Hsp33 の酸化還元規制シャペロン活性を定義および水素重水素交換質量分析法による Hsp33 の構造変化をマッピング

ここで紹介するワークフローは、酸化ストレス状態におけるシャペロンの細胞の役割についての理解を深めるのに役立ちます。具体的には、シャペロンがアンフォールディング条件でタンパク質の凝集をどのように防ぐかを理解するのに役立ちます。異なる技術のこれらの2つのバックは、フラグ分離付きシャペロンの活動への洞察を提供します。

また、酵素の社会的相互作用やタンパク質のダイナミクスなど、他のタンパク質の相互作用の研究にも使用できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、新しいユーザーにとっては難しいかもしれないさまざまな機器の使用を伴うため、非常に重要です。まず、以前に解凍したタンパク質サンプルをスピンダウンして凝集体を除去します。

次に、5ミリモルのDTTと20マイクロモルの塩化亜鉛を加え、サンプルを摂氏37度で少なくとも1.5時間インキュベートします。DTTを除去するには、40ミリモルのリン酸カリウムバッファーで脱塩カラムを平衡化し、カラムをバッファーで完全に充填し、滴下させます。ピンセットを使用して、カラムの白いディスクフィルターをそっと押し下げて取り外します。

カラムにリン酸カリウム緩衝液を補充し、Gの1000倍で3分間遠心分離します。遠心分離後、カラムをきれいなチューブに移し、タンパク質サンプルをカラムの中央にゆっくりと加えます。カラムを G の 1000 倍で 2 分間遠心分離し、DTT フリータンパク質がフロースルー中になるようにします。

次に、タンパク質濃度を確認し、280ナノメートルでその吸光度を測定します。タンパク質サンプルの半分をアリコートに分配します。酸素を完全に除去するために、嫌気性条件下でアリコートを20分間インキュベートします。

次に、チューブをプラスチックフィルムで密封し、サンプルを低温条件下で保管します。次に、新たに調製した5ミリモルの過酸化水素を残りのタンパク質サンプルに加え、振とうしながら摂氏40度で3時間インキュベートします。遠心分離後、タンパク質濃度を確認し、酸化したタンパク質をアリコートに分割して低温条件下で保存します。

12マイクロモルのクエン酸シンターゼを40ミリモルのHEPESと4.5モルの塩化グアニジンに一晩インキュベートして、変性基質を調製します。翌日、蛍光分光計ソフトウェアを開き、タイムコース測定に進みます。励起帯域幅を 2.5 ナノメートルに設定します。

励起波長は360ナノメートルまで。発光波長は360ナノメートルまで。5ナノメートルまでの発光帯域幅。

そして、データ間隔は0.5秒です。温度を摂氏25度に設定します。1600マイクロリットルの40ミリモルHEPESを石英キュベットに追加してサンプルを準備します。

キュベットを蛍光分光計のサンプルホルダーに挿入し、サンプルを目的の温度に到達させます。攪拌を600rpmに設定した後、ベースラインが確立されるまで測定を開始します。シャペロンがない場合にクエン酸シンターゼの凝集を測定するには、10マイクロリットルの変性クエン酸シンテターゼを測定に120秒追加します。

その後、測定を1200秒間続けます。Hsp33の存在下でクエン酸シンターゼ凝集を測定するには、Hsp33を60秒で測定します。さらに60秒後、変性クエン酸シンテターゼ10マイクロリットルを加え、1200秒間測定を続けます。

次に、データファイルをアップロードして、Kfitsによるデータ解析とノイズ除去を行います。ノイズを除去するには、解析パラメーターを選択し、自動最適モデルを使用し、ノイズが常に信号より上にあることを選択します。緑と赤の調整可能なラインを使用して、明らかな外れ値を手動で削除し、緑のラインの上と赤のラインの下のノイズをフィルタリングします。

これに続いて、ベースラインとフィット曲線を設定します。ノイズしきい値を適用した後、処理したデータをダウンロードします。クエン酸シンテターゼをHsp33に43°Cで1対1.5の比率で添加することにより、タンパク質基質複合体サンプルを調製します。

少なくとも4つのステップを使用し、添加するたびにサンプルを摂氏43度で15分間インキュベートして、複雑な形成を可能にします。サンプルをGの16000倍、摂氏4度で30分間遠心分離し、凝集体を除去します。次に、サンプルを150マイクロリットルのガラスインサートに入れ、バイアルに移します。

次に、それらを適切なトレイに置きます。バッファーHとDを摂氏25度で保持し、サンプルとクエンチングバッファーを摂氏0〜2度で保持します。次に、質量分析計のすべての冷却ユニットを手動でオンにします。

すべての冷却システムが目標温度に達したら、HPLCポンプとローディングポンプの両方を手動でオンにします。両方のポンプを制御するソフトウェアと質量分析計を制御するソフトウェアを開き、MSがスタンバイ状態にあることを確認します。その後、HPLCアウトレットバルブをMSソースから外します。

最初にシステムをトリプルクリーナー溶液で洗浄します。次に、バッファー B を使用し、最後にバッファー A を使用して、pepsin 列をシステムに挿入します。安定した流れと安定した圧力でシステムを洗浄した後、HPLC出口バルブをMSソースに挿入し、MSをオンにします。

次に、ソフトウェアを開きます。ランニングシーケンスを作成し、トレイ内のすべての時点、サンプル名、位置、およびバッファの名前と位置を入力します。ランが完了したら、ソフトウェアを介して非重水素化コントロールサンプルを実行することにより、サンプルのペプチドカバレッジを分析します。

HDX Workbenchソフトウェアにデータを転送し、ソフトウェアを使用して結果を分析します。選択したペプチドを保存し、重水素取り込みの分析をさらに進めます。化学的変性は、不利な緩衝条件で完全に変性したタンパク質の再フォールディングによって誘発される急速なクエン酸シンテターゼ凝集につながります。

一方、熱誘起凝集は、ネイティブに折り畳まれた基板の比較的ゆっくりとした展開から生じます。どちらの変性形態でも、酸化したHsp33を添加すると凝集が完全になくなり、360ナノメートルの読み取り値が無視できる値に低下しました。還元されたHsp33の存在は、クエン酸シンテターゼの安定性に影響を及ぼさず、シャペロンがない場合に検出されるものと同様の凝集曲線を示しました。

結合したシャペロンHsp33とその基質クエン酸シンテターゼとの間の重水素化パターンは、シャペロンのC末端酸化還元スイッチドメイン内のクライアント相互作用部位を明らかにします。還元型Hsp33は、完全に秩序立った構造をしていますが、酸化ストレスを感知すると機能的になります。還元された結合Hsp33と非結合のHsp33は同様のペプチド曲線を生成しますが、酸化されたHsp33は、結合したシャペロンと非結合のシャペロンとの間に30%の重水素化差を示し、結合タンパク質の特定の領域はアロステリック障害を示しています。

一度確立されると、散乱アッセイは数時間以内に完了し、DHEX法は適切に実施されれば2〜4日で完了します。この手順を試みるときは、事前に計画を立てることが重要です。温度、インキュベーション時間、緩衝液などの条件はタンパク質特異的であり、各タンパク質に対して最適化する必要があることに注意してください。

この手順に従って、シャペロン基質相互作用の研究を補完するために、架橋や沈殿などの他の方法論を実行できます。結論として、この技術は、構造生物学の分野の研究者が分子シャペロンのタンパク質可塑性を探求する道を開きました。