無菌状態で小さな分子に対する植物の反応を評価するための柔軟な低コスト化の養液栽培システム

シンプルで汎用性が高く、低コストのin vitro水耕栽培システムの最適化に成功し、無菌条件下での大規模な実験が可能になりました。このシステムは、溶液中の化学物質の適用と、分子、生化学的、および生理学的研究のための根によるそれらの効率的な吸収を容易にします。このシステムは、初期発生時に均質な実生を得るだけでなく、シロイヌナズナの種子を用いて根と新芽を分離するのに非常に効率的であることを示しました。

水耕栽培システムを構築し、無菌の管理された条件下で植物を栽培するために必要なアイテムは、7%エタノール、10%漂白剤溶液、ポリソルベート20、ビタミンを含むMS培地です。MES一水和物、寒天、水酸化カリウム。

層流フード、ホットプレート、成長チャンバー。使い捨てプラスチックボックス、滅菌ガラスペトリ皿、粘着テープ、滅菌200および300マイクロリットルのピペットチップ、はさみ、300マイクロリットルのマルチチャンネルピペット、200マイクロリットルのピペット、メスブレード、ピンセット、および200マイクロリットルのピペットチップラック。ピペットの先端が平らになっているには、固体培地を充填する領域があることが重要です。

オートクレーブ内のミニタンクとして使用されるカバーなしのピペットチップラックを121度で20分間滅菌します。汚染を避けるために、前述のすべての材料はオートクレーブで滅菌されました。これが不可能な場合、使い捨てのプラスチックボックスの場合のように、材料は層流フードに入る前に7%エタノールで洗浄されました。

フードが許せば、水耕栽培システムを組み立てる前に10分間UVライトをオンにすることができます。ピペットチップの上面を粘着テープで平らにシールします。可能であれば、10分間UVライトの下に置いてください。

次に、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに108マイクロリットルの溶融固体培地を追加します。多数のタンクを調製する場合は、MS培地が固まらないようにホットプレートを使用してください。培地が完全に固まるまで約30分待ちます。

固化期間中は、UVライトを点灯させることができます。チップボックスに液体培地を完全に満たします。固体媒体と液体媒体の間の密集性を保証します。

ピペットチップの上面から粘着テープを平らに剥がし、ラックに慎重にはめ込みます。水耕栽培システムは、滅菌された種子を受け取る準備ができました。ここで説明する液体漂白剤の殺菌は、種子を殺菌するための実用的な方法です。

拳、500シロイヌナズナの種子を1.5mlのマイクロチューブに入れます。マイクロチューブは、実験に必要な植物の数に応じて、必要な数だけ使用してください。種子を7%エタノールで2分間攪拌しながら洗浄します。

エタノールを慎重に取り除きます。2マイクロリットルのポリソルベート20洗剤を含む10%漂白剤溶液1mlを加えます。5分間撹拌します。

溶液を慎重に取り出します。最後に、すべての漂白剤残留物が完全に除去されるまで、約5回、滅菌した蒸留水で種子をすすぎます。このプロトコルはシロイヌナズナに対して実行可能ですが、このシステムは他の植物種にも使用できます。

この目的のために、前記滅菌手順は、種の要件に従って変更されるべきである。表面滅菌後、種子を滅菌蒸留水に浸し、暗所で5日間4度で成層化して発芽を同期させました。滅菌メスの助けを借りて、200マイクロリットルのピペットチップの先端をわずかに切ります。

シロイヌナズナの種子をピペットチップの上面にある固体培地にピペットで移します。培地が平らから緩まないように注意してください、さもなければ種子は日陰になり、苗は適切に成長しません。使い捨てのプラスチックボックス内にできるだけ多くのミニタンクを保管して、高湿度と微生物のない環境を維持します。

使い捨てのプラスチックボックスを粘着テープで密封します。これで、水耕栽培システムが成長チャンバーに入る準備が整いました。この水耕栽培システムは当初、同位体標識化合物などの植物への化学物質の投与を容易にするために開発されましたが、これは一般に大規模な実験に適用するには非常に高価です。

概念実証として、標的ラパマイシンプロテインキナーゼのATP結合部位を特異的に標的とするATP競合阻害剤AZD8055を使用しました。TORキナーゼは、栄養素のセンシングとエネルギーシグナル伝達を統合して細胞の増殖と増殖を促進する主要な調節因子です。AZDによって媒介されるTOR阻害の主要な応答を評価するために、シロイヌナズナの種子を12時間の写真期間の下で所望の発達段階まで水耕栽培した。

コントロールとして 2 マイクロモルの AZD または 0.05% DMSO を含む新しい培地を、夜の終わりに水耕栽培タンクで交換しました。処理後、苗木を異なる時期に収穫し、液体窒素で凍結した根と新芽に分離し、微粉末に粉砕し、使用するまでマイナス80度で保存しました。TOR経路のよく知られた標的の1つであるリボソームタンパク質S6キナーゼ、RPS6のリン酸化パターン。

イムノブロッティングは、根、グラフA、およびシュート、グラフB.の存在下でのリン酸化の抑制は、薬物治療後30分という早い時期に根とシュートの両方で発生し、使用された実験条件下で、ADZはそのキナーゼ活性を急速に抑制する強力なTOR阻害剤であることも示しています。TOR遺伝子またはTOR複合体の成分の発現が低下したトランスジェニックシロイヌナズナ株は、明確なデンプン過剰表現型を示す。ルゴール溶液を用いたデンプンの定性分析により、サイクル中のデンプンの蓄積と劣化の予想されるパターンが明らかになります。

MSOまたはAZD855の適用を受けなかった苗木は、夜の終わりに葉にデンプンの蓄積が大きくなることは示さず、対照植物であるMSOでのデンプンの蓄積は文献と一致していました。さらに、AZDで処理された植物は、対照の苗と比較して、夜の終わりにより多くの残留デンプンを示しました。これらの結果は、生理学的条件を模倣した苗の成長における提案された水耕栽培システムの有用性を示しています。

でんぷんは日中は葉に蓄積し、代謝活動を維持するために夜通しで再動員されます。通常の条件下では、一日の終わりに総量の5〜10%のデンプンのごく一部だけが夜の終わりに残ります。これらの結果は、TOR抑制下で観察されたデンプン表現型がサイクル全体で発生することがテストされています。

水耕栽培された植物を、図5-Aに示すアブシジン酸の発現レベルに関して非常に類似した気候条件下で園芸基質を成長させる苗木と比較した。ABF3の発現は、複数の非生物的ストレス反応におけるその役割のためにマーカーとして広く知られているホルモンのクラスである内部ABAレベルと直接相関しています。水耕栽培された植物は、土壌で栽培された植物と比較してABF3発現の有意な増加を示しましたが、アスパラギン合成酵素1ASN1の発現レベルは、図5-Bに示すMSOまたはAZD処理の影響を受けませんでした。

しかし、トレハロースリン酸シンターゼ5、TPS5の発現は、TOR抑制の8時間後に有意に増加します。ASN1とTPS5は、それぞれ低糖値と高糖値に反応し、これらの植物が遺伝的ストレスを経験しなかったことが示唆されています。このシステムを使用して、植物への低分子の応用を評価することに成功しました。

要約すると、この水耕栽培システムは、組み立てが非常に速く、簡単に、主要コンポーネントが安価で、広く再利用できるため、低コストであるため、多くの利点があります。さらに、このシステムは汎用性が高く、無傷の苗木や植物の発育に沿った区別の研究を可能にし、非常にスケーラブルであるため、非常に小さなエリアで膨大な数の植物を栽培できます。