Name: Hsp33 の酸化還元規制シャペロン活性を定義および水素重水素交換質量分析法による Hsp33 の構造変化をマッピング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学ぶ Hsp33の酸化還元規制シャペロン活性とHDX-MSによる構造変化マッピング。酸化ストレス下でのタンパク質凝集防止メカニズムを解明し、分子シャペロンの動的構造変化を可視化する手法を習得できます。

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著者は、彼女の役に立つ議論の Meytal Radzinski に感謝と重要な記事のパトリック ・ グリフィンと彼の研究室のメンバーに HDX 解析プラットフォームを確立している間彼らの無制限の支援のために読んでいます。著者はドイツ-イスラエル財団 (私-2332-1149.9/2012)、二国間科学財団 (2015056)、マリー キュリー統合補助金 (618806)、イスラエル共和国の科学技術振興財団に感謝しています (2629 と 1765/13/16)、人間の新領域創成科学金融支援プログラム (CDA00064/2014 年)。

著者が明らかに何もありません。

本稿で我々 は提供されたプロトコルの酸化還元に依存したシャペロン活性解析やクライアントのタンパク質の結合に伴う構造変化の解析。これらは潜在的なシャペロン-基質複合体を定義し、潜在的な相互作用のサイトを分析する相補的な方法論です。
ここでは、よく研究シャペロン基板 CS レドックス調節のシャペロン Hsp33 の複合体のキャラクタリゼーションのためのこれらのプロトコルを適用されます。2 種類の運動と初期状態の異なるタンパク質集計解析の提案: 化学変性時に基板加熱凝集間変性のフォームからその展開プロセスの開始、基板のネイティブ形式から展開を開始しました。
光散乱測定は、蛋白質の集合の相対量を監視する役に立つツールです。シャペロンのアクティブな状態を確認するこのメソッドを使用して、一般的な集計条件、異なる蛋白質の安定性を比較するまたは不安定変異基板とシャペロンの両方を勉強する勉強するそれにさらに使用できます。
そのシンプルさにもかかわらず光散乱法は外れ値をいくつかのノイズの多い...

細胞が活性酸素種 (ROS) 呼吸1,2タンパク質と脂質の酸化の3、4、および追加のプロセス5の副産物として生産の蓄積を頻繁に遭遇します。 6,7。ROS の細胞シグナリング8,9と免疫応答10など多様な生物学的プロセスに有益な役割にもかかわらず活性酸素産生とその解毒の間の不均衡が生じる、酸化につながる7を強調します。ROS の生物学的ターゲットには、タンパク質、脂質、核酸を酸化、構造と機能に影響を与えるが。したがって、細胞のオキシダントの蓄積が強く癌9,11, 炎症12,13, と高齢化14,を含む病態の多様な範囲にリンクします。15発症し、アルツハイマー病、パーキンソン病のなどの神経変性疾患の進行と ALS 疾患16,17,18に関与することがわかったとします。
新しく合成と成熟の両方のタンパク質は、タンパク質構造と機能19,20を形作る彼らの側鎖の潜在的に有害な変更により酸化に敏感。したがって、酸化ストレスは、通常、広範なタンパク質不活性化、フォールディング、集約、最終的に細胞死につながるに します。クライアントが誤って折りたたまれたタンパク質21 と安定な錯体を形成する代わりに、広範な蛋白質の集合を抑制する酸化還元に依存したシャペロンを利用するタンパク質の酸化損傷の可能性に対処するエレガントな携帯電話戦略の 1 つです。 ,,2223。これらの最初のライン防衛のシャペロンは、強力な抗凝集分子24に変換する (通常のシステイン残基) サイト固有の酸化によって急速にアクティブ化されます。酸化ストレス条件25,26 中に正規の ATP 依存性シャペロンが少ない効果的な酸化ストレスは結果の呼吸阻害と細胞の ATP レベル25の減少で、以来、27。そのため、ATP に依存しない付き添いのレドックス活性化再生細菌や真核生物におけるオキシダント濃度の蓄積に蛋白質の恒常性を維持する上で重要な役割 (例えば、Hsp3328細菌、Get3 ライダー29 30酵母、真核生物の進化: ペルオキシレドキシン31 )。これらのシャペロン活性は強くクライアント誤って折りたたまれたタンパク質の認識に関与する疎水性領域を明らかにするサイト固有の酸化による可逆的構造構造変化に依存します。
抗凝集機構とシャペロンによるクライアント タンパク質の認識を支配する原則の研究はシャペロン基板相互作用32,33のダイナミックなというヘテロな性質のため容易ではないです。 34,35,36,37。ただし、シャペロンの応力規制能力による抗凝集機能の理解を進めるため機会がある: 1) シャペロン、(例えば、酸化) アクティブおよびアクティブでない (例えばの 2 つの異なるフォームを取得削減)、導入または簡単に (例えば、酸化剤と還元剤)、それらの 2 に切り替えのストレス条件の除去で) 3 基板の広い範囲を持っている) によって評価される可能性がありますクライアント蛋白質と非常に安定した複合体を形成異なる構造方法論、及び 4) 基質認識とリリースでは、これらのシャペロンの大半は、折りたたみ機能を欠いている、酸化還元に依存した構造変化を介したを取り上げます。
ここでは、我々 は細菌酸化還元規制シャペロン Hsp33 の抗凝集活性、酸化誘起タンパク質凝集28に対して細菌の防衛システムの重要なコンポーネントを分析します。減少、Hsp33 はシャペロン アクティビティのないしっかりと折りたたまれた亜鉛結合タンパク質です。しかし、酸化ストレスにさらされたとき、Hsp33 は基板結合領域38,39を公開する大規模な構造変化を経る。酸化に強く行きの C 末端ドメインの 4 つの非常に節約されたシステイン残基が亜鉛イオンはリリースされた40です。これは、結果、隣接するリンカーの地域41の不安定化と C 末端ドメインの 2 つのジスルフィド結合の形成。C 末端とリンカーの地域は非常に柔軟な本質的にまたは部分的に障害として定義されています。非ストレス条件に戻り、減少、システイン、シャペロン抗凝集反応のない本来の折り畳まれた状態に戻ります。シャペロンのリフォールディングさらに展開につながり、バインドされたクライアント タンパク質リフォールディング38正規シャペロン システム DnaK/J への転送をトリガーするの不安定化します。Hsp33 の相互作用部位の分析は、Hsp33 を使用して両方をキャプチャするリンカーと N 末端ドメインの疎水性領域と同様、地域にその請求乱れたミスフォールド蛋白質クライアント防ぎ、その集計38,を示唆しています。42。 折り返しリンカー、C 末端ドメインでたたんだ状態でこれらの地域は非表示。興味深いことに、リンカーの地域は、隣接する C 末端ドメイン34の折りたたみの状態を「検出」Hsp33 の折り返しとアクティブでない状態のゲートキーパーとして機能します。(点突然変異または完全なシーケンスの摂動によってどちらか) の突然変異誘発によって不安定になり、一度 Hsp33 はその酸化還元に依存したシステイン43の酸化還元状態に関係なく恒常活性シャペロンに変換されます。
ここに示すプロトコルは、Hsp33 の酸化還元に依存したシャペロン活性と同様のマッピング活性化に伴う構造変化の監視、クライアントのタンパク質の結合を許可します。この方法論は、他のシャペロン クライアント認識モデルだけでなく、非シャペロン タンパク質-タンパク質相互作用を研究する合わせることができます。また、タンパク質酸化蛋白質の活動の潜在的な役割を明らかにする他のスイッチ酸化還元タンパク質の研究で使用ことができます完全に還元と酸化のシャペロンの準備のためのプロトコルを提案する.
具体的には、我々 はシャペロン活性の in vitro監視し、タンパク質凝集 (化学的にまたは熱) による光散乱 (LS) を使用してさまざまな種類の下でその基質特異性を定義するプロシージャを記述する、fluorospectrometer44。集計中に急速に増加の濁度による 360 nm の増加で散乱光。したがって、集計は、この波長での時間依存的に監視できます。LS は蛋白質の集合およびこうしてナノモル濃度では、異なるタンパク質凝集関連運動パラメーターの評価を有効にするを使用して興味の蛋白質の抗凝集活性テスト高速高感度法条件。さらに、ここで説明した LS プロトコルは高価な機器を必要としない、あらゆる研究室で簡単に設立することができます。
それにもかかわらず、「クリーン」の運動曲線を取得し、このような散乱ノイズと外れ値の空気の泡と大きな凝集体によって生成される数が多いため、実験から蛋白質の速度論的パラメーターを取得する非常に困難です。この障害を克服するために提案する新しいグラフィカル ツール、 Kfits45、特に蛋白質凝集反応速度データの装備別の運動測定の騒音レベルを減らすために使用します。このソフトウェアは、結果の初期評価のため予備の速度論的パラメーターを提供し、「クリーンアップ」する大量データの迅速にその動力学的性質に影響を与えることがなくユーザーをことができます。Kfitsは Python で実装されている45のオープン ソースで利用できます。
フィールドで挑戦的な質問の 1 つは、シャペロンとそのクライアントの蛋白質間相互作用部位のマッピングとシャペロンが誤って折りたたまれた基板の広い範囲を認識する方法を理解することに関係します。この問題はさらに複雑なシャペロンと集計しやすい基板上乱れた本質的に関連する非常にダイナミックな膜タンパク質を勉強します。幸いなことに、構造質量の最後の 10 年間で飛躍的に進んだし、有用なアプローチと構造の可塑性を分析してマップ残留タンパク質認識46、に関連するツールを提供してきました47,48,49紹介 1 つこのような技術水素重水素交換質量分析 (HDX-)-タンパク質修飾やタンパク質・ リガンド結合35、構造構造の残留レベル変更のマッピングが可能。 50,51,52,53,,5455。HDX MS 重水素、割合とは、化学環境、アクセシビリティ、受けますがバックボーンの水素の連続的な交換を使用して、共有結合と共有結合56。HDX MS は重水素化溶媒、一般的重水 (D2O) を使用してこれらの exchange プロセスを追跡し、測定に基づく分子水素を重水素交換に次の変更が可能します。水素重水素交換の遅い速度は、水素の水素結合に参加することや、構造57でローカルの変更を示す立体障害から単に、起因できます。リガンド結合や翻訳後修飾に伴う変化は、水素重水素交換 (HDX) 率46,53の違いの結果バインドで水素環境の違いにつながることができます。
1) マップ Hsp33 の地域に急速に酸化、Hsp33 の活性化につながる時に展開し、2) そのフルレングスの誤って折りたたまれた基板、クエン酸合成酵素 (CS)38Hsp33 の潜在的なバインディング インターフェイスを定義するこの技術を適用されます。
本稿で説明する方法は、蛋白質の生体外蛋白質機能の抗凝集活性と構造変化の役割 (存在する場合) を定義する酸化還元に依存する関数の研究に適用できます。これらの方法は、簡単に多様な生物学的システムに適応して研究室で適用できます。

<table><tbody><tr><td><ストロング>ケミカル、試薬</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリルHPLCと</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>34998-2.5L</td><td>溶媒</td></tr>ギ<tr><td>酸オプティマLC/MS</td><td>フィッシャーケミカルズ</td><td>A117-50</td><td>溶媒サプリメント</td></tr>イ<tr><td>ソプロピルアルコール、HPLCグレード</td><td>フィッシャーケミカル</td>ズ<td>P750717</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>メタノール</td>フィ<td>ッシャーケミカル</td>ズ<td>A456-212</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252859</td><td>緩衝液</td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>76-05-1</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>HPLC用水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-2.5L-M</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>ZnCl2、塩化亜鉛</td><td>Merck</td><td>B0755416 308</td><td>試薬</td></tr><tr><td>DTT</td><td>goldbio</td><td>27565-41-9</td><td>還元剤</td></tr><tr><td>PDミニトラップ G-25カラム GEヘルスケア</td><td>GEヘルスケア</td><td>29-9180-07</td><td>脱塩カラム</td></tr><tr><td>リン酸カリウム</td><td>米国 Biochemical Corporation</td><td>20274</td><td>緩衝液</td></tr><tr><td>過酸化水素 30%</td><td>メルク</td><td>K46809910526酸化</td><td>剤</td></tr><tr><td>クエン酸シンターゼ</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>C3260</td><td>基質</td></tr><tr><td>HEPES酸を含まない</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>バッファーGndcl</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>G3272-500G</td><td>変性剤</td></tr>塩化<tr><td>重水素溶液</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>543047-10G</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>酸化重水素99%</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>151882-100G</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>バイオワールド</td><td>42000058-2</td><td>還元剤</td></tr><tr><td>150uL マイクロインサート (マンドレル インテリア付き) &ポリマーフィート、29 * 5mm</td><td>La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5mLクリアショートスレッドバイアル9mmスレッド、11.6 * 32mm</td><td>La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>石英キュベット</td><td>Hellma 101-QS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasco FP-8500 Fluorospectrometer</td><td>Jasco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サーモミキサーコンフォート</td><td>エッペンドルフ</td><td>13058/0</td><td></td></tr>ヘ<tr><td>レウスメガフュージ16R、ベンチトップ遠心分離機</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pHメーター、PB-11ザルトリウス</td><td>ザルトリウス</td><td>13119/0</td><td></td></tr>ア<tr><td>フィプロ固定ペプシンカラム(長さ20mm、直径2.0mm)。</td><td>AffiPro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters プレカラム(ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 &、1.7 um、2.1 mmx5mm)</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 分析カラム(ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 カラム、130 &Aring;、1.7um、2.1 mmx50mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エアロックドア付きビニール嫌気性チャンバー</td><td>COY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-exactive-orbitrap 質量分析計</td><td>Thermo-FischerScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PALシステムLHX - HDXサンプルを取り扱うロボットシステム</td><td>PALシステム</td><td>https://www.palsystem.com/index.php?id=840</td><td></td></tr><tr><td>Dionex Ultimate 3000, XRSポンプ</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dionex AXP-MS補助ポンプ</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア, ソフトウェアツール, データベース検索</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kfits:アグリゲーションデータの適合</td><td>http://kfits.reichmannlab.com/fitter/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Thermo Scientific Xcaliburソフトウェア</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive MS Series Tune Interface(Tune)</td><td>https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chronosソフトウェア(Axel Semrau)</td><td>http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteome Discoverer V1.4ソフトウェア</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDXワークベンチソフトウェア</td><td>http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hsp33 の酸化還元規制シャペロン活性を定義および水素重水素交換質量分析法による hsp33 の構造変化をマッピング

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

生きている有機体は定期的に温度、pH、活性酸素種の蓄積の変化など、ライフ サイクルの間に変動環境に対処する必要があります。これらの変動と広範なタンパク質を展開、集計につながることができます細胞死。したがって、細胞は、ストレス条件の中に「健康」のプロテオームを維持する分子シャペロンの動的およびストレス固有ネットワークを進化してきました。ATP に依存しないシャペロンは、ストレス依存的蛋白質の集合からの保護の最初のライン防衛分子となる分子シャペロンの 1 つの主要なクラスを構成します。これらのシャペロンが共通の機能の 1 つストレス固有活性化、認識、および誤って折りたたまれたクライアントのリリースのための可塑性を利用できることです。
本稿で我々 はそのようなの 1 つの本質的に乱れたシャペロン、タンパク質を酸化ストレス時に集計対象を保護する細菌酸化還元制御 Hsp33 の構造と機能解析に焦点を当てます。ここでは、その活動の基になるしてさまざまな技法、シャペロンの構造変化をマッピングするためだけでなく、酸化還元規制シャペロン活性を研究するためのツールボックスを提示します。具体的には、我々 はシャペロン抗凝集活性の in vitroの程度に焦点を当て、光散乱法を用いた解析に続いて完全還元と酸化型タンパク質の調製を含むワークフローを説明します、抗凝集活性とそのキネティクス。凝集アッセイ中に蓄積された頻繁に外れ値を克服するためにKfits、速度論的測定の容易な処理を可能にする新しいグラフィカル ツールの使用方法をについて説明します。このツールは、外れ値を削除すると、速度論的パラメーターを調整運動測定の他のタイプに簡単に適用できます。タンパク質の構造と機能の相関、するセットアップとシャペロンの構造変化のマッピングを可能にする水素重水素交換質量分析、構造の質量分析技術のワークフローについて述べるとHsp33 活動のさまざまな段階での基板。同様の手法は、他のタンパク質とタンパク質-リガンド相互作用に適用できます。

提示された 2 つのメソッドは、運動活動とシャペロンとその基質蛋白質の相互作用のダイナミクスに従うこと。また、酸化還元プロトコルには、酸化還元に依存した乱れたシャペロン活性化機構のより深い理解を与える、完全還元と酸化型シャペロンの準備ができます。
まず、シャペロンのレドックス依存性活性を調べるために光散乱を使用しました。光散乱酸化 (アクティブ) の存在下での化学的および熱変性 CS タンパク質に対して実行されたまたは減少 (非アクティブ) シャペロン (図 1)。化学変性は不利なバッファーの状態で完全に次のタンパク質のリフォールディングによる急速な CS 集約に します。その一方で、ネイティブ折られた基質の比較的遅い展開から熱誘起集計の結果します。したがって、さまざまな種類の集計処理の速度論的パラメーターで異なります。さらに、異なる集計モードで同一基板の凝集を予防する能力を異なるシャペロンに...

生物がその有効期間中に発生する最も困難なストレス条件の 1 つは酸化物質の蓄積を含みます。酸化ストレス時に細胞は分子シャペロンに大きく依存します。HDX MS を用いたシャペロン機能を支配する構造の変更を監視する活動を調査、レドックス制御抗凝集、同様に使用するメソッドを紹介します。

Hsp33 の酸化還元規制シャペロン活性を定義および水素重水素交換質量分析法による Hsp33 の構造変化をマッピング

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

ここで紹介するワークフローは、酸化ストレス状態におけるシャペロンの細胞の役割についての理解を深めるのに役立ちます。具体的には、シャペロンがアンフォールディング条件でタンパク質の凝集をどのように防ぐかを理解するのに役立ちます。異なる技術のこれらの2つのバックは、フラグ分離付きシャペロンの活動への洞察を提供します。また、酵素の社会的相互作用やタンパク質のダイナミクスなど、他のタンパク質の相互作用の研究にも使用できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、新しいユーザーにとっては難しいかもしれないさまざまな機器の使用を伴うため、非常に重要です。まず、以前に解凍したタンパク質サンプルをスピンダウンして凝集体を除去します。次に、5ミリモルのDTTと20マイクロモルの塩化亜鉛を加え、サンプルを摂氏37度で少なくとも1.5時間インキュベートします。DTTを除去するには、40ミリモルのリン酸カリウムバッファーで脱塩カラムを平衡化し、カラムをバッファーで完全に充填し、滴下させます。ピンセットを使用して、カラムの白いディスクフィルターをそっと押し下げて取り外します。カラムにリン酸カリウム緩衝液を補充し、Gの1000倍で3分間遠心分離します。遠心分離後、カラムをきれいなチューブに移し、タンパク質サンプルをカラムの中央にゆっくりと加えます。カラムを G の 1000 倍で 2 分間遠心分離し、DTT フリータンパク質がフロースルー中になるようにします。次に、タンパク質濃度を確認し、280ナノメートルでその吸光度を測定します。タンパク質サンプルの半分をアリコートに分配します。酸素を完全に除去するために、嫌気性条件下でアリコートを20分間インキュベートします。次に、チューブをプラスチックフィルムで密封し、サンプルを低温条件下で保管します。次に、新たに調製した5ミリモルの過酸化水素を残りのタンパク質サンプルに加え、振とうしながら摂氏40度で3時間インキュベートします。遠心分離後、タンパク質濃度を確認し、酸化したタンパク質をアリコートに分割して低温条件下で保存します。12マイクロモルのクエン酸シンターゼを40ミリモルのHEPESと4.5モルの塩化グアニジンに一晩インキュベートして、変性基質を調製します。翌日、蛍光分光計ソフトウェアを開き、タイムコース測定に進みます。励起帯域幅を 2.5 ナノメートルに設定します。励起波長は360ナノメートルまで。発光波長は360ナノメートルまで。5ナノメートルまでの発光帯域幅。そして、データ間隔は0.5秒です。温度を摂氏25度に設定します。1600マイクロリットルの40ミリモルHEPESを石英キュベットに追加してサンプルを準備します。キュベットを蛍光分光計のサンプルホルダーに挿入し、サンプルを目的の温度に到達させます。攪拌を600rpmに設定した後、ベースラインが確立されるまで測定を開始します。シャペロンがない場合にクエン酸シンターゼの凝集を測定するには、10マイクロリットルの変性クエン酸シンテターゼを測定に120秒追加します。その後、測定を1200秒間続けます。Hsp33の存在下でクエン酸シンターゼ凝集を測定するには、Hsp33を60秒で測定します。さらに60秒後、変性クエン酸シンテターゼ10マイクロリットルを加え、1200秒間測定を続けます。次に、データファイルをアップロードして、Kfitsによるデータ解析とノイズ除去を行います。ノイズを除去するには、解析パラメーターを選択し、自動最適モデルを使用し、ノイズが常に信号より上にあることを選択します。緑と赤の調整可能なラインを使用して、明らかな外れ値を手動で削除し、緑のラインの上と赤のラインの下のノイズをフィルタリングします。これに続いて、ベースラインとフィット曲線を設定します。ノイズしきい値を適用した後、処理したデータをダウンロードします。クエン酸シンテターゼをHsp33に43°Cで1対1.5の比率で添加することにより、タンパク質基質複合体サンプルを調製します。少なくとも4つのステップを使用し、添加するたびにサンプルを摂氏43度で15分間インキュベートして、複雑な形成を可能にします。サンプルをGの16000倍、摂氏4度で30分間遠心分離し、凝集体を除去します。次に、サンプルを150マイクロリットルのガラスインサートに入れ、バイアルに移します。次に、それらを適切なトレイに置きます。バッファーHとDを摂氏25度で保持し、サンプルとクエンチングバッファーを摂氏0〜2度で保持します。次に、質量分析計のすべての冷却ユニットを手動でオンにします。すべての冷却システムが目標温度に達したら、HPLCポンプとローディングポンプの両方を手動でオンにします。両方のポンプを制御するソフトウェアと質量分析計を制御するソフトウェアを開き、MSがスタンバイ状態にあることを確認します。その後、HPLCアウトレットバルブをMSソースから外します。最初にシステムをトリプルクリーナー溶液で洗浄します。次に、バッファー B を使用し、最後にバッファー A を使用して、pepsin 列をシステムに挿入します。安定した流れと安定した圧力でシステムを洗浄した後、HPLC出口バルブをMSソースに挿入し、MSをオンにします。次に、ソフトウェアを開きます。ランニングシーケンスを作成し、トレイ内のすべての時点、サンプル名、位置、およびバッファの名前と位置を入力します。ランが完了したら、ソフトウェアを介して非重水素化コントロールサンプルを実行することにより、サンプルのペプチドカバレッジを分析します。HDX Workbenchソフトウェアにデータを転送し、ソフトウェアを使用して結果を分析します。選択したペプチドを保存し、重水素取り込みの分析をさらに進めます。化学的変性は、不利な緩衝条件で完全に変性したタンパク質の再フォールディングによって誘発される急速なクエン酸シンテターゼ凝集につながります。一方、熱誘起凝集は、ネイティブに折り畳まれた基板の比較的ゆっくりとした展開から生じます。どちらの変性形態でも、酸化したHsp33を添加すると凝集が完全になくなり、360ナノメートルの読み取り値が無視できる値に低下しました。還元されたHsp33の存在は、クエン酸シンテターゼの安定性に影響を及ぼさず、シャペロンがない場合に検出されるものと同様の凝集曲線を示しました。結合したシャペロンHsp33とその基質クエン酸シンテターゼとの間の重水素化パターンは、シャペロンのC末端酸化還元スイッチドメイン内のクライアント相互作用部位を明らかにします。還元型Hsp33は、完全に秩序立った構造をしていますが、酸化ストレスを感知すると機能的になります。還元された結合Hsp33と非結合のHsp33は同様のペプチド曲線を生成しますが、酸化されたHsp33は、結合したシャペロンと非結合のシャペロンとの間に30%の重水素化差を示し、結合タンパク質の特定の領域はアロステリック障害を示しています。一度確立されると、散乱アッセイは数時間以内に完了し、DHEX法は適切に実施されれば2〜4日で完了します。この手順を試みるときは、事前に計画を立てることが重要です。温度、インキュベーション時間、緩衝液などの条件はタンパク質特異的であり、各タンパク質に対して最適化する必要があることに注意してください。この手順に従って、シャペロン基質相互作用の研究を補完するために、架橋や沈殿などの他の方法論を実行できます。結論として、この技術は、構造生物学の分野の研究者が分子シャペロンのタンパク質可塑性を探求する道を開きました。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

タンパク質の立体構造とダイナミクスは、タンパク質の構造と機能の関係を理解するための鍵となります。高分解能質量分析と組み合わせた水素の交換は、タンパク質のコンフォメーションのダイナミクスを研究だけでなく、接触インタフェースおよびアロステリック効果を含むタンパク質 - リガンドとタンパク質 - タンパク質相互作用を特徴付けるための汎用的な方法である。...

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この研究は、酸性pH条件下で大腸菌 HdeBのシャペロン活性を特徴づけるために、生物物理学的生化学的および分子技術を説明しています。これらのメソッドは、成功し、このようなHdeAなどの他の酸保護シャペロンに適用されており、他のシャペロンとストレス条件のために働くように修正することができます。...

のpH依存性活性の検出<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;シャペロンHdeB<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

コンフォメーションの柔軟性は、タンパク質の機能に重要な役割を果たしています。本明細書において、我々は、規則及び不規則タンパク質に機能を駆動急速な構造変化をプロービングするための水素 - 重水素交換に結合された時間分解エレクトロスプレーイオン化質量分析法の使用を記載しています。...

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ここでは、3色 smFRET データと 3 D アンサンブル隠されたマルコフ...

3色 1 分子 FRET を使用して蛋白質の相互作用の相関関係を研究するには

ランチペプチド合成酵素は、ペプチド天然物の生合成中に多段階反応を触媒する。ここでは、ランチペプチド合成酵素の立体ダイナミクス、ならびにペプチド天然物生合成に関与する他の同様の酵素を研究するために使用できる、連続的なボトムアップ、水素重水素交換質量分析(HDX-MS)ワークフローについて述べています。...

ペプチド生合成酵素を調べた水素重水素交換質量分析(HDX-MS)プラットフォーム

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単量体α-シヌクレインの構造アンサンブルは、その生理学的機能および物理化学的特性に影響を及ぼす。本プロトコルは、ミリ秒の水素/重水素交換質量分析およびその後のデータ分析を実行して、生理学的条件下でこの本質的に無秩序なタンパク質のモノマー上の立体構造情報を決定する方法を記載する。...

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ここでは、ラベルフリーの定量的質量分析法を用いたタンパク質相関プロファイリングに続く親和性タンパク質複合体の精製と青ネイティブPAGEによるそれらの分離のためのプロトコルを提示します。この方法は、異なるタンパク質複合体へのインタラクトームを解決するのに便利です。...

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

脂肪滴は、C型肝炎ウイルス（HCV）を含むいくつかの病原体の複製のための重要な器官です。我々は、関連するタンパク質の定量的な質量分析のための脂質滴を単離する方法を記載します。そのようなウイルス感染、環境ストレス、または薬物治療などの条件の様々な環境下で使用することができます。...

定量的質量分析のための脂肪滴の分離

ここでは、飛行時間分析法を用いた抽出提案原油マウス組織におけるプロテアーゼの特異性を決定するためのプロトコル。...

MALDI-TOF 質量分析法によるマウス組織におけるプロテアーゼの特異性の定量抽出: 特異性変化を引き起こすに PH を操作します。

学ぶ Hsp33の酸化還元規制シャペロン活性とHDX-MSによる構造変化マッピング。酸化ストレス下でのタンパク質凝集防止メカニズムを解明し、分子シャペロンの動的構造変化を可視化する手法を習得できます。

Hsp33 の酸化還元規制シャペロン活性を定義および水素重水素交換質量分析法による Hsp33 の構造変化をマッピング

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