シナプスでサイクリング FM 色素: 高カリウムの脱分極、電気とチャネルロドプシン刺激の比較

この実験の全体的な目標は、蛍光FM染料を使用してショウジョウバエの幼虫神経筋接合部の生きた調製で、シナプス小胞のエンドサイトーシスおよびエキソサイトーシスサイクルを観察することです。この方法は、シナプス小胞周期の機能に重要な遺伝子は何かなど、神経科学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、高カリウム脱分極、電気刺激、または光遺伝学の3つの異なるタイプの刺激を使用して、ライブ調製物での小胞サイクリングを光学的に追跡できることです。

この手順であるためには、レクソフロール647に結合した抗HRP抗体を解剖生理食塩水に加えます。次に、エラストマーコーティングされたカバースリップを解剖チャンバーに加え、解剖中にNMJシナプス前末端を標識するためのHRP抗体を含む解剖液を追加します。細い絵筆を使用して、さまようサードインスターをフードバイアルからエラストマーコーティングされたカバーガラスに移します。

次に、口から発生する負圧を使用して、ガラス製のマイクロピペットチップに少量の接着剤を充填します。次に、幼虫を背側を上にして鉗子で配置し、口からの陽圧を使用して、少量の接着剤でエラストマーでコーティングされたカバースリップに頭を接着します。幼虫の後端でこの手順を繰り返し、動物が2つの接着剤アタッチメントの間でぴんと張っていることを確認します。

はさみを使用して、後部に1ミリメートルの水平カットを行い、背側の正中線に沿って垂直にカットします。次に、背側の気管、腸、脂肪体、その他の内臓をそっと取り除き、筋肉組織を覆います。4つのボディウォールフラップの接着手順を繰り返し、水平と垂直の両方でボディを優しく伸ばすようにします。

その後、VNCを持ち上げ、はさみで運動神経を慎重に切断し、VNCを完全に取り除きます。解剖生理食塩水をカルシウム遊離生理食塩水に交換して、SVサイクリングを停止します。電気刺激の場合は、微小電極プーラーを使用して吸引ピペットを準備し、必要なテーパーとチップサイズを取得します。

その後、マイクロ電極の先端をマイクロフォージでファイヤーポリッシュし、単一の運動神経を吸い上げるときにぴったりとフィットします。吸引ピペットを、長くて柔軟なプラスチックチューブとシリンジに取り付けられたマイクロマニピュレーターの電極ホルダーにスライドさせます。次に、FM色素を使用した調製物を顕微鏡ステージに置き、幼虫と吸引ピペットにピントが合うまでステージを上げます。

次に、切断された運動神経のループを吸い上げ、シリンジによって生成された負の空気圧で選択した半部セグメントを吸引電極に神経支配します。その後、選択したパラメーターを使用して運動神経を刺激し、SVエンドサイトーシスとFM143色素の取り込みを促進します。手順のこの時点で最も重要なステップは、単一のモーター軸索を吸引電極にしっかりとフィットさせて吸い上げることです。

これには試行錯誤が必要かもしれません。適切な吸引電極が見つかったら、比較するすべての条件に同じ電極を使用して、一貫した刺激ひずみを確保します。FM染料のアンロードでは、同じ運動神経を同じ電極に吸い込み、運動神経を刺激してSVエキソサイトーシスとFM143染料の放出を活性化します。

チャネルロドプシン刺激の場合は、同軸ケーブルを使用して青色LEDをプログラム可能な刺激装置に取り付け、LEDをカメラポートに配置します。顕微鏡ズーム機能を使用して、FM色素を用いた調製物に青色LED光ビームを集束させます。手順のポイントで最も重要なステップは、LEDの設定が一定に保たれていること、および比較されるすべての条件で各動物の同じ部分を照らして、一貫した刺激ひずみを確保することです。

光刺激を開始し、光遺伝学的刺激期間の所定の期間タイマーで追跡します。タイマーが止まったら、すぐにFM染料溶液を取り出し、カルシウムを含まない生理食塩水と交換してSVサイクリングを停止します。FM色素のアンロードのうち、光刺激を開始し、オプトジェネティクス刺激期間の所定の時間、タイマーで追跡します。

タイマー期間が終了したら、FM染料溶液をすばやく取り出し、カルシウムを含まない生理食塩水と一緒に置いてSVサイクリングを停止します。蛍光画像を定量化するには、画像Jにロードし、画像、スタック、Zprojectをクリックして最大強度投影を作成し、次に反HRP 647チャンネルを使用して、画像、調整、しきい値に移動し、NMJだけが強調表示されるまで上部のツールバーをスライドさせます。ワンドツールを使用して、NMJをクリックします。

NMJが不連続な場合は、シフトボタンを押したまますべての部品を選択します。次に、画像をFM 143色素チャネルに変更し、[分析]、[測定]に移動して蛍光測定値を取得します。同じ NMJ からアンロードされたイメージに対して、これらの手順を繰り返します。

Fluorescent FM 143は、TEMを介して可視化するために、酸化されたDAB電子高密度沈殿物に光変換することができます。これは、FM 143色素の負荷に依存する活動後にショウジョウバエNMJを標識するための写真変換方法の概略図です。これは、野生型の安静時のシナプスブートンの代表的なTEM画像であり、均一なサイズのSVの密集した集団を示しています。

これらの画像は、光変換なしで5分間、またはFM143光変換で高カリウム生理食塩水脱分極で刺激されたシナプスブートンを示しています。ここでは、バルクエンドのホモ構造を観察できます。そして、これらの画像は、光変換なしで、またはFM143光変換で、神経吸引電極で20ヘルツの神経吸引電極で5分間電気的に刺激されたシナプスボタンを示しています。

染料をロードした小胞は、隣接する未負荷の小胞よりもはるかに暗く見えることに注意してください。このビデオを見た後、幼虫の接着剤解剖を行う方法と、高カリウム脱分極、電気刺激、光遺伝学的チャネルロドプシン刺激を使用したFM染料のロードとアンロードを行う方法について十分に理解できるはずです。FM色素がFei-Maoによって最初に合成されて以来、これらの汎用性の高い色素は、クラスリン媒介性エンドサイトーシスとクラスリン媒介性エンドサイトーシスの違いを研究するための、異なる小胞プールの活動依存的な動員の研究、および誘発された自発的およびミニチュアシナプス活動の研究に使用されてきました。

この実験では、考慮すべき多くの要素があります。いくつか例を挙げると、外部カルシウム濃度、使用する刺激方法の種類、および取り込みおよび放出ステップ中にFM色素をロードおよびアンロードする時間。これらの要素を十分に考慮して、ご自身で実験を計画してください。

がんばって！