Name: MRNA およびサル免疫不全ウイルス感染 cd4 表面タンパク質発現の単一細胞定量+ T 細胞孤立したアカゲザルから (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: 学ぶ単一細胞でのmRNAおよび表面タンパク質定量法。SIV感染アカゲザルCD4+T細胞を用いて、宿主と病原体の相互作用を解析し、治療標的の探索に役立つデータを提供します。

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著者は NIAID VRC 流れ Cytometry コアと FACS 器具及び分別装置のメンテナンスおよび操作のための MHRP 流れ Cytometry 中核施設を感謝したいです。マリア ・ モンテロ、Vishakha シャルマ、開明歌の専門テクニカル サポート;マイケル ・ Piatak ・ ジュニア (故人) については SIV の qPCR の試金のデザイン。ブランドン メルディと SIV のマシュー Scarlotta 分離シーケンス。見解はこれらの者、米国陸軍や国防総省の位置を表す解釈すべきではないです。研究動物福祉法その他の連邦法と動物に関する規制に準拠して AAALAC 認定施設における動物の使用を承認されたプロトコルの下で実施された実験含む動物と原則を遵守してケアと NRC 文書実験動物使用の 2011 年版のためのガイドに記載されています。

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<li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Med. 9 (1), 75(2017).</li>
</ol>

この仕事は、軍事医学の進歩, inc. のヘンリー ・ m ・ ジャクソン財団と米国国防総省 (DOD) の間の協力協定 (W81XWH-07-2-0067) によって支えられました。見解はこれらの者、米国陸軍や国防総省の位置を表す解釈すべきではないです。研究動物福祉法その他の連邦法と動物に関する規制に準拠して AAALACi 認定施設における動物の使用を承認されたプロトコルの下で実施された実験含む動物と原則を遵守してケアと NRC 文書実験動物使用の 2011 年版のためのガイドに記載されています。

プロトコルは、ここで説明、tSCEPTRE と呼ばれる、高多重 RT qPCR による単一細胞 mRNA の発現を定量的に多項目フローサイトメトリーによる単一細胞表面タンパク質定量を統合します。これら 2 つのテクノロジの連合有効高コンテンツ スナップショットを組み合わせて転写および高スループット形式で単一のセルの蛋白質のプロファイルにします。我々 はこれまでとらえどころのない細胞を生体内SIV、感染を識別するためにメソッドを使用し、発現宿主遺伝子およびタンパク質について説明。プロトコルは表面蛋白、mRNA、またはそれらの組み合わせの式によって区別可能な関心の任意の細胞集団の研究に適応することができます。説明の方法は正確な単一セルの並べ替えに依存とフローサイトメトリーによる記録データ市販 qPCR 試薬とペアになって、リアルタイム PCR のインストルメンテーションを多重化します。出力は単一セル結合タンパク質と遺伝子発現データの機密、定量的な評価です。
単一細胞におけるタンパク質と遺伝子発現のリンク他のアプローチがされている1<...

多くの細胞内の病原体は頻繁にホスト細胞生物学を変更すること、または伝播の彼らのチャンスを最大化するために宿主細胞の非常に特定の集団を対象と、レプリケートする宿主の細胞機構に依存します。その結果、細胞生物学的プロセスがホストの全体的な健康に有害な影響をよく破壊され。ウイルス、複製する、ホスト細胞間の相互作用を理解することは感染を防ぐために改良された治療法と戦略の開発に役立つ可能性があります病気のメカニズムを解明します。宿主-病原体相互作用の研究を可能にする直接の分析ツールこの年末に向けて不可欠です。単一細胞解析は、明確に特定の遺伝子または感染状態1に細胞の表現型を属性する唯一の手段を提供します。たとえば、病原性感染症はよくホスト細胞の直接と間接の両方の変化を誘発します。したがって、よう一般化感染していない相手からの感染細胞は直接感染する二次的影響属性ホスト セルの変更に必要な区別する炎症。また、SIV とヒト免疫不全ウイルス (HIV) のような多くの病原体を早く、遅く、ホスト細胞への感染のように複数の段階を進行または潜在的なそれぞれの特徴付けることができる個別の遺伝子、タンパク質発現プロファイル2で,3,4,5. 細胞の混合物の分析がこの不均質性6をキャプチャに失敗します。対照的に、両方のウイルスの発現を定量化することができる単一細胞解析の高多重し、宿主遺伝子が感染の段階でバリエーションを含む感染特異的細胞摂動を解決する手段を提供します。さらに、ホスト病原体の相互作用を生理学的分析関連する設定は、感染した生物で発生するイベントを識別するために重要です。したがって前のヴィヴォ、生体内で最高の可能性が高いキャプチャ直接適用できるメソッドを処理します。
SIV と HIV は、CD4 をターゲット+ T 細胞レセプターの抗原提示分子感染を確立し、免疫監視7、8を避けるためとホスト抗ウイルス「制限」の要因に対抗します。 9,10,11。治療せずに、感染は CD4 の大規模な損失の結果最終的に+ T 細胞免疫不全症候群 (AIDS)12を取得で最高潮に達する。抗レトロ ウイルス療法の設定、潜伏感染細胞の貯蔵所は、何十年も治療戦略に手強い障壁をポーズ保持されます。SIV 感染細胞の生体内での特性を理解病因と永続化に尽力のホスト細胞機能を明らかにする可能性があります。ただし、これは非常に挑戦して、感染した細胞のユーザヘとそれらを簡単に識別することができる試薬の不足のために主に。ウイルスの RNA を転写細胞は 0.01-1 に存在すると推定される CD4 の %+ T 細胞血液とリンパ組織13,14,15。抑制療法下で潜伏感染細胞は 10-3– 10-7 16,17,18より頻繁に。体外感染細胞内のギャグなどを学ぶためによく働く、背景は 0.01-0.1 染色による最適な試金のウイルス蛋白質の汚損 %、感染細胞13、周波数以上のよう 14。よ特徴付けられた SIV/HIV Env-特異的モノクローナル抗体を使用して Env 蛋白質の表面の汚損は、おそらく同様の理由から困難であること実証されています。最近では、新規ツールをいずれかでギャグを発現する細胞の検出率の向上目指すギャグ RNA または代替イメージング技術14,15,19を使用して特定の試金を組み込みます。しかし、このようなアプローチは限られている残る量的測定値の数で各セルに対して実行されます。
ここでは、(1)前のヴィヴォ特異的かつ高感度のウイルス遺伝子定量 qPCR、(2) 感染ごとに最大 18 の表面タンパク質および 96 の遺伝子の発現を定量化直接単一のウイルスに感染した細胞を識別する方法論について述べる (感染していない) のセルです。この方法論を組み合わせた即時セル換散によって続いて FACS による単一細胞表面タンパク質測定および Biomark システムにターゲットを絞った qPCR を多重遺伝子発現解析を使用しています。集積流体回路 (IFC) 技術は、9,216 室個別 qPCR 反応が実行されますのマトリックスによって達成、96 のサンプルから 96 遺伝子の多重化の定量を同時にできます。すぐに実行全体のトランスクリプトーム解析を維持しながら高蛋白質豊富な測定を記録ライブ セル FACS 並べ替え下流。ウイルスに感染した細胞を識別するための代わりにスプライシングと, ウイルス Rna (vRNA) 特定のアッセイまで 96 遺伝子で現在収容される試金の最大数の合計ユーザー定義アッセイのパネルと一緒に、qPCR 解析に含まれています。IFC。遺伝子発現とタンパク質情報を各セルには、よく位置によってリンクされています。我々 は以前20をこの分析結果を報告しました。ここで、SIV に感染した CD4 のさらにわかりやすい表現と同様に、方法論のガイドラインの詳細を提供+ T 細胞。
TSCEPTRE 長期的なこのアプローチは、蛍光に分類された抗体とトランスクリプトーム利用 qPCR アッセイと互換性を表現に反応の任意の実行可能なセル人口の懸濁液に適用できます。たとえば、差動遺伝子と希少な細胞または細胞表面蛋白質のマーカーによって簡単に区別の蛋白質の表現の特性評価に使用できます。サンプル調製は、市販の抗体を用いてのプロトコルを汚す標準に依存します。単一セルの並べ替え機能を備えた Cytometers も、市販されているが、追加安全予防策が感染細胞を処理するため必要。称するよく位置によって各セルの単細胞タンパク質の発現プロファイルを記録の並べ替え、インデックスとしては市販 FACS 選別ソフトウェアの一般的な機能です。興味の細胞集団間発現宿主遺伝子の解析はここでは、説明しませんが、参照は、以前に発行されたメソッドに提供されます。

<table><tbody><tr><td> RNA 抽出および PCR 試薬および消耗品 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Genemate 96-well Semi-Skirted PCR Plate </td><td> BioExpress/VWR </td><td> T-3060-1 </td><td></td></tr><tr><td> adhesive PCR Plate Seals </td><td> ThermoFisher </td><td> AB0558 </td><td></td></tr><tr><td> Armadillo 384ウェルPCRプレート </td><td> ThermoFisher </td><td> AB2384 </td><td></td></tr><tr><td> MicroAmp 光学接着フィルム </td><td> Applied Biosystems/ThermoFisher </td><td> 4311971 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC Water </td><td> Quality Biological </td><td> 351-068-101 </td><td></td></tr><tr><td> ガラス蒸留水 </td><td> Teknova </td><td> W3345 </td><td></td></tr><tr><td> Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit </td><td> Invitrogen/ThermoFisher </td><td> 11732088 </td><td></td></tr><tr><td> SUPERase-In Rnase Inhibitor </td><td> Invitrogen/ThermoFisher </td><td> AM2696 </td><td></td></tr><tr><td> Platinum Taq </td><td> Invitrogen/ThermoFisher </td><td> 10966034 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> Invitrogen/ThermoFisher </td><td> 18427088 </td><td></td></tr><tr><td> ROX Reference Dye(キットから分離している場合) </td><td> Invitrogen/ThermoFisher </td><td> 12223012</td><td></td></tr><tr><td> DNA 懸濁液バッファー </td><td> Teknova </td><td> T0223 </td><td></td></tr><tr><td> RNAqueous kit </td><td> Invitrogen/ThermoFisher </td><td> AM1931 </td><td></td></tr><tr><td> 表 2 </td><td></td><td></td><td></td><>p に記載されていない TaqMan 遺伝子発現アッセイ</tr><tr><td>CD6 </td><td> Applied Biosystems/ThermoFisher </td><td> Hs00198752_m1 </td><td></td></tr><tr><td> TLR3 </td><td> Applied Biosystems/ThermoFisher </td><td> Hs1551078_m1 </td><td></td></tr><tr><td> Biomark reagents </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Control Line Fluid Kit<td> > Fluidigm< </td><td> p>89000021 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Universal PCR Mix </td><td> Applied Biosystems/ThermoFisher </td><td> 4304437 </td><td></td></tr><tr><td> Assay Loading Reagent </td><td> Fluidigm </td><td> 85000736 </td><td></td></tr><tr><td> Sample Loading Reagent </td><td> Fluidigm </td><td> 85000735 </td><td></td></tr><tr><td> Dynamic Array 96.96 (chip) </td><td> Fluidigm </td><td> BMK-M-96.96 </td><td></td></tr><tr><td> FACS reagents </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> SPHERO COMPtrol ヤギ抗マウス(ラムダ) </td><td> Spherotech Inc. </td><td> CMIgP-30-5H </td><td></td></tr><tr><td> CompBeads 抗マウスIg,k </td><td> BD Biosciences </td><td> 51-90-9001229 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml ポリスチレンチューブ ストレーナーキャップ付き </td><td> FALCON </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> Aqua Live/Dead stain </td><td> Invitrogen/ThermoFisher </td><td> L34976 </td><td> dilute 1:800 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 563916 </td><td> dilute 1:40 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200 </td><td> BD Biosciences </td><td> 563914 </td><td>希釈 1:20 </td></tr><tr><td> マウス 抗ヒト CD8 BUV496 クローン RPA-T8 </td><td> BD Biosciences </td><td> 564804 </td><td> dilute 1:10 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2 </td><td> Biolegend </td><td> 302948 </td><td> dilute 1:20 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 564710 </td><td> dilute 1:10 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2 </td><td> Biolegend </td><td> 301842 </td><td> dilute 1:83 </td></tr><tr><td> Mouse抗ヒト CD16 BV510 クローン 3G8 </td><td> Biolegend </td><td> 302048 </td><td> dilute 1:167 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7 </td><td> Biolegend </td><td> 302340 </td><td> dilute 1:37 </td></tr><tr><td> Anti-CD38-R PE clone OKT10< </td><td>p>NHP 試薬回収 </td><td> N/A < </td><td> p>希釈 1:100 </td></tr><tr><td> マウス 抗ヒト CD69 BUV395 クローン FN50 </td><td> BD Biosciences </td><td> 564364 </td><td> dilute 1:10 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6 </td><td> BDBiosciences </td><td> 561358 </td><td> dilute 1:20 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A </td><td> Biolegend </td><td> 313528 </td><td> dilute 1:80 </td></tr><tr><td> Instruments </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> BioPrptect Containment Enclosure </td><td> Baker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Aria </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ProtoFlex Dual 96-well PCR system </td><td> Applied Biosystems/ThermoFisher </td><td> 4484076 </td><td></td></tr><tr><td> Quant Studio 6 qPCR 装置 </td><td> Applied Biosystems/ThermoFisher </td><td> 4485694 </td><td></td></tr><tr><td> IFC コントローラー HX </td><td> Fluidigm </td><td> IFC-HX </td><td></td></tr><tr><td> Biomark HD </td><td> Fluidigm </td><td> BMKHD-BMKHD </td><td></td></tr></tbody></table>

mrna およびサル免疫不全ウイルス感染 cd4 表面タンパク質発現の単一細胞定量+ t 細胞孤立したアカゲザルから

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

単一細胞解析は、細胞の異種個体集団を解剖するための重要なツールです。同定や希少細胞の分離は困難することができます。このような課題を克服するためにインデックス付き cytometry 流れの手法の組み合わせと高スループット多重量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) を開発しました。目的は、識別し、特徴付けるサル免疫不全ウイルス (SIV)-感染細胞アカゲザル内に存在します。多次元のプロファイルを作成するホスト遺伝子および蛋白測定と組み合わせてウイルスの遺伝子によって識別がウイルス感染細胞表面タンパク質蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えると qPCR による mRNA の定量を.アプローチ、対象の単一細胞タンパク質転写評価または tSCEPTRE と呼びます。メソッドを実行するには、実行可能なセルは細胞サブセットおよび/または下流の表現型解析の FACS 分離に使用される表面マーカーの特定蛍光抗体で染色が。単一のセルは即時換散、多重の逆のトランスクリプション (RT)、pcr 前、最大 96 の転写産物の高スループット qPCR の順で並べ替えられます。FACS 測定選別の時に記録、その後結合蛋白質と転写プロファイルを作成するよく位置によって遺伝子発現データにリンクします。Ex vivoセル直接 SIV 感染を研究するのには、セルが複数のウイルス RNA 種の qPCR の検出によって識別されました。それぞれの量とウイルスの転写産物の組み合わせ (例えば、非生産性対生産的な) ウイルスのライフ サイクルの異なる段階に細胞を分類するためのフレームワークを提供します。また、SIV+細胞の tSCEPTRE に比べて感染していない細胞発現宿主遺伝子とタンパク質を評価する同じ標本から分離したしていた。分析では、感染細胞だけでなく体内の SIV を介した転写後遺伝子発現制御単一セルの解像度の以前功績のウイルス RNA 式異質性を明らかにしました。TSCEPTRE メソッドは表面蛋白質のマーカー、ホストまたは病原体の遺伝子、またはこれらの組み合わせの式による識別に従う任意のセルの人口の分析のため。

プロトコル全体のワークフローは、図 1に描かれています。細胞の数によって定義された 2 つのバリエーションで構成されています: いずれかの制限の希釈または単一のセル、テキストで説明されているようです。2 倍シリアル RNA 希釈プライマー プローブ資格解析の例を図 2に示します。SIV+の潜在的な細胞を識別するためにゲートの戦略を図 3に示します。ハウスキーピング遺伝子GAPDH限界希釈における細胞の FACS ソートのため、最適ではない成功と失敗の品質管理 qPCR は図 4のとおりです。単一セル量的遺伝子の発現 4 SIV RNA 種およびリーサス サル感染細胞で発現したことは、図 5のとおりです。代表二変量、ヒストグラム、および散布...

96 遺伝子の発現を量的に方法論が説明し、単一セルがex vivo、差動の同定を可能にする 18 の表面タンパク質は感染していない細胞を基準にしてウイルスに感染した細胞の遺伝子そして蛋白質を表明しました。+ T 研究 SIV 感染 CD4 にアプローチを適用アカゲザルから分離した細胞。

MRNA およびサル免疫不全ウイルス感染 cd4 表面タンパク質発現の単一細胞定量+ T 細胞孤立したアカゲザルから

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

この方法は、生産的に感染した細胞のユニークな特性は何か、ウイルスが生産的な感染を確立することを可能にする宿主補因子、および治療介入においてこれらの細胞を標的にする方法など、宿主と病原体の相互作用の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、単一細胞内のタンパク質とmRNAの両方に定量的な対策を提供し、ほとんどの試薬が市販されている点です。細胞選別手順を実証するのは、マイケル・エラー博士の研究室のフローサイトメトリーコアの上級技術者、マシュー・クリーガンです。まず、指定されたPCR前分子生物学ワークステーションで、96個の遺伝子発現アッセイをRNaseに組み合わせてアッセイミックスを準備し、DNaseフリーチューブは、各アッセイをフォワードおよびリバースプライマーの最終濃度180ナノモルに追加することを確認します。DNA懸濁液バッファーを追加して、アッセイミックスの適切な希釈を達成する。予想される各96個の96チップアレイについて、各アッセイのピペット6マイクロリットルを96ウェルPCRプレートの指定ウェルに入れ、その後、接着剤でプレートを密封します。生細胞の表面染色を開始するには、組織培養バイオセーフティキャビネットで、まず、テキストプロトコルで概説されているように、補償サンプルと蛍光抗体カクテルのマスターミックスを調製する。37°Cの水浴で凍結保存された細胞を2分間解凍します。この後、12ミリリットルのPBSを含む15ミリリットルのチューブに細胞懸濁液の5〜2ミリリットルを加える。500 Gで摂氏25度で3分間遠心分離し、PBSを吸引し、新鮮なPBSの3ミリリットルでペレットを再懸濁する。この混合物を5ミリリットルポリスチレンチューブに移します。25°Cで3分間500Gで再び遠心分離機。上清を吸引し、約10マイクロリットルの残留PBSを残す。次に、80マイクロリットルの抗体カクテルで最大2,000万個の洗浄細胞を再懸濁します。光から保護しながら、摂氏25度で20分間インキュベートします。この後、PBSを3ミリリットル加えます。500Gで遠心分離機を3分間、上清を吸引する。PBSの300〜500マイクロリットルで細胞を徹底的に再懸濁します。35マイクロメートルのナイロンセルストレーナーキャップを通してピペット処理して、この溶液をフィルター処理します。その後、氷の上に細胞を維持し、並べ替えまで光から保護します。プリPCRワークステーションに戻って、テキストプロトコルで概説されているように、最初にRT preAMP反応ミックスを単一のRNase、DNaseフリー滅菌チューブで準備します。マルチチャンネルピペットを使用して、この反応ミックスの10マイクロリットルを所望の96ウェルPCRソートコレクションプレートに分配します。粘着フィルムでプレートを密封し、プレートをあらかじめ冷やした96ウェルアルミニウムブロックの上に置きます。その後、セルソートの採座方式を確立し、テキストプロトコルで概説されているようにフローサイトメトリクスセルソーターを準備します。適切な計器設定を入力して、各ウェルにソートするセルの数とサブセットを指定します。接着シールを取り外し、FACSは、調製した96ウェルPCRコレクションプレートに細胞をソートします。新鮮な粘着フィルムでプレートを再シールします。すぐに再密封されたプレートを渦巻き、2000 Gで遠心分離機を摂氏4度で1分間回転させます。PCRマシンでプレートをサーモサイクルし、予熱蓋を50°Cで15分間加熱し、続いて摂氏95度を2分間加熱します。最後に、摂氏95度の18サイクルのサーモサイクルを15秒間、摂氏60度で4分間、PCR後のワークステーションで、新しい96ウェルPCRプレートで5マイクロリットルのcDNAをDNA懸濁液バッファーの20マイクロリットルに移します。まず、各ウェルに4マイクロリットルのアッセイローディング試薬をピペット処理してqPCRアッセイプレートを調製します。次に、各アッセイの4マイクロリットルを2XアッセイプレートからqPCRプレートに移します。qPCRアッセイプレートを摂氏4度に保つ。プライミングシリンジからチップの2つの取り込み弁に制御ラインの流体を分配します。プレートの下から保護プラスチックを取り外します。チップを IfC コントローラの A1 位置に切り込んだ位置に置き、主スクリプトを選択して実行します。マイクロ流体チップごとに、サンプルローディング試薬の50マイクロリットルをPCRマスターミックスの500マイクロリットルと混合し、リアルタイム反応ミックスを調製します。この反応のピペット4.4マイクロリットルは、サンプルプレートとして指定された新しい96ウェルPCRプレートの各ウェルに混合します。次に、前に希釈したcDNAのピペット3.6マイクロリットルを、サンプルプレートの全ウェルに入れた。この後、チップのノッチ側にある対応するウェルにアッセイプレートから5マイクロリットルを移します。サンプルプレートからチップの反対側の対応するウェルに5マイクロリットルを移します。IFC コントローラに搭載されたチップを挿入し、ロード ミックス スクリプトを実行します。次に、チップをBioMarkプラットフォームに転送し、テキストプロトコルで概説されているように機器を設定し、チップ実行ファイルを指定されたフォルダに保存します。チップの実行が完了したら、リアルタイム PCR 解析ソフトウェアを開き、ファイルを選択して開き、チップランを開きます。bml ファイル。ソフトウェアウィンドウの左上隅で、チップエクスプローラとチップ実行サマリーを見つけます。[チップの実行の概要] で、ディテクタの設定をクリックします。[タスク] で[新規]をクリックし、コンテナタイプ SBS プレートとコンテナフォーマット SBS 96 を選択します。マッピングの横に省略記号が付いたボタンをクリックし、M96-アッセイ-SBS96.dspを選択します。解析ビューをクリックします。タスクの下の qPCR タブで、ユーザー検出器の線形誘導体および CT しきい値方式のベースライン補正を選択します。[CT しきい値] タブで、[自動で初期化] ボックスをオンにし、[分析] ボタンをクリックします。分析ビューの右上の領域で、2 番目のタブの結果表をクリックします。ドロップダウン メニューから [ヒート マップ] ビューを選択すると、データを含むヒート マップが表示されます。ヒート マップの下で、[しきい値とログ グラフ] をクリックします。ヒートマップ上の列で表されるアッセイをクリックし、必要に応じてしきい値をドラッグして指数位相の増幅曲線を交差させることで、検出器ごとに手動でCT閾値を調整します。完了したら、[分析] をクリックします。次に、qPCR データを csv ファイルとしてエクスポートします。QPCR データを BioMark コンピュータからデスクトップに転送します。データをスプレッドシートまたは統計解析ソフトウェアにインポートし、チップ上のサンプルとアッセイ位置で結果をマッピングします。新しい列を作成し、条件式を使用して、ウイルス遺伝子の発現に基づいて細胞をグループに編成します。[解析] で、[X によるフィット Y] を選択し、遺伝子発現対グループをプロットします。この後、FlowJo バージョン 9 を使用して、96 ウェル プレートに対応する FACS ソートから FCS ファイルを開きます。ファイル名を強調表示して、プラットフォーム、イベント番号ゲートを選択し、インデックス付きソートゲートを作成します。個々のセルが行ごとに表示されます。96 個のセルをすべてハイライト表示し、ワークスペースを選択し、エクスポートして、補償された床をすべて選択します。[データ] の下で [FCS ファイル] を選択し、[エクスポート] をクリックして、指定したフォルダを選択します。個々のセルの新しい FCS ファイルを新しい FlowJo ワークスペースにドラッグします。すべてのセルをハイライト表示し、シグマボタン、平均、およびすべての蛍光パラメータで表される統計を追加をクリックします。テーブルエディタを開き、最初のセルのすべての床をハイライト表示し、テーブルエディタウィンドウにドラッグします。このウィンドウで、[テーブルの作成と表示] をクリックします。その後、コピー貼り付けまたは保存してアプリケーションを起動ボタンをクリックして、統計ソフトウェアにコピーして出力します。単一セルFACSデータをJMPのqPCRデータと組み合わせ、プレート番号とウェル位置で行います。最後に、結合されたデータに対して、グラフィカルおよび統計分析を実行します。本研究では、マルチパラメータフローサイトメトリーによる単一細胞表面タンパク質定量は、高多重化されたRTqPCRによる定量的単一細胞mRNA発現と統合されている。ここに示されているのは、FACSから単一細胞定量的ウイルス遺伝子発現が、アカゲザルCD4陽性T細胞を選別した。陰性細胞のTat/rev陽性Nは、安定前の感染の初期段階および部分的にスプライスされたウイルスRNAの核輸出と一致する濃緑色の陽性細胞のNよりもタット/rev RNAのコピーが少ない。正の細胞のtat/rev陽性NにおけるスプライシングされていないGag-RNAの豊富な存在は、豊富なゲノムRNAが発現し、出芽ビリオンにパッケージ化される後期生産感染と一致する。この三変量プロットは、単一細胞ウイルス遺伝子、宿主遺伝子、および宿主表面タンパク質発現を示すプロットは、CD4およびCD3転写産物が持続しているにもかかわらず緑色で示されるtat/rev陽性細胞において表面CD4およびCD3タンパク質発現が減少することを示している。一度習得すると、この技術は2〜3日で行うことができます。このビデオを見た後、ウイルス感染細胞の遺伝子とタンパク質の異例発現に関する質問に対処するために、標的単一細胞原転写評価を行う方法をよく理解する必要があります。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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MRNA およびサル免疫不全ウイルス感染 cd4 表面タンパク質発現の単一細胞定量⁺ T 細胞孤立したアカゲザルから

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