イン・シトゥバイオプロセスにおける単細胞形態のリアルタイム測定のための顕微鏡検査

この方法は、細胞の形態学的評価を通じて集団の不均一性の主要な質問に答えることができます。その場合の顕微鏡検査では、研究の栽培条件、プロセス収率、および製品品質を可能にします。この技術の主な利点は、サンプリングや汚染のリスクを持たずにリアルタイムデータを提供するin situ測定です。

自動画像認識と結合されたinsitu顕微鏡では、細胞構造、形状、および細胞凝集に関する追加情報をサイズを超えて提供することができます。また、細胞濃度を測定することも可能です。この方法は信頼性の高いツールであることが証明されています。

サンプル調製のための短い時間と低い労力で同じ情報を提供する代替方法はありません。この方法は、様々なバイオプロセスおよび微生物、SEG糸状菌、微小アレルギー、および酵母に適応されてきた。プローブはコンピュータと組み合わせて使用されます。

ハードウェアは、高解像度CCDカメラを備えた単一のロッドプローブで構成されています。調整可能な測定ギャップを通過するセルは、カメラによって画像化されます。光はカメラの反対側の隙間に入り、照明は伝送による。

予測範囲に及ぶセル濃度を使用して、ハードウェアパラメータを設定します。オフライン測定の準備を始めます。厚さゲージを使用して、測定ギャップを調整します。

次に、プローブスクリューナットを回して、測定ギャップを予想される最大セル径の5倍または10倍に設定します。コンピュータで、プローブコントローラソフトウェアを開きます。ソフトウェアで、目的のプローブを選択し、セクションアクションに移動します。

次に、[接続] をクリックします。次に、[プローブ制御]タブに移動して開きます。再生ボタンを押してビデオストリーミングを開始します。

プローブを三脚に固定し、測定ごとに次の手順を実行します。測定ギャップでプローブとスプレーエタノールを使用します。光紙でほこりや汚れを慎重に拭き取ってください。

コンピュータでは、ライブビューを使用して、センサーのガラスに粒子が含まないことを確認します。次に、測定ギャップにドライ光学紙を配置して、焦点を合わせます。拘束ねじを回して、フォーカスを手動で移動します。

測定ギャップに紙の単繊維がはっきりと見える場合は、焦点を合わせるのをやめてください。さて、文化スープで満たされたチューブを取得します。マイクロスコープをスープに浸し、隙間が細胞懸濁液で完全に覆われているようにします。

結合ねじを使用して、セルの焦点を微調整します。このフォーカスが完了したら、実験中に再び変更しないでください。実験用のソフトウェアに戻ります。

トリガーメニューに移動します。[トリガー]メニューで、フレームレートを設定します。オフライン測定にはヘルツを1つお勧めします。

そこから、トリガーあたりのフレーム数フィールドに移動し、良好な統計情報のために必要に応じて設定します。ここでは、約200。また、[全般] メニューに移動します。

そこで、イメージを保存するディレクトリを選択します。[イメージ トリガーの取得開始] ボタンを使用して、画像の取得を開始します。チューブを静かに動かして、測定ギャップの流れを誘発します。

実験の最初の実行の画像をトレーニングセットとして使用します。オープンソースソフトウェアフィジーの準備をして、そのウィンドウに実験から画像をドロップします。完了したら、[分析]を選択し、[ツール]を選択してから[ROI マネージャ]を選択します。

次に、選択ツールを選択します。画像内で、フォーカスしているコメントを付けるパーティクルを決定します。選択ツールを使用して、円を囲みます。

[追加]を押して、ROI マネージャに注釈を追加します。次に、ブラシ ツールを選択し、適切なピクセル サイズを選択します。ブラシ ツールを使用して、選択を調整します。

約 15 の画像で、同じ方法ですべての対象をマーキングし続けます。アナンスファイルを保存し、トレーニングセットとして使用します。認識アルゴリズムがトレーニングされ、準備が整ったら、それを使用して結果を視覚化します。

結果分析ツールで、[ファイル] に移動し、[ファイルのインポート] をクリックします。そこで、目的の結果ファイルを選択します。[グラフの作成] ボタンをクリックして続行します。

[分布グラフ] を選択します。これにより、培養の形態分布が表示されます。[グラフを作成]に戻って感度プロットを選択します。

表示される情報は、必要な精度を得るために解析する必要があるセルの数を判断するのに役立ちます。オフライン測定を完了した後、オンライン測定を実行します。オンライン測定の場合は、プローブをバイオリアクターに直接接続します。

接続したら、アセンブリを適切に殺菌します。ダッシュボードで [監視] を選択します。画像取得を開始する再生ボタンと終了ボタンがあります。

再生ボタンを押します。バイオリアクターで、培養の接種を開始する。カメラは細胞のビデオをキャプチャし、自動的に分析のためにそれらを識別します。

このモニタリングは、発酵中の細胞サイズと異なる細胞形態の形状のオンラインデータを提供します。リアルタイムの結果は、さまざまな方法でフォーマットすることができ、さらに分析するためにエクスポートすることもできます。このS.Cerevisiae細胞径の累積分布のプロットは、この手法を用いて分析されたデータから作成されます。

これは、自動細胞認識が出芽細胞と非出芽細胞を区別できることを示しています。実線曲線は、3時間での栽培中の分布です。点線曲線は7時間で同じ栽培の分布です。

破線曲線は、13時間で収集されたデータを表します。注釈手順は時間がかかりますが、セルの識別に必要な精度を達成するための鍵となります。この手順では、測定時間がプロセスダイナミクスよりも短い場合、リアルタイム測定をプロセス制御に使用することができます。

この技術は、初期のプロセス開発段階から生産規模までの微生物栽培のプロセスパラメータとして、集団の不均一性の測定を使用する道を開きます。