Name: マッピング代謝: 監視組織で直接乳酸脱水素酵素活性 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: 学ぶ 組織内でNAD(P)H生成酵素の活性を直接検出する方法。乳酸脱水素酵素の空間分布をマッピングし、代謝プロセスや組織内の酵素活性の局在を理解するのに役立ちます。

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HAC リタ アレン財団 (http://www.ritaallenfoundation.org) のミルトン E. カッセル学者でもあった。この作業によって賄われていた補助金拍する国立研究所の一般的な医療科学 R01 GM081686、R01 AR070245、国立の研究所一般医療科学 R01 GM0866465、イーライ ・ エディス広い再生医療センター ・幹細胞研究 (からローズの丘と Hal Gaba 賞)、WEL および HAC にジョンソン総合がんセンターからアイリス カントール女性の健康センター/カリフォルニア大学ロサンゼルス校 CTSI NIH グラント UL1TR000124、白血病リンパ腫協会の影響賞を受賞します。この出版物で報告された研究は、賞を受賞番号 P50CA092131 の下で健康の国民の協会の国立癌研究所によって支えられました。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。HAC は、Eli およびエディス広い再生医療センター ・幹細胞研究、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の分子生物学研究所と UCLA バイオインフォマティクス部門間プログラムのメンバーです。

記載されているすべての実験は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校で動物ケア委員会によって承認されました。
1. 冷凍マウス皮膚のスライドを生成します。
<ol><li>機関のポリシーに従ってマウスを安楽死させます。 注: 防護服の制度のポリシーに従ってください。動物を含むすべてのプロトコルは、機関動物ケア委員会によって承認される必要があります。</li>
	<li>動物の毛トリマーとマウスの髪を削除します。</li>
	<li>はさみを使用して皮膚の切開を行います。鉗子を使用すると、マウスから皮膚を持ち上げます。皮膚セクションを切り取るはさみを使用しています。</li>
	<li>凍結試薬をコンパウンドで、cryomold を埋める (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>皮膚針鼻セクションを使用して塗りつぶされた cryomolds に鉗子を配置します。組織スライスは真皮、皮下・筋 (図 2) に表皮から皮膚の断面図を生成することは、肌を合わせます。 注意: 可能であれば、マウント実験と同じスライド上に切断し、一緒に処理できるので、同じ cryomold で一緒にマウスを制御します。泡を作成しないように注意してください。</li>
	<li>氷バケットにドライアイスのブロックの平らな面に cryomold を配置し、凍結させます。スキンの向きを観察し続けます。必要に応じて調整します。 注: は、ドライアイスを取り扱う際に低温手袋を着用します。</li>
	<li>ストレージの-80 ° C のフリーザーに cryomolds を転送します。サンプルは、冷凍庫で約 3ヶ月酵素活性の重要な損失なしで維持できます。凍結切片の乾燥をさせてください。</li>
	<li>-20 ° c、7-10 μ m の最高の皮膚形態21の厚いセクションを作成するスライス組織クライオスタットを用いた。</li>
</ol>2. 染色スライドの準備
<ol><li>テストするスライドのセットを確立します。NAD は源泉徴収されるコントロール スライドを含めるし、別のコントロールをスライド基板、乳酸、源泉徴収されます。以前調査した凍結するティッシュのブロックからの肯定的な制御スライドが含まれます。</li>
	<li>簡単にスライドを固定 5 分 4% ホルマリンで皮膚セクションを含む 4% ホルマリンをスライド、またはピペット 1 mL、4% ホルマリン入り容器にスライドを浸すことによって複数のスライドを処理するとき。 注: 固定、皮膚がスライドから次の手順と保存皮膚の形態の中にむいていないを確認します。 注意: ホルマリンは発がん性物質と危険だもの手袋を着用する、それはあなたの肌に触れるし、化学の発煙のフードでこの手順を実行させてはいけない。</li>
	<li>少なくとも 1 mL リン酸洗浄スライドによって緩衝される塩、pH 7.4、スライドごとピペッティングまたは浸漬で。</li>
</ol>3. 染色液の準備
<ol><li>乳酸脱水素酵素活性染色用渦一緒に試薬 (50 mM Tris pH 7.4 では、750 μ M NADP、80 μ M フェナジン methosulfate (PMS)、600 μ M nitrotetrazolium ブルーの塩化物および 30 mM 乳酸) 染色の量に応じて適切なサイズのチューブで必要なソリューションです。 注: 1 mL は完全に 1 つのスライドをカバーするのに十分です。</li>
	<li>NAD を除くすべての試薬がある、2 番目のソリューションを準備します。すべての試薬は乳酸以外存在第 3 ソリューションを準備します。</li>
</ol>4. 染色液でスライドを孵化させなさい。
<ol><li>優しくピペット染色液またはその全体のセクションをカバー スライド上に制御ソリューション (1 mL は、1 つのスライド十分です)。複数のスライドを一緒に処理されている場合は、同時に染色液にすべてのスライドをディップ (コンテナーが完全にティッシュ セクションをカバーする十分なソリューションを確認してください)。</li>
	<li>暗闇の中で 37 ° C で加湿環境でスライドを孵化させなさい。染色液は、スライド上にある場合、は、蒸発を防ぐために加湿環境にスライドを配置します。</li>
</ol>5. モニター スライド
<ol><li>目視による青クリアから染色液の変換を監視します。サンプルが青の所望のレベルに達したら、染色液を除去することによって反作用を停止します。 注: 皮膚、10 分は十分です。時にオルガンと酵素の活性が異なります。</li>
	<li>ピペッティングでリン酸緩衝生理食塩水でスライドをリンス (1 mL はスライドごとに十分な) または浸漬します。 注: 互いに比較されるサンプルは、時間の同じ量の染色液で維持する必要があります。</li>
</ol>6. 対比染色とマウント
<ol><li>スライド、スライドが青の適切なレベルに達したときに対比染色をピペットで移しなさい。 注: 赤または緑の核を有効に Counterstains は沈殿ホルマザン結晶によって作成された青と良好なコントラストを提供します。</li>
	<li>水または水溶液中22をマウントをマウントします。メディアをマウントのひとつ 〜 3 滴 (40-50 μ L) でカバー スリップのサイズによっては十分です。</li>
</ol>7. スライドの画像し、定量化
<ol><li>画像は、光学顕微鏡下でスライドします。10 X、20 X、40 倍の倍率でのすべての否定的なコントロールとコントロールのサンプル実験の写真を取る。</li>
	<li>画像解析ソフトウェアでさまざまな地域の青い汚れの強度を決定します。</li>
</ol>

<ol><li>Boonacker, E., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+cytochemical+techniques+for+metabolic+mapping+in+living+cells%2C+with+special+reference+to+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).</li>
<li>Seidler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tetrazolium-formazan+system%3A+Design+and+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry.</a> Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).</li>
<li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+Noorden%2C+CJF+%22Enzyme+Histochemistry%3A+A+Laboratory+Manual+of+Current+Methods%22">Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods</a>. , Bios. (1992).</li>
<li>Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+cytochemical+analysis+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+living+isolated+hepatocytes+of+European+flounder+for+rapid+analysis+of+xenobiotic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).</li>
<li>Negi, D. S., Stephens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+the+histochemical+localization+of+glucose-6-phoshate+dehydrogenase+in+animal+and+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues.</a> J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).</li>
<li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+localization+of+transketolase+activity+in+epithelial+cells+of+different+rat+tissues+and+subcellularly+in+liver+parenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells.</a> J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).</li>
<li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+metabolic+configurations+of+single+cells+within+complex+tissue+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments.</a> Cell Metab. , (2017).</li>
<li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+serum+lactate+dehydrogenase+in+renal+cell+carcinoma%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis.</a> PLoS One. 11, e0166482(2016).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+serum+LDH+in+small+cell+lung+cancer%3A+A+systematic+review+with+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biomark%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis.</a> Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).</li>
<li>Petrelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+role+of+lactate+dehydrogenase+in+solid+tumors%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+76+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies.</a> Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).</li>
<li>Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+and+function+of+lactate+dehydrogenase+A%3A+Therapeutic+potential+in+brain+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor.</a> Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).</li>
<li>Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+a+gene%3A+Multiple+genes+for+LDH+isozymes+provide+a+model+of+the+evolution+of+gene+structure%2C+function+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation.</a> Science. 189, 102-114 (1975).</li>
<li>Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+altered+activity+of+M-+and+H-isozyme+forms+of+human+lactate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase.</a> Proteins. 43, 175-185 (2001).</li>
<li>Holness, M. J., Sugden, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pyruvate+dehydrogenase+complex+activity+by+reversible+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation.</a> Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).</li>
<li>Yi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphofructokinase+1+glycosylation+regulates+cell+growth+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism.</a> Science. 337, 975-980 (2012).</li>
<li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+of+lactate+dehydrogenase+A+is+important+for+NADH%2FNAD%28%2B%29+redox+homeostasis+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells.</a> Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).</li>
<li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine-5+acetylation+negatively+regulates+lactate+dehydrogenase+A+and+is+decreased+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer.</a> Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).</li>
<li>Vanderlinde, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+total+lactate+dehydrogenase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Lab+Sci%22%5BJournal%5D)">Measurement of total lactate dehydrogenase activity.</a> Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).</li>
<li>Nelson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+imaging+of+patients+with+prostate+cancer+using+hyperpolarized+%5B1-%281%29%283%29C%5Dpyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate.</a> Sci Transl Med. 5, 198ra108(2013).</li>
<li>Flores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactate+dehydrogenase+activity+drives+hair+follicle+stem+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation.</a> Nat Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning tissues.</a> CSH Protoc. 2008, pdb prot4991 (2008).</li>
<li>Espada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-aqueous+permanent+mounting+for+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy.</a> Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).</li>
<li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+A+photochemically+stable+electron+mediator+between+NADH+and+various+electron+acceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors.</a> J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).</li>
</ol>

著者は開示する競合する興味を持ってないです。

ここで説明する方法は、乳酸脱水素酵素や他の代謝酵素生成 NADH または NADPH 依存性の異なる種類の細胞、組織内または時間の経過とともに組織のさまざまな部分の活動を監視する使用できます。乳酸脱水素酵素は幹細胞と腫瘍の生物学を理解するための重要な酵素を個々 の細胞における乳酸脱水素酵素の活動を監視する機能はこの酵素の機能に重要な洞察を提供する可能性が高い。
他の方法論と比較してこのプロトコルの重要な利点の 1 つはタンパク質豊富なだけではなく、モニター酵素活性能力はより決定的なについてだけではなく、乳酸脱水素酵素の酵素が結果することができます。現在、実際には機能しているが。ここで説明している方法は、選択した蛋白質、例えば、細胞の系統マーカーのレベルは、乳酸脱水素酵素活性として同じ組織サンプルで決定されますので、免疫組織化学と結合できます。乳酸脱水素酵素の活動を監視するため、MRI を用いたアプローチと比較して提供されるプロトコルがそれがより高い空間解像度を提供し、高い酵素活性を持つ、組織内の特定のセルを決定するのに役立つことができます利点.蛍光基板に基づくマッピング代謝へのアプ...

酵素が高または低活性を持つ、組織内の場所を理解する理解の開発および生理学のため不可欠です。謄本又はタンパク質レベルは、酵素活性の代理として使われます。このような研究は有益であることができます中、に、酵素の活動、翻訳後修飾、タンパク質複合体や酵素の細胞内局在性の存在などを決定するための重要なことができる情報は提供しません。酵素活性は直接計測するときにしばしばもはや組織内の高または低の活動と混合物または細胞の空間的分布内で個々 のセルについての情報が含まれて均質化タンパク質溶解液で監視されます。
ここで組織サンプル中の酵素活性の分布をマッピングするための詳しいプロトコルいたします。方法論は、テトラゾリウム塩を凍結するティッシュ1酸化酵素、還元酵素、脱水素酵素の活性のローカライズに使用できることを示す以前の研究に基づいています。これらのメソッドは、テトラゾリウム塩2,3に陽子が転送されるときに水不溶性ホルマザンが形成されます。グルコース-6-リン酸脱水素酵素は、NADPH と、陽子を生成し、テトラゾリウム アクティビティが検出されました。グルコース-6-リン酸脱水素酵素は、欧州ヒラメ肝4肺5の 2 型肺胞細胞と5腎臓のネフロンに監視されています。テトラゾリウム塩は、凍結するティッシュ6の細胞の活動を監視する使用されています。同様のアプローチは、隣接するスライド7で同じ組織の複数の脱水素酵素の活動を監視する最近使用されました。
乳酸脱水素酵素活性 (図 1) の空間分布を監視するテトラゾリウム塩を利用する方法をご紹介します。乳酸脱水素酵素、乳酸を解糖系と逆の反応で生成されたピルビン酸に変換できます。乳酸脱水素酵素活性はその結果ピルビン酸の乳酸とその分泌対トリカルボン酸入学の決定が重要であります。血液中の乳酸濃度は、それことを知らせた病気やけがが損傷した細胞、酵素がリリースされているので癌8,9,10, を含む病気の範囲の診断に使われます。
4 つの乳酸脱水素酵素の遺伝子がある: 発現、LDHB、LDHC、LDHD11。発現と LDHB は、早期発現遺伝子12の重複から生じていると考えられています。LDH は 4 量体として活躍、発現と LDHB は、homotetramers と heterotetramers の相互を形成できます。発現は、乳酸、高い親和性を持っていると優先的に乳酸をピルビン酸13に変換する LDHB が報告される間、ピルビン酸、高い親和性を有するとされています。発現プロモーターには、HIF1α、cMYC FOXM1 のトランスクリプション要因11結合部位が含まれています。さらに、ように多く他解糖系酵素14,15LDH が翻訳後修飾によって変更できます。線維芽細胞増殖因子受容体 1 は Y10、4 量体形成を促進する、または NADH 基板結合16を促進する Y83 発現に対することができます。発現にアセチル化17することができます。これらの理由から LDH タンパク質レベルだけでなく、同様の酵素の活性を監視する必要の LDH 活性を完全に理解します。
ここでは提示方式に加え乳酸脱水素酵素の活動を監視する他のアプローチは使用されました。乳酸脱水素酵素活性は、均質化蛋白ライセートの吸収スペクトルの測定監視できます。NADH の生成、乳酸、ピルビン酸に変換されます測定可能 340 吸光度に基づいて nm, ピルビン酸は乳酸18に変換されます NADH の消失を監視できます。乳酸脱水素酵素活性は、磁気共鳴画像 (MRI) に監視されています。13C ピルビン酸を投与することができの比としてピルビン酸から乳酸の変換を監視できる [1-13] 乳酸/[1-13C] ピルビン酸。比率を上昇 [1-13C] 乳酸/[1-13] ピルビン酸は、癌組織19で観察されています。MRI ベースのアプローチは、通常の乳酸脱水素酵素活性と疾患組織に関する情報を提供できますが、方法論は特定の細胞の活動レベルを決定するために必要な解像度を持っていません。ここで提供されている方法論は、組織の地域とも単一細胞における乳酸脱水素酵素活動の情報を提供できます。
その場で活性測定法を使用して、乳酸脱水素酵素の活性が高い20マウス皮膚の毛包幹細胞のことがわかった。また培養胚性幹細胞の乳酸脱水素酵素の活動を監視し、活動は幹細胞に送り装置の層よりも高いメソッドを使いました。最後に、新鮮なマウス大動脈における乳酸脱水素酵素の活動を監視し、平滑筋細胞内染色を観察しました。我々 はここで冷凍マウス皮膚における乳酸脱水素酵素の活動を監視するための詳しいプロトコルについて説明します。

<table><tbody><tr><td>手術器具</td><td></td><td></td><td>安楽死させたマウスから皮膚を採取するための</td></tr><tr><td>Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC9511236</td><td>マウスの皮膚を凍結するため</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.コンパウンド</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>NC9638938</td><td>クライオモールドの取り付け用</td></tr><tr><td>アイスバケツ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-210-106</td><td></td></tr><tr><td>ドライアイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリジン接着スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-545-78</td><td></td></tr><tr><td>4% ホルマリン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>23-245-684</td><td>水で希釈</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>23-245-684</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>フェナジンメトスルフェート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>ニトロテトラゾリウム 青色塩化</td>物 <td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>L-乳酸リチウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2250</td><td>基板</td></tr><tr><td>37°C;Cインキュベーター(または組織培養インキュベーター)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブラジル人!カウンターステイン</td><td>アナテック</td><td>861</td><td>カウンターステイン</td></tr><tr><td>取付 メディウム</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>H-5000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>スライド用カバースリップ</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544D</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マッピング代謝: 監視組織で直接乳酸脱水素酵素活性

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

空間と時間における酵素活性のマッピングは、正常組織と病気での細胞行動の分子基盤を理解することにとって重要です。その場で代謝活性アッセイは、組織内の代謝活動の空間分布に関する情報を提供できます。ここで組織サンプルに直接酵素乳酸脱水素酵素の活動を監視するための詳しいプロトコルいたします。乳酸脱水素酵素は消費グルコースが好気性または嫌気性解糖系によるエネルギーに変換するかどうかの決定が重要です。液乳酸および NAD は、凍結するティッシュ セクションを提供しています。高乳酸脱水素酵素活性と細胞はニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NAD) NADH と検出することができるプロトンの減少に基づいて提供される同時変換中、提供乳酸をピルビン酸に変換されます。nitrotetrazolium 青青い沈殿物として可視化した塩。マウス皮膚における乳酸脱水素酵素の活動を監視するための詳しいプロトコルについて述べる。このプロトコルを適用すると、乳酸脱水素酵素活性が皮膚内で静止の毛包幹細胞で高いことがわかった。マウス胚性線維芽細胞より培養胚性幹細胞の高い染色プロトコルを培養マウス胚性幹細胞に適用することを明らかにしました。新鮮単離マウス大動脈の解析では、大動脈に垂直平滑筋細胞における染色を明らかにしました。提供手法を使用して、新鮮なまたは冷凍の組織で陽子を生成する酵素の活性を空間的にマッピングすることができます。

我々 は以前マウス皮膚20の活性測定法の場での結果を報告しました。図 3のように、上記の手順で説明したときの毛包の基部に毛包幹細胞の乳酸脱水素酵素活性の高いレベルが続いていたを見ました。これらの調査結果は、毛包幹細胞を皮膚の並べ替えと並べ替えられた細胞の活性測定法と幹細胞コンパートメント高乳酸脱水素酵素活性を確認する蛍光性によって作動セルによって確証されました。
毛包幹細胞が高乳酸脱水素酵素活性を持つという我々 の調査結果に基づいて、我々 は培養胚性幹細胞の研究を拡張しました。マウス萌芽期の繊維芽細胞はフィーダー層としては、単独で、または胚性幹細胞の存在下で解析しました。媒体の吸気、培養細胞を分析して細胞が簡単に固定し乳酸脱水素酵素染色液を上記のように培養します。胚性線維芽細胞 (図 4...

Nicotinatmide アデニン酸 (NAD(P)H) + H + 組織サンプルで直接生成酵素の酵素活性の分布をマッピングするためのプロトコルについて述べます。

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

この方法は、組織内のさまざまな場所での酵素の活性など、生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、研究者が組織サンプル中の酵素活性を直接検出できることです。この手順を開始するには、動物の毛のトリマーでマウスの毛を取り除きます。ハサミを使って背中の皮膚を切開します。次に、皮を持ち上げて切り取ります。次に、クライオモールドに凍結試薬化合物を充填します。針鼻鉗子を使用して、皮膚切片をフィールドのクライオモールドに配置します。表皮から真皮、皮下組織、筋肉までの皮膚の断面が見えるように、皮膚部分の向きを変えます。可能であれば、実験マウスとコントロールマウスを同じクライオモールドに一緒にマウントして、同じスライドに切片化して一緒に処理できるようにします。気泡を作らないように注意してください。氷のバケツの中のドライアイスのブロックの平らな面にCryomoldを置きます。保管するには、Cryomoldをマイナス80°Cの冷凍庫に移します。サンプルは、酵素活性を大幅に損なうことなく、約3ヶ月間冷凍庫に保持できます。切片化では、マイナス20°Cに設定されたクライオスタットを使用して組織をスライスし、厚さ7〜10マイクロメートルの切片を作成し、最適な皮膚形態を実現します。この手順では、NADが保留されるコントロールスライド、基質乳酸が保留される別のコントロールスライド、および以前に調査した凍結組織ブロックからのポジティブコントロールスライドを含む、テストするスライドのセットを確立します。皮膚切片を含むスライドを4%ホルマリンで5分間簡単に固定します。次に、スライドをPBSで洗います。次に、NADP、PMS、塩化ニトロテトラゾリウム、および乳酸を含む試薬を一緒にボルテックスして、適切なサイズのチューブ内で乳酸デヒドロゲナーゼ活性染色を行います。次に、NADを除くすべての試薬が存在する2番目の溶液を調製します。続いて、乳酸を除くすべての試薬が存在する第3の溶液を調製する。スライドと染色液またはコントロール溶液をインキュベートするには、それらを同時に溶液に浸します。その後、暗闇の中で摂氏37度の加湿環境でインキュベートします。染色液の透明から青色への変換をモニターします。サンプルが目的の青みレベルに達したら、染色溶液を取り除き、PBSですすいで反応を停止します。その後、スライドが適切な青さのレベルに達したときに、スライドにカウンターステインを付けます。核を赤または緑に変える対比染色は、台湾の沈殿物によって作り出された青と良好なコントラストを提供します。次に、スライドを水性または非水性の封入剤でマウントします。封入剤は、カバースリップのサイズにもよりますが、1〜3滴で十分です。その後、スライドを光学顕微鏡で画像化します。実験サンプルとコントロールサンプル、およびす

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Research

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Biochemistry

生物化学

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隔離の乳酸脱水素酵素試金-哺乳類細胞における一括 Autophagic 隔離活動を決定するシンプルで信頼性の高い方法

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ホルスタイン種乳牛におけるミトコンドリア呼吸を推定する肝ミトコンドリアの酸素消費量とプロトン リーク動態測定

ここでは、分子状酸素を消費する能力とは無関係に、哺乳類細胞のミトコンドリア機能を直接測定するためのアッセイをまとめたものです。...

哺乳類のミトコンドリア機能を測定するための酸素非依存性アッセイ(英語)

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遺伝子コードセンサーを用いた ex vivoショウジョウバエ 幼虫脳におけるモノカルボン酸塩およびその他の関連代謝産物の可視化

ここでは、骨髄、脾臓、梗塞性心筋からマクロファージを抽出し、その後、生細胞の代謝フラックスを評価する方法を詳しく紹介します。...

脾臓および心臓マクロファージおよび骨髄単球における ex vivo 代謝フラックスの解析

このプロトコルは、カスタムメイドのバイオリアクターシステムと過分極¹³C...

過分極 13C NMRを用いた生細胞のリアルタイム代謝検出

学ぶ 組織内でNAD(P)H生成酵素の活性を直接検出する方法。乳酸脱水素酵素の空間分布をマッピングし、代謝プロセスや組織内の酵素活性の局在を理解するのに役立ちます。

マッピング代謝: 監視組織で直接乳酸脱水素酵素活性

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