Name: シナプスでサイクリング FM 色素: 高カリウムの脱分極、電気とチャネルロドプシン刺激の比較 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 学ぶシナプス小胞のエンドサイトーシスとエキソサイトーシスサイクリングをDrosophila幼虫神経筋接合部で蛍光FM色素を用いて観察する方法。高カリウム脱分極、電気刺激、オプトジェネティクスによる刺激技術を比較し、神経科学におけるシナプス伝達メカニズムの理解に貢献します。

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この記事への貢献のための Broadie の研究室のメンバーに感謝いたします。この作品は NIH の R01s MH096832 と MH084989 へ有限会社ケイビー、によって支持されたと D.L.K. に NIH を経て交わり F31 MH111144

1. 幼虫の接着剤剥離
<ol><li>10 部 1 部硬化エラストマー キット (材料表) から剤シリコーン ・ エラストマーをベース シリコーン ・ エラストマーを徹底的に混ぜます。</li>
	<li>(もはやべたべたする) まで数時間 22 x 22 mm ガラス coverslips エラストマーと 75 ° C のホット プレートに治療をコートします。</li>
	<li>幼虫の解剖のための準備にカスタムメイドのプレキシ ガラス解剖室 (図 1の一番下) に単一のエラストマー コーティング ガラス基盤を配置します。</li>
	<li>標準的な電極の引き手を使用して目的のテーパーを取得して先端サイズ ホウケイ酸ガラス毛管から接着剤ピペットを準備します。</li>
	<li>優しくマイクロ ピペット チップ、そしてもう一方の端に、柔軟なプラスチック製のチューブ (1/32"内部の直径、ID 3/32" 外径、OD; 1/32"の壁の 2 フィートを添付材料の表)口 (P2 ピペット チップ) をフィッティングします。</li>
	<li>幼虫の解剖に備えて接着 (材料表) の体積 (~ 20 μ L) が小さく、小さい容器 (0.6 mL エッペン チューブ キャップ) を入力します。</li>
	<li>(MM) に生理食塩水でチャンバー: 128 NaCl、2 KCl, 4 MgCl2、1 の CaCl2、70 ショ糖および 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 酸 (HEPES) pH 7.2。</li>
	<li>Alexa Fluor 647 に共役反わさびペルオキシダーゼ (HRP) 抗体を追加 (反-HRP:647; 希釈 1:10 1 mg/mL 在庫から) 略記をラベリングのため郭清21,22におけるシナプス前ターミナル。</li>
	<li>細かい絵筆 (サイズ 2) を使用して、食品バイアルから放浪 3 齢を取り外し、エラストマー被覆カバーガラスの上に置きます。</li>
	<li>添付ファイル (手順 1.5) で口によって生成された負圧利用による接着剤の少量をガラス マイクロ ピペット チップを埋めます。</li>
	<li>位置幼虫背側を鉗子と糊小さなエラストマー コーティング coverslip の頭を口の中で肯定的な空気圧を使用して接着剤のドロップを使用。</li>
	<li>2 つの接着剤の添付ファイルのピンと張った動物が拡大されることを確かめて、幼虫の後端でこの手順を繰り返します。</li>
	<li>はさみを使用して (刃 3 mm;材料表)、後部と背側の正中線に沿って垂直カットで水平カット (~ 1 mm) を作る。</li>
	<li>微細鉗子 (#5、材料表) を使用して優しく背気管、腸、脂肪体、その他の内臓の筋肉をカバーを取り外します。</li>
	<li>水平方向および垂直方向にゆっくり体壁を伸ばすようにして 4 つの体壁フラップ接着の手順を繰り返します。</li>
	<li>鉗子による腹側神経索 (VNC) を持ち上げて慎重に運動神経をはさみでカット VNC を完全に削除します。</li>
	<li>解剖生理食塩水に置き換えて Ca2 +-無料 (CaCl2上記解剖生理食塩水と同じ) に生理食塩水の SV を停止するサイクリングします。</li>
</ol>2. オプション 1: 高 [K+] FM 色素読み込み
<ol><li>FM1 43 在庫ソリューション (4 mM) から 90 mM KCl ソリューション (高 [K+] 解剖生理食塩水で) 4 μ M の最終的な集中のための 1 mL に 1 μ L を追加します。</li>
	<li>交換、ピペットを使用して Ca2 +のイメージング室 SV エンドサイトーシス染料の通風管を刺激するために高い [K+] FM 色素溶液における無料生理食塩水。</li>
	<li>すぐに脱分極刺激周期高 [K+] の前もって決定された持続期間のためのデジタル タイマー (e.g。、5 分。図 2)。</li>
	<li>健康な幼虫の準備を確認するには、高度 [K+] 脱分極期の持続期間のための筋肉の強い収縮に注意してください。</li>
	<li>タイマー期間が終了すると、すぐに高い [K+] FM 色素溶液を削除し、置き換えます Ca2 +-SV を停止する無料生理食塩水サイクリングします。</li>
	<li>Ca2 +と立て続けに洗って-高 [K+] FM 色素溶液を完全に削除できるように無料の生理食塩水 (1 分の 5 倍)。</li>
	<li>新鮮な Ca2 +で幼虫の準備を維持-即時共焦点顕微鏡イメージングのため無料生理食塩水。</li>
</ol>3. イメージング: 共焦点顕微鏡
<ol><li>水浸対物レンズ (その他の顕微鏡を使用することができます) 画像 NMJ 色素蛍光 X 40 で直立した共焦点顕微鏡を使用します。</li>
	<li>イメージ筋腹部セグメント 2-4 (他の NMJs をイメージすることができます) の 4 NMJ と適切なソフトウェア (資材表) を使用して画像を収集します。</li>
	<li>(ロングパス ・ フィルター > 635 nm) と HRP:647 と (バンドパス フィルター 530-600 nm) で FM1 43 を励起するのにアルゴン 488 nm レーザーを励起するのに HeNe 633 nm レーザーを使用します。</li>
	<li>運用上最適な利得と両方のチャネルのオフセットを決定します。 注: これらの設定は、実験の残りの部分全体で一定になります。</li>
	<li>シナプス ターミナルの下に HRP マーク上から全体の選択した NMJ を共焦点 Z スタックを取る。</li>
	<li>FM 染料のアンロード後に正確な同じ NMJ 過剰ように NMJ イメージ (セグメント、側筋) の注意を取る。</li>
</ol>4. 高 [K+] 刺激: FM 色素をアンロード
<ol><li>Ca2 +を交換-無料生食ドライブ脱分極に FM1 43 色素) を除いた高 [K+] 食塩を SV のエキソサイトーシスと染料のリリース。</li>
	<li>すぐ高 [K+] 刺激周期の前もって決定された持続期間のためにデジタル タイマー (e.g、2 分;。図 2)。</li>
	<li>タイマー期間が終了すると、すぐに高い [K+] 生理食塩水を削除し、置き換えます Ca2 +-SV を停止する無料生理食塩水サイクリングします。</li>
	<li>Ca2 +と立て続けに洗って-無料生理食塩水 (1 分の 5 倍) の高 [K+] 生理食塩水が完全に削除されていることを確認します。</li>
	<li>新鮮な Ca2 +で幼虫の準備を維持-即時共焦点顕微鏡イメージングのため無料生理食塩水。</li>
	<li>必ず同じ共焦点設定を使用して上記同じ略記で FM1 43 色素蛍光をイメージしてください。</li>
</ol>5. オプション 2: 電気刺激 FM 色素読み込み
<ol><li>電極の引き手 (資材表) を使用して必要なテーパーを取得して先端サイズ吸引ピペットを準備します。</li>
	<li>火-ポーランド語マイクロ フォージで電極先端まで単一の運動神経は、タイトなフィットを吸い上げることができます。</li>
	<li>マイクロマニピュレーターの電極ホルダーに吸引ピペットをスライドさせ、長く柔軟なプラスチック製のチューブと注射器を付けます。</li>
	<li>刺激パラメーターを設定 (例えば.、15 V、20 Hz の周波数、持続時間を 20 ms、時間 5 分 (図 2) または 1 分 (図 3))。</li>
	<li>Ca2 +を交換-無料生理食塩水生理リグに FM1 43 食塩水 (4 μ M; 1 mM CaCl2) 上記と幼虫の準備に。</li>
	<li>顕微鏡ステージの準備を入れて幼虫および吸引ピペットがフォーカス (40 X 水浸対物レンズ) になるまでステージを上げます。</li>
	<li>負圧吸引電極に注射器によって生成されると選択した hemisegment を支配するカットの運動神経のループを吸います。</li>
	<li>選択した hemisegment の筋肉の収縮を視覚的に監視しながら刺激を短時間で吸引電極機能をテストします。</li>
	<li>選択したパラメーター (ステップ 5.4) SV エンドサイトーシスをドライブして FM1 43 染料の通風管 (図 2) を使用して運動神経を刺激します。</li>
	<li>Ca2 +と立て続けに洗って-FM1 43 色素溶液を完全に削除できるように無料の生理食塩水 (1 分の 5 倍)。</li>
	<li>新鮮な Ca2 +で幼虫の準備を維持-上から共焦点イメージング プロトコルを使用して即時画像無料生理食塩水。</li>
	<li>NMJ イメージ (セグメント、側と筋肉) FM 色素をアンロードした後正確な同じ NMJ へのアクセスを確保するための注意を取る。</li>
</ol>6. 電気刺激: FM 色素をアンロード
<ol><li>Ca2 +を交換-無料の FM1 43 色素) を除いた正規の生理食塩水を生理食塩水と電気生理学リグ ステージに戻り準備を配置。</li>
	<li>荷を下すことのための刺激パラメーターを設定 (例えば15 V、20 Hz の周波数、持続時間 20 ms、時 2 分 (図 2) または 20 s (図 3))。</li>
	<li>上記のように、同じ電極に同じ運動神経を吸うし、SV エキソサイトーシスと FM1 43 色素リリースをアクティブにし、刺激します。</li>
	<li>Ca2 +と立て続けに洗って-外部の色素を完全に除去できるように無料の生理食塩水 (1 分の 5 倍)。</li>
	<li>新鮮な Ca2 +で幼虫の準備を維持-即時共焦点顕微鏡イメージングのため無料生理食塩水。</li>
	<li>同じ共焦点設定を使用して上記同じ略記で FM1 43 色素蛍光を画像を確認します。</li>
</ol>7. オプション 3: チャネルロドプシン刺激 FM 色素読み込み
<ol><li>ChR2 を表現する幼虫 (100 μ M 最終濃度で溶解し、エタノール; ChR2 共同因子すべて trans 網膜を含む食品を上げます。</li>
	<li>カメラ ポート装備されて解剖顕微鏡ステージにプレキシ ガラス室で幼虫の準備を配置します。</li>
	<li>青色 LED を添付 (470 nm;材料の表)プログラム可能な刺激に同軸ケーブルを使用して、カメラのポートに LED を配置します。</li>
	<li>顕微鏡ズーム機能を使用して切り裂かれた幼虫関数の上に青い LED 光線の焦点を合わせます。</li>
	<li>Ca2 +を交換-無料生理食塩水での準備作業は、幼虫の FM1 43 生理食塩水 (4 μ M; 1 mM CaCl2) 上記光ステージ上に。</li>
	<li>刺激装置 (例えば15 V、20 Hz の周波数、持続時間を 20 ms、時間 5 分 (図 2)) を使用して LED のパラメーターを設定します。</li>
	<li>光刺激を開始し、(例えば、5 分の光遺伝学的刺激周期の前もって決定された持続期間のためのタイマーと追跡図 2)。</li>
	<li>タイマーが止まったら、すぐに FM 色素溶液を削除し、置き換えます Ca2 +-SV を停止する無料生理食塩水サイクリングします。</li>
	<li>Ca2 +と立て続けに洗って-FM 色素溶液を完全に削除できるように無料の生理食塩水 (1 分の 5 倍)。</li>
	<li>新鮮な Ca2 +で幼虫の準備を維持-共焦点顕微鏡上から撮像プロトコルを使用して即時イメージングのため無料生理食塩水。</li>
	<li>NMJ イメージ (セグメント、側と筋肉) FM 色素をアンロードした後正確な同じ NMJ へのアクセスを確保するための注意を取る。</li>
</ol>8. チャネルロドプシン刺激: アンロード FM 色素
<ol><li>Ca2 +を交換-カメラのポート LED を解剖顕微鏡ステージ上 FM1 43 色素) を除いた通常生理食塩水で無料生理食塩水は、幼虫に焦点を当てた。</li>
	<li>アンロード (例えば15 V、20 Hz の周波数、持続時間を 20 ms、2 分 (図 2) の時間) の刺激パラメーターを設定します。</li>
	<li>光刺激を開始し、光刺激周期の前もって決定された持続期間のためのタイマーと追跡 (例えば、 2 分;図 2)。</li>
	<li>タイマー期間が終了すると、すぐに FM 色素溶液を削除し、置き換えます Ca2 +-SV を停止する無料生理食塩水サイクリングします。</li>
	<li>Ca2 +と立て続けに洗って-外部の色素を完全に除去できるように無料の生理食塩水 (1 分の 5 倍)。</li>
	<li>新鮮な Ca2 +で幼虫の準備を維持-即時共焦点顕微鏡イメージングのため無料生理食塩水。</li>
	<li>同じ共焦点設定を使用して上記同じ略記で FM1 43 色素蛍光を画像を確認します。</li>
</ol>9. 蛍光定量
<ol><li>画像 J (NIH オープン ソース) で画像を読み込み、画像をクリックして最大強度投影を作成 |スタック |Z プロジェクト。</li>
	<li>反を使用して-HRP:647 チャネル、イメージを行く |調整 |しきい値とスライド上部のツールバー NMJ だけがハイライトされるまで。</li>
	<li>選択ツールを使用して、略記をクリックします。略記が不連続で、Shift ボタンを押したまま、すべての部品を選択します。</li>
	<li>FM1 43 色素チャンネルに画像を変更し、分析に行く |蛍光測定値を取得するための対策。</li>
	<li>「無負荷」イメージの同じ略記 (識別セグメント、側筋) から、9.1 9.4 手順を繰り返します。</li>
	<li>読み込まれた染料の割合を得るためには、アンロードとロードの蛍光強度の比を取る。 注: この手順は、「フリーハンド」、「楕円形」または選択ツールを使用してブートンあたりブートンに蛍光を分析する変更できます。背景の蛍光性は筋肉蛍光をサンプリングすることによって減算することができます。このような背景を減らすために、エージェントを追加もできます。</li>
</ol>

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</ol>

著者は競争の興味を宣言しません。

高 [K+] 生理食塩水脱分極刺激は、サイクリング、活動依存した FM 色素が可能性が高い少なくとも生理的29の 3 つのオプション、はるかに簡単です。この簡単な方法は、全体の動物のすべてのアクセス可能なセルを脱分極し、監督の研究を許可しませんので。ローカル高 [K+] 生食、マイクロ ピペットに適用することがありますが、これはまだ前/後シナプス細胞とシナプス関連グリアの可能性が高い1を脱分極します。別の主要な関心事は、その高 [K+] 脱分極ドライブの急速な形成物質研究で稀だけ見られている一括エンドソームです。ただし、一括エンドソームの形成は、突然変異によって29、本当の生理過程を示すブロック アクティブなメカニズムです。したがって、FM1 43 高 [K+] 偏光イメージングは、選択的にシナプスに一括エンドサイトーシスを研究に使用できます。吸引電極運動神経の電気刺激より制御された方法です。単一軸索のバンド...

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部 (NMJ) グルタミン酸作動性シナプスの美しく特徴モデルは、シナプス形成と遺伝的摂動1の広大なスペクトルを持つ関数の研究に使用されています。モーターニューロン ターミナルは複数の軸索分岐を多く拡大されたシナプス ボタンのそれぞれから成っています。これらの容量の大きい下肢 (最大 5 μ m) を含む制服グルタミン酸作動性シナプス小胞を含む神経伝達機械のすべて (SVs; 〜 40 nm の直径の) ゾル性細胞質の準備で容易に脱着可能なプール2。これらの小胞はシナプス前膜融合サイト アクティブ ・ ゾーン (AZs)、エキソサイトーシスがトランスのグルタミン酸神経伝達物質を仲介でドック-シナプス通信。その後、SVs は繰り返し exo/エンドサイトーシス サイクルのキス-実行のリサイクルやクラスリン依存性エンドサイトーシス (CME) を介して細胞膜から取得されます。ショウジョウバエNMJ は簡単にアクセス可能で、分離して SV サイクル変異体の特性の両方に適しています。前方遺伝スクリーンを使用した新規変異は SV サイクル3の重要な新しい遺伝子の同定につながっています。また、既に知られている遺伝子で始まる逆遺伝学的アプローチは、変異体の表現型4をサイクリングの注意説明を通じて新しい SV 循環メカニズムの解明につながっています。ショウジョウバエNMJ はほぼ光学トラック小胞神経伝達中にサイクリングするメソッドを介して SV エンドサイトーシス、エキソサイトーシスのメカニズムを解剖するための実験的シナプス準備として最適です。
蛍光マーカーの範囲ことが力学をサイクリング中に小胞の視覚追跡ですが最も汎用性の高い FM 色素類縁体を f.、真央らによって初めて合成されました。5. 構造上、FM 染料を含む水性頭とつながっている芳香環、中部のスペクトル特性を付与と脂溶性尾。これらのスチリル色素膜で可逆的にパーティションはない 'フリップフ ロップ' 膜リーフレットの間、ですから、無料、細胞質で、水5よりもはるかに多く蛍光膜です。脂質二分子膜へのリバーシブルの挿入は、蛍光640 増加を引き起こします。神経シナプスで古典的な FM 色素標識実験 SV エンドサイトーシスを介して色素をロードする刺激を脱分極中に染付シナプス準備を入浴で構成されます。外部の色素は離れて洗浄し、SV サイクルは読み込まれたシナプス7をイメージさせるカルシウム無料リンゲル液で逮捕されました。色素フリー バースの刺激の第 2 ラウンドは、エキソサイトーシス、蛍光強度の減少を測定することによって続くことができるプロセスを介して FM リリースをトリガーします。小胞の数百を含むプールを単一の小胞から SV 集団は、定量的に監視対象6,7をすることができます。FM 染料は、機能的に異なる SV プールの活動依存的動員を解剖して CME サイクリング8,9対キス-実行を比較するために使用されています。メソッドは、アッセイ別の誘発、自発的なミニチュアのシナプス サイクル活動 (非常に小さい蛍光変化を検出し、退色を低減する高感度の機器) を10に変更されています。試金によって拡張できます微細構造のレベルに photoconverting 蛍光 FM 信号伝達電子顕微鏡11,12,13,14 の電子密度の高いラベルに.
歴史的には、高濃度カリウム (以下「高 [K+]」という) の入浴シナプス準備サイクリング; SV を誘発する刺激を脱分極の選択の方法をされているカエル コリン作動性 NMJ5からまでは、げっ歯類脳海馬ニューロン15、ショウジョウバエグルタミン酸 NMJ モデル16,17に培養。この高 [K+] アプローチは簡単です、特殊な装置を必要としないとほとんどのラボにアクセスできます制限がありますアプリケーションのデータの解釈。神経4,5,12吸引電極電気刺激を使用する大いにもっと生理学的に適切な方法です。このアプローチはシナプス前神経直接刺激の活動電位伝搬をターミナル、ドライブおよび伝達関数13,14、電気生理学的アッセイに結果を直接比較すること 15、しかし特殊な装置を必要として技術的にはるかに困難です。チャネルロドプシン神経刺激の使用は、光遺伝学の出現により、バイナリ Gal4/UAS システム20を使用して、チャンネル式のタイトな時空間制御を含むその他の利点することができます。この方法は技術的に吸引電極刺激よりもはるかに簡単です、何も非常に安い LED 光源以上が必要です。ここでは、我々 は FM1 43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) ピリジニウム臭化) をして両方比較してショウジョウバエNMJ でこれらの 3 つの異なる刺激の方法の画像を採用して: 単純な高 [K+]、電気と新しいチャネルロドプシンのアプローチに挑戦します。

<table><tbody><tr><td>シルガード184シリコーンエラストマーキット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC9644388</td><td>解剖用のカバーガラスに置くには</td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス 22x22-1</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-542-B</td><td>解剖のためにシルガードを置くには</td></tr><tr><td>アルミトップホットプレートタイプ2200</td><td>サーモリン</td><td>HPA2235M</td> シルガードプレキシガラス解剖室<td>を硬化させるには</td></tr><tr><td></td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>手作り</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細血管</td><td>WPI</td><td>1B100F-4</td><td>吸引と接着マイクロピペットを作るには</td></tr><tr><td>レーザーベースのマイクロピペットプーラー</td><td>サッター機器</td><td>P-2000</td><td>吸引と接着マイクロピペットを作るには</td></tr><tr><td>Tygon E-3603 Laboratory Tubing</td><td>Component Supply Co.</td><td>TET-031A</td><td>口と吸引のピペット用</td></tr><tr><td>P2 ピペットチップ</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3700</td><td>口のピペット</td></tr><tr><td>用 0.6-mL エッペンドルフ チューブキャップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-408-120</td><td>解剖用の接着剤を入れるために使用</td></tr><tr><td>Vetbond 3M</td><td>WPI</td><td>ベトボンド</td><td>解剖に使用する接着剤</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>P-217</td><td>Forsaline</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>ミリポアシグマ</td><td>S5886</td>生理<td>食塩水</td></tr><tr><td>用塩化マグネシウム</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>M35-500</td>生理<td>食塩水</td></tr>塩化<tr><td>カルシウム二水和物</td><td>ミリポアシグマ</td><td>C7902</td><td>生理食塩水</td></tr><tr><td>スクロー</td>スフィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>S5-3</td>生理<td>食塩水</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ミリポアシグマ</td><td>H3375</td><td>生理食塩水</td></tr><tr><td>HRP用:Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>123-605-021</td><td>神経膜の標識には</td></tr><tr><td>Paintbrush</td><td>Winsor &ニュートン</td><td>94376864793</td><td>幼虫を操作するには</td></tr><tr><td>デュモン・デュモスター・ピンセット #5</td><td>WPI</td><td>500233</td><td>解剖時に使用</td></tr><tr><td>7 cm マクファーソン・バンナス マイクロハサミ (ブレード 3 mm)</td><td>WPI</td><td>14177</td><td>解剖時に使用&nbsp;</td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>T35356</td><td>蛍光スチリル染料</td></tr><tr><td>デジタル</td><td>タイマーVWR62344-641FM</td><td></td><td>染料のロード/アンロードのタイミング用&nbsp;</td></tr><tr><td>LSM 510 META レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td>蛍光マーカーのイメージング用</td></tr><tr><td>Zen 2009 SP2 version 6.0</td><td>Zeiss</td><td></td> 共焦点<td></td></tr><tr><td>HeNe 633nmレーザー</td>上のイメージング用ソフトウェア <td>Lasos</td><td></td><td>イメージング中にHRP:647を励起する</td></tr><tr><td>Argon 488nmレーザー</td><td>Lasos</td><td></td><td>イメージング中にFM色素を励起する</td></tr><tr><td>Micro-Forge</td><td>WPI</td><td>MF200</td><td>ファイヤーポリッシュガラスマイクロピペット</td></tr><tr><td>20mL シリンジスリップチップ</td><td>BD</td><td>301625</td><td>軸索を吸い上げて電気刺激を行います。</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター(磁気ベース)</td><td>成茂</td><td>MMN-9</td><td>電気刺激用吸引電極の制御用</td></tr><tr><td>スティミュレーター</td><td>グラス</td><td>S48</td><td>LEDと電気刺激の制御用</td></tr><tr><td>ツァイス アクシオスコップ顕微鏡</td><td>ツァイ</td><td></td>ス <td>電気刺激時に使用します。</td></tr><tr><td>40X Achroplan 水浸対物レンズ</td><td>Zeiss</td><td></td><td>電気刺激および共焦点イメージング中の使用</td></tr><tr><td>オールトランス レチナール</td><td>ミリポア Σ</td><td>R2500</td><td>ChR2</td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 顕微鏡 カメラポート付き</td><td>Zeiss</td><td>2000-C</td><td>チャネルロドプシン刺激中に使用</td></tr><tr><td>LED 470nm</td><td>ThorLabs</td><td>M470L2</td><td>ChR活性化に使用</td></tr><tr><td>T-Cube LEDドライバ</td><td>ThorLabs</td><td>LEDD1B</td><td>LED</td></tr><tr><td>LED電源</td>を制御するには <td>Cincon Electronics Co.</td><td>TR15RA150</td><td>LED</td></tr><tr><td>に電力を供給するには 光パワーおよびエネルギーメーター</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D</td><td>LEDの強度を測定するには</td></tr></tbody></table>

シナプスでサイクリング fm 色素: 高カリウムの脱分極、電気とチャネルロドプシン刺激の比較

FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation

FM 染料は、シナプス小胞 (SV) サイクルの研究に使用されます。これらの両親媒性プローブには、親水性の頭部と疎水性尾、水溶性膜脂質二重層を可逆的に出入りする能力を持つことがあります。これらのスチリル色素が比較的非水溶液中で蛍光性が細胞膜の外側のリーフレットに挿入、> 40 X 蛍光の増加します。神経シナプスにおける FM 染料は SV エンドサイトーシス、神経伝達のシナプス前の段階を可視化する強力なツールを提供する、内および SV プール間の人身売買とのリリースの SV エキソサイトーシスの中に内面化します。グルタミン酸作動性シナプスの開発と機能の主な遺伝モデルはショウジョウバエ変異条件の広い範囲で SV のダイナ ミックスを定量化する神経筋接合部 (NMJ) は、FM がイメージングを色素が広く使用されています。NMJ シナプス ターミナルは大きなシナプス ボタン イメージング アプリケーションに最適の美しい配列と、簡単にアクセスできます。ここで、我々 は比較対照ショウジョウバエ活動依存した FM1 43 色素取り込み/リリースを駆動する NMJ を刺激する 3 つの方法: 高 [K+] 神経筋組織を脱分極作用、2) 吸引電極運動神経の 1) お風呂のアプリケーションシナプス前の神経ターミナルと 3 を脱分極刺激) は、チャネルロドプシン亜種脱分極の光刺激、空間の制御のための遺伝子組換え発現を対象しました。これらの各メソッドは、利点と欠点 SV サイクルの遺伝の突然変異の効果に関する研究のショウジョウバエNMJ。これらの長所と短所それぞれの戦略に固有の方法論とともに、刺激アプローチの選択を支援するために説明します。蛍光イメージングに加え FM 染料は超微細構造レベルで SV 循環メカニズムを研究する透過型電子顕微鏡 (TEM) を用いて可視化する電子密度の高い信号に photoconverted をすることができます。我々 は、共焦点の比較を提供および電子顕微鏡イメージングショウジョウバエNMJ 刺激、支援するためのさまざまな方法から将来の実験的パラダイムの選択。

図 1は、活動依存した FM 染料のプロトコルをイメージングのための作業フローを示します。実験は、その後使用される刺激方法に関係なく、同じ幼虫接着剤郭常に始まります。図 1 aは、神経と繰り返し hemisegmental 筋パターンを放射腹側神経索 (VNC) を示す切り裂かれた幼虫の模式図です。VNC は削除され準備を浴びて FM1 43 (図 1 b、ピンク) の 4 μ M ソリューション。準備は、活動依存した SV エンドサイトーシス (図 1cI-III) を介して色素をロードする 3 つのオプションのいずれかを使用して FM 色素の存在下で刺激されます。次に、FM 色素サイクリングには Ca2 +を使用して、逮捕されて-無料生理食塩水と FM 色素ロードされている特定...

シナプス小胞 (SV) 神経シナプスでの細胞間コミュニケーションの中核機構は、サイクリングします。FM 色素取り込みと放出は、定量的 SV 遠藤と分泌の試金の主な手段です。ここでは、我々 は FM1 43ショウジョウバエの神経筋接合部 (NMJ) モデルのシナプスでサイクリングを駆動するためのすべての刺激方法を比較します。

シナプスでサイクリング FM 色素: 高カリウムの脱分極、電気とチャネルロドプシン刺激の比較

FM dyes are used to study the synaptic vesicle (SV) cycle. These amphipathic probes have a hydrophilic head and hydrophobic tail, making them ...

この実験の全体的な目標は、蛍光FM染料を使用してショウジョウバエの幼虫神経筋接合部の生きた調製で、シナプス小胞のエンドサイトーシスおよびエキソサイトーシスサイクルを観察することです。この方法は、シナプス小胞周期の機能に重要な遺伝子は何かなど、神経科学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、高カリウム脱分極、電気刺激、または光遺伝学の3つの異なるタイプの刺激を使用して、ライブ調製物での小胞サイクリングを光学的に追跡できることです。この手順であるためには、レクソフロール647に結合した抗HRP抗体を解剖生理食塩水に加えます。次に、エラストマーコーティングされたカバースリップを解剖チャンバーに加え、解剖中にNMJシナプス前末端を標識するためのHRP抗体を含む解剖液を追加します。細い絵筆を使用して、さまようサードインスターをフードバイアルからエラストマーコーティングされたカバーガラスに移します。次に、口から発生する負圧を使用して、ガラス製のマイクロピペットチップに少量の接着剤を充填します。次に、幼虫を背側を上にして鉗子で配置し、口からの陽圧を使用して、少量の接着剤でエラストマーでコーティングされたカバースリップに頭を接着します。幼虫の後端でこの手順を繰り返し、動物が2つの接着剤アタッチメントの間でぴんと張っていることを確認します。はさみを使用して、後部に1ミリメートルの水平カットを行い、背側の正中線に沿って垂直にカットします。次に、背側の気管、腸、脂肪体、その他の内臓をそっと取り除き、筋肉組織を覆います。4つのボディウォールフラップの接着手順を繰り返し、水平と垂直の両方でボディを優しく伸ばすようにします。その後、VNCを持ち上げ、はさみで運動神経を慎重に切断し、VNCを完全に取り除きます。解剖生理食塩水をカルシウム遊離生理食塩水に交換して、SVサイクリングを停止します。電気刺激の場合は、微小電極プーラーを使用して吸引ピペットを準備し、必要なテーパーとチップサイズを取得します。その後、マイクロ電極の先端をマイクロフォージでファイヤーポリッシュし、単一の運動神経を吸い上げるときにぴったりとフィットします。吸引ピペットを、長くて柔軟なプラスチックチューブとシリンジに取り付けられたマイクロマニピュレーターの電極ホルダーにスライドさせます。次に、FM色素を使用した調製物を顕微鏡ステージに置き、幼虫と吸引ピペットにピントが合うまでステージを上げます。次に、切断された運動神経のループを吸い上げ、シリンジによって生成された負の空気圧で選択した半部セグメントを吸引電極に神経支配します。その後、選択したパラメーターを使用して運動神経を刺激し、SVエンドサイトーシスとFM143色素の取り込みを促進します。手順のこの時点で最も重要なステップは、単一のモーター軸索を吸引電極にしっかりとフィットさせて吸い上げることです。これには試行錯誤が必要かもしれません。適切な吸引電極が見つかったら、比較するすべての条件に同じ電極を使用して、一貫した刺激ひずみを確保します。FM染料のアンロードでは、同じ運動神経を同じ電極に吸い込み、運動神経を刺激してSVエキソサイトーシスとFM143染料の放出を活性化します。チャネルロドプシン刺激の場合は、同軸ケーブルを使用して青色LEDをプログラム可能な刺激装置に取り付け、LEDをカメラポートに配置します。顕微鏡ズーム機能を使用して、FM色素を用いた調製物に青色LED光ビームを集束させます。手順のポイントで最も重要なステップは、LEDの設定が一定に保たれていること、および比較されるすべての条件で各動物の同じ部分を照らして、一貫した刺激ひずみを確保することです。光刺激を開始し、光遺伝学的刺激期間の所定の期間タイマーで追跡します。タイマーが止まったら、すぐにFM染料溶液を取り出し、カルシウムを含まない生理食塩水と交換してSVサイクリングを停止します。FM色素のアンロードのうち、光刺激を開始し、オプトジェネティクス刺激期間の所定の時間、タイマーで追跡します。タイマー期間が終了したら、FM染料溶液をすばやく取り出し、カルシウムを含まない生理食塩水と一緒に置いてSVサイクリングを停止します。蛍光画像を定量化するには、画像Jにロードし、画像、スタック、Zprojectをクリックして最大強度投影を作成し、次に反HRP 647チャンネルを使用して、画像、調整、しきい値に移動し、NMJだけが強調表示されるまで上部のツールバーをスライドさせます。ワンドツールを使用して、NMJをクリックします。NMJが不連続な場合は、シフトボタンを押したまますべての部品を選択します。次に、画像をFM 143色素チャネルに変更し、[分析]、[測定]に移動して蛍光測定値を取得します。同じ NMJ からアンロードされたイメージに対して、これらの手順を繰り返します。Fluorescent FM 143は、TEMを介して可視化するために、酸化されたDAB電子高密度沈殿物に光変換することができます。これは、FM 143色素の負荷に依存する活動後にショウジョウバエNMJを標識するための写真変換方法の概略図です。これは、野生型の安静時のシナプスブートンの代表的なTEM画像であり、均一なサイズのSVの密集した集団を示しています。これらの画像は、光変換なしで5分間、またはFM143光変換で高カリウム生理食塩水脱分極で刺激されたシナプスブートンを示しています。ここでは、バルクエンドのホモ構造を観察できます。そして、これらの画像は、光変換なしで、またはFM143光変換で、神経吸引電極で20ヘルツの神経吸引電極で5分間電気的に刺激されたシナプスボタンを示しています。染料をロードした小胞は、隣接する未負荷の小胞よりもはるかに暗く見えることに注意してください。このビデオを見た後、幼虫の接着剤解剖を行う方法と、高カリウム脱分極、電気刺激、光遺伝学的チャネルロドプシン刺激を使用したFM染料のロードとアンロードを行う方法について十分に理解できるはずです。FM色素がFei-Maoによって最初に合成されて以来、これらの汎用性の高い色素は、クラスリン媒介性エンドサイトーシスとクラスリン媒介性エンドサイトーシスの違いを研究するための、異なる小胞プールの活動依存的な動員の研究、および誘発された自発的およびミニチュアシナプス活動の研究に使用されてきました。この実験では、考慮すべき多くの要素があります。いくつか例を挙げると、外部カルシウム濃度、使用する刺激方法の種類、および取り込みおよび放出ステップ中にFM色素をロードおよびアンロードする時間。これらの要素を十分に考慮して、ご自身で実験を計画してください。がんばって！

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このプロシージャは、神経筋接合部（NMJ）の光パルスでシナプス電位を惹起する青色光活性化藻類チャネルと細胞特異的遺伝子発現のツールを使用しています...

シナプス電位のChannelrhodopsin2仲介刺激でショウジョウバエ神経筋接合部

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このビデオは、チャネルロドプシンを発現するショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部でのシナプス小胞のリサイクルを蛍光色素を使用して研究するプロトコルを示しています。青色光はチャネルロドプシンを活性化し、カルシウムの流入とシナプス小胞のエキソサイトーシスを引き起こします。この色素は神経膜に組み込まれ、エンドサイトーシス中に内在化されるため、蛍光が増強されます。さらにブルーライト刺激を受けると、エキソサイトーシスと色素の放出が誘発され、これは蛍光の減少によって示されます。...

ショウジョウバエ幼虫におけるシナプス小胞のリサイクルと蛍光色素の取り込みの解析

私たちは、機能的な神経末端での画像シナプス小胞のリサイクルへのスチリルのFM色素の使用を記載している。このプロトコルは、誘発するだけでなく、自発的な、ミニチュアシナプス活動にも適用することができる。プロトコルは、効果的に評価することができシナプス様々なイベントが展開されます。...

誘発、自発的、およびミニチュアシナプス活動中に、FM色素を用いたシナプス小胞のリサイクルの検討

この記事は、フグ毒、テトロドトキシン耐性ナトリウム チャネル、NaChBac...

テトロドトキシン耐性ナトリウム チャネルを用いたショウジョウバエのシナプス接続を調べる

ウサギ心筋細胞におけるGtACR1活性化の電気機械効果を評価するプロトコルを提示する。細胞分離、培養、アデノウイルス伝達、パッチクランプ、炭素繊維技術による機能実験に関する詳細な情報を提供します。...

光遺伝学的変調型心筋細胞活性の電気機械評価

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro...

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

機能部位特異的蛍光法は、タンパク質ドメインの動きをリアルタイムで研究する方法です。天然細胞への適用のためのこの技術の修正は、マウス単離された骨格筋線維における電位依存性Ca2+...

骨格筋興奮性を研究するための天然細胞における機能部位特異的蛍光測定

学ぶシナプス小胞のエンドサイトーシスとエキソサイトーシスサイクリングをDrosophila幼虫神経筋接合部で蛍光FM色素を用いて観察する方法。高カリウム脱分極、電気刺激、オプトジェネティクスによる刺激技術を比較し、神経科学におけるシナプス伝達メカニズムの理解に貢献します。

シナプスでサイクリング FM 色素: 高カリウムの脱分極、電気とチャネルロドプシン刺激の比較

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