2186-01</td><td></td></tr><tr><td>一本鎖RNAラダー</td><td>Ambion -Millenium</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;#11 高炭素鋼ブレード&nbsp;</td><td>C and A Scientific Premiere</td><td>#11-9411</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad, CA</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>NanoDrop 2000C</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>VWR</td><td>DS-500E デジタルオービタルシェーカー</td><td></td></tr><tr><td>シェーキングウォーターバス</td><td>BELLCO Glass, Inc</td><td>ホットシェーカー-7746-12110</td><td></td></tr><tr><td>ゲル&nbsp; ドキュメンテーションシステム</td><td>BioRad</td><td>Gel Doc XR+ ゲルドキュメンテーションシステム</td><td></td></tr><tr><td>明視野顕微鏡&nbsp;</td><td>ニコン</td><td>ニコンSM2745T</td><td></td></tr><tr><td>明視野顕微鏡&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Scope.A1</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td>STEMI 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;ライトボックス</td><td>VWR</td><td>102097-658</td><td></td></tr><tr><td>PCR精製キット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>画像キャプチャソフト</td><td>Zeiss</td><td>Zen lite</td><td></td></tr><tr><td>画像編集ソフト&nbsp;</td><td>アドビ&nbsp;</td><td>Adobe Photoshop CS4 version 11.0</td><td></td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Automation compatible instrumentation</td><td>Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany).&nbsp;</td><td>インタビス、ビオランHT1.16v</td><td></td></tr></tbody></table>

ホール マウントin situハイブリダイゼーションによる目盛りの腸内微生物叢の可視化

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

節足動物ベクトルによる伝染病は、世界中の人間の健康に重大な脅威をもたらすし続けます。これらの病気を引き起こしている病原体は、彼らはベクトル; を植民地化するとき、単独では存在しません。むしろ、腸内腔の常駐微生物との相互作用に従事する可能性が高い。ベクトル内の細菌叢は、いくつかの媒介性疾患の病原体の感染に重要な役割を再生する実証されています。イクソデススカプラリス目盛り、ボレリアブルグドルフェリを含むいくつかの人間の病原体のベクトルの腸内常在細菌病原体のダニの伝送に影響を与えるかどうかは未定です。ティックの腸内で潜在的な種間相互作用の理解を容易にするダニ腸に関連付けられている細菌の組成を特徴付けるための方法が必要です。その場で全部マウントの使用特定の細菌種に関連付けられている RNA 転写産物を視覚化する交配できます豊かさに関する質的データの収集とそのまま組織の細菌叢の分布。この技術は、ダニの餌にわたって腸内細菌叢の環境の変化を調べるため、ティック遺伝子の発現を分析にも適用できます。三次元再構成を必要とせず、組織の標的 RNA の総空間分布については収量をガッツ全目盛りの染色としばしば混同法を用いた環境汚染の影響が小さい複雑な微生物群集を研究する頻繁に使用されるメソッド。全体的にみて、この手法はより良いするために使用できる貴重なツール ベクトル病原細菌の相互作用とその病気の感染における役割を理解します。

測定および RNA プローブの質の評価、染色を開始する前に重要です。In vitro転写効率量と DNA のテンプレートの質に大きく依存します。我々 は日常的に純度と転写反応によって生成されたプローブの量を確認するホルムアルデヒドのゲルの RNA プローブを可視化。プローブは、明るい、離散バンド (図 2) として表示されます。RNA 濃度の吸光光度測定では、ゲルのバンドの出現とよく高いプローブの品質の指標と相関があった。したがって、プロトコルに精通していることができた後ゲル可視化手順を省略可能性があります。どちらにしても、プローブの堅牢性に依存するすべての後工程として、高品質の十分な RNA が生成されることを確認することが重要です。
この方法の長所は、バクテリア、ダニ フィードとして時間の経過とともに細菌の豊かさと種全体の組織内での局在の変化の有無を含めダニ細菌についての...

ここでは、空間的そして一時的変更されたホール マウント in situ ハイブリダイゼーションのアプローチを使用して目盛り根性で実行可能な微生物叢の存在を評価するためにプロトコルを提案します。

ホール マウントIn Situハイブリダイゼーションによる目盛りの腸内微生物叢の可視化

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

この方法は、ダニの生存可能な細菌の存在を空間的および時間的に評価するなど、ダニの昆虫学に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ダニの切片化や高価な機器を必要としないこと、および遺伝子転写産物の空間的および時間的な視覚化を可能にすることです。一般的に、この手法に不慣れな人は、複数のステップと試薬が必要なため、苦労するでしょう。ただし、この手法は面倒ではありません。完了するまでに約3日かかる場合がありますが、ハンズオン時間は毎日わずか数時間です。準備として、腸の収集の48〜72時間前に収集したダニに餌を与えます。ダニから腸を解剖するには、きれいなスライドガラスに20〜30マイクロリットルのMEMFA溶液を追加します。次に、ティックをMEMFAに配置し、フォーカスをティックの頭に調整します。現在、滅菌済みの高炭素鋼のかみそりの刃のペアを使用して、ダニの体を無傷のままにして、胚盤の頭の領域を切り落とします。次に、体をそっと押して、腸憩室と唾液腺を体のキューティクルから押し出します。次に、腸を傷つけずに、唾液腺から慎重に分離し、切り傷をかみそりの刃に慎重にすくい取ります。採取したすべての腸を500マイクロメートルのMEMFAの1.5ミリリットルチューブに集めます。その後、チューブを室温で静かに揺さぶりながら1時間インキュベートします。翌日、テキストプロトコルに示されているように組織を脱水し、摂氏マイナス20度で保存します。メッシュバスケットを準備するには、まず、メスで加熱された片刃を使用して、2ミリリットルまたは5ミリリットルのスナップトップ遠心チューブの底を切り取ります。カットが完了する前に、ブレードを数回再加熱する必要がある場合があります。次に、新しい開口部よりもわずかに大きい110ミクロンのナイロンメッシュの正方形を切り取ります。次に、中火/弱火に設定されたホットプレートでチューブをメッシュに軽く押し込み、良好なシールが得られるまでメッシュを開口部に接着します。冷めたら、余分なメッシュをトリミングし、隙間がないことを確認します。これらのバスケットを24個作って、24ウェルプレートに合わせます。次に、24ウェルプレートのカバーに穴を開け、サンプルバスケットのリップが穴をつかんで落ちないようにします。完了すると、組み立てられたサンプルバスケットはウェルの奥まで収まるはずです。さて、この取り付けられたバスケットホルダーを使用して、in situハイブリダイゼーションを通じて比較的簡単にバスケットを1つのプレートから別のプレートに移します。このようなプレートを2つ使用して、サンプルが一方でインキュベートされている間に、もう一方が次の洗浄に備えられるようにします。このセクションでは、in situハイブリダイゼーションの特定のステップについて説明します。詳細な説明については、テキストプロトコルを参照してください。まず、各固定組織サンプルをラベル付きのサンプルバスケットに移します。実験条件ごとにプレートを整理し、条件ごとに少なくとも5つの腸を染色します。まず、サンプルをやさしく水分補給します。各洗浄でPBS-Tとエタノールの比率を徐々に増やして、気泡の侵入を防ぎます。初日は、2時間のプレハイブリダイゼーションステップの後、ハイブリダイゼーションバッファーを廃棄する代わりに、アッセイ中に将来使用するために保存してください。その後、サンプルをプローブハイブリダイゼーション溶液で処理するときは、溶液の蒸発を防ぐためにプレートをアルミホイルでぴったりと覆います。2日目に、予約したハイブリダイゼーションバッファーを24ウェルプレートにロードし、プレートを摂氏60度まで温めます。その日の後半に、プローブとハイブリダイゼーションバッファーの痕跡をすべて除去するために、サンプルを2x SSCで2回、1回の洗浄につき3分間洗浄します。次に、サンプルを2x SSCで3回、摂氏60度で20分間洗浄します。次に、ブロッキングバッファーで一次抗体を調製します。この混合物の500マイクロリットルを各ウェルにロードします。ブロッキングステップ後、室温で約4時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。3日目に、発色基質で色反応を実行します。サンプルプレートをアルミホイルで覆います。また、反応中は、解剖顕微鏡で定期的に過染色がないか確認してください。4日目には、ライトボックス上でインキュベートして漂白することが重要です。これにより、サンプル中の色素沈着やBouinの溶液からの色が除去され、プローブシグナルが強化されて明確な視覚化が可能になります。次に、SSCで洗浄した後、バスケットを新しい24ウェルプレートに反転させて、腸サンプルを慎重に移します。井戸にいる間、70%エタノールを使用してバスケットを十分に洗い流します。次に、サンプルのイメージングを行います。RNAプローブを使用する前に、その品質を推定することが重要です。プローブはホルムアルデヒドゲルでチェックできます。それらが明るく離散的なバンドとして表示される場合、それらは高品質です。染色時には、生物学的複製物間および個々の腸の7対の憩室間で分布の多少の変動が正常です。したがって、平均的な染色パターンを把握するには、条件ごとに少なくとも5つの腸を染色するのが最善です。全体的な成功度は、各疾患のセンスサンプルとアンチセンスサンプルの染色を比較することで最もよく測定できます。どちらも同じ時間開発する必要があります。センスサンプルは紫色が最小限またはまったくない必要がありますが、アンチセンスサンプルは最小限のバックグラウンドで堅牢な染色を示す必要があります。重要なことに、均一に露出するためには、組織が汚れに完全に浮き出している必要があります。色反応の過度の発達を避けることが重要です。これにより、バックグラウンドの染色が大量に発生し、センスサンプルがアンチセンスサンプルのように見え始める可能性があります。結果に影響を与えるもう一つの要因は、事前にダニがどれだけ供給されるかです。給餌されていない、または24時間しか給餌されていないマダニは、扱いにくいです。彼らの腸はより傷つきやすく、汚れがよくありません。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば、2日半から3日で行うことができます。この手順を試行する際は、実験を開始する前に、試薬と材料の表に記載されているすべての消耗品を準備しておくことを忘れないでください。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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ティック腸内ライム病の病原体の迅速な伝達とローカリゼーションのための方法

出典: Ng, K. M., Tropini, C. 蛍光の 現場 ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージングによる腸内細菌叢-宿主相互作用の可視化。 J. Vis. Exp.

マウス腸切片における腸内細菌の蛍光インポジションハイブリダイゼーション

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次世代の 16S rRNA 増幅シーケンスによる目盛りマイクロバイ評価

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蛍光を介した蛍光による腸内微生物叢-宿主相互作用の可視化( Situ ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージング)

本プロトコールは、ダニ唾液腺および精製された細胞外小胞からのマイクロRNAの単離を記載する。これは、一般的に使用される試薬と消耗品を組み合わせた普遍的な手順です。この方法はまた、少数のダニの使用を可能にし、容易に配列決定することができる高品質のマイクロRNAをもたらす。...

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微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

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Attine Ants' Gardensの微生物叢:走査型電子顕微鏡による微生物の風景の可視化

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学ぶホールマウントインサイチュハイブリダイゼーションによる目盛りの腸内微生物叢の可視化法。空間的・時間的な細菌分布を評価し、高価な機器や切片を必要とせず、約3日で完了する実験手法です。

ホールマウントIn Situハイブリダイゼーションによる目盛りの腸内微生物叢の可視化

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