Name: イン・シトゥバイオプロセスにおける単細胞形態のリアルタイム測定のための顕微鏡検査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学ぶイン・シトゥ顕微鏡法による単細胞のリアルタイム形態測定。培養条件の影響を評価し、細胞サイズや凝集構造を自動画像解析で評価する信頼性の高い手法です。

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著者らは、ZIM-Koopの枠組みにおけるドイツ連邦経済エネルギー省の支援に感謝している。ZF 4184201CR5.

<ol><li>Maaß, S., Rojahn, J., Hänsch, R., Kraume, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+drop+detection+using+image+analysis+for+online+particle+size+monitoring+in+multiphase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Computers+%26+Chemical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems.</a> Computers & Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).</li>
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</ol>

著者は申告するものが何もない。

同一または非常に類似したデバイスをここで提示するISMは、真菌、微細藻類、酵母細胞の形態学的ダイナミクスを測定するために使用され、増殖活性の決定を可能にし、藻類の場合には細胞内産物蓄積を可能にした。センサーは可動部品を持っておらず、標準的なポートを通して、または滅菌可能なバイパスで、任意の標準的な攪拌タンクバイオリアクターに直接適用可能です。酵母は藻類よりもはるかに小さいため、細胞サイズの縮小には、酵母の十分なピクセル解像度を得るために、伝送によるカメラ解像度や照明の精度が高いなどの最近のハードウェア適応が必要でした(技術的な詳細については、15を参照)。しかし、細菌のようなより小さな細胞を測定するための限界がまだ存在する。この電流は、UV/VISスペクトル以下の構造との高濃度での粒子情報の重なりと干渉効果に関する制限を示しています。これまで、細菌懸濁液の画像解析アルゴリズムは、明るさ相関16とは別に適用されていない。
以前に適用された他のISMツールは、その信頼性を示...

細胞の形態学的特徴は、生理学的状態に関連することが多く、形態と機能との間の接続は、多くの用途に存在する。単一細胞の形態は、成長の状態、細胞の年齢、浸透性および他の潜在的な細胞ストレスまたは製品の蓄積の影響を受ける。細胞の形態学的変化は、多くの場合、培養物の成長活力の尺度である。細胞内産物合成は、藻類における脂質蓄積及び細菌における封入体形成、とりわけ、細胞サイズと同様に関連している。細胞凝集は、最近2を要約したように調査する価値がある別の要因であることができます。
集団不均一性は、個々の細胞の形態学的特徴に基づいて定量化することができる。研究は、培養中の不均一性が有意であり得るかもしれないことを示し、例えば、大規模な生産条件3の下では、全体の収量は、サブ集団4の低性能の影響を受ける可能性がある。
通常、細胞の形態学的特徴の評価は、手動サンプリングまたは光光学デバイスに結合されたバイパスフローチャンバによって行われる。これはいくつかの制限につながります:取得されたデータの限られた量は、統計的に信頼性の高い測定値をほとんど提供できません。サンプリングと結果のアクセシビリティの間の時間遅延は、プロセスのダイナミクスと比較して長すぎる可能性があります。そして最も重要なのは、サンプリング手順(サンプリングポートの位置、測定前のサンプルの前処理、サンプリングまたはバイパスチューブ内の好ましくない条件)は、サンプル手順自体がすでにセルに影響を与える可能性があるため、バイアス誤差を引き起こす可能性があります。形態。最後に、サンプリング中またはバイパスソリューションで汚染される危険性が常に高く、その場で滅菌できない場合があります。
in situ顕微鏡(ISM)の適用は、これらの問題のいくつかを回避することができます。細胞が自動的に検出された場合、その形態学的特徴の正しい同定を5.これまで、この方法の主な制限は、(i)画像の評価時間、situアプリケーションでは長すぎた、および(ii)特に高細胞密度で画像の解像度が低かった。ISMの最初の解決策は、機械的サンプリング、プローブの希釈、またはバイパスシステム6、7に制限されたが、さらなるアプローチは、細胞懸濁液を直接8の捕捉を可能にする。
ISMの最近の進歩は、単一細胞ベースで細胞のインラインまたはライン監視を可能にし、これはかなり高い細胞濃度で細胞懸濁液に直接リアルタイムで形態学的パラメータの分布を提供する。細胞の主要パラメータのオフライン分析を通じて、結合された自動細胞検出およびISMによって提供される情報との相関関係を同定することができる。次に、単一細胞形態で測定不能なパラメータを推定する新しいソフトセンサ設計が達成されます。
このレポートでは、ISM は光光学プローブを自動画像解析に結合することによって行われます。ISMは、高解像度CCDカメラで調整可能な測定ギャップで既知の焦点範囲内の画像のキャプチャを可能にするシングルロッドセンサプローブで構成されています[MM-Ho = CCD GT2750(2750x2200)およびMM 2.1 = CMOS G507c(2464x2056)]。フラッシュライト照明はトランスミッションによって行われます。従って、光はカメラ9の反対側から起点となり、その強度を調整することができる。細胞は液体の流れとこのギャップを連続的に通過する。したがって、代表的なサンプル母集団が得られる。プローブは、細胞懸濁液に到達するようにバイオリアクターに直接取り付けることができ、または滅菌可能なバイパスで使用することができます。センサシェルは殺菌前にシステムに接続され、光学部品はその後シェルに取り付けられる。
これまで、関連する工業用微生物、例えば、糸状菌(直径200μm以上)、異栄養性微細藻類クリプトヘコディニウムコニウム(平均細胞径20μm)、および酵母サッカロミセス・セレビシエ(平均細胞径5μm)を、この装置または類似の装置で調査した。
糸状菌は、特定の栽培条件下でペレットを形成する傾向がある。これらは数百μmまでの大きさです。真菌細胞のヒファは、流体相における流体力学的ストレスへの依存性において異なる長さを発達させる。これは、代謝および成長活性、基質の取り込みおよび製品放出に影響を及ぼす。ISMは、ペレットの大きさ分布とペレットの端における低バイオマス密度のゾーンの幅を同定するために適用された(独自の未公開データ)。
C.コニの大きさは、細胞が窒素制限の下で多価不飽和脂肪酸ドコサヘキサエン酸(DHA)を蓄積すると15~26μmの間で変化する。このバイオテクノロジーDHA製造プロセスは、細胞が分裂して小さくなる成長段階と、細胞が生成物を蓄積して大きくなる生産段階の2つの部分で構成されています。したがって、細胞サイズは、増殖またはDHA産生のいずれかが良好であったプロセス状態を決定するために使用された。最後に、細胞サイズとDHA含有量との相関関係が見つかった。この場合、ISMは、サンプリング、細胞破壊、および一般的なガスクロマトグラフィー分析10を必要とせずに、細胞内DHA蓄積をリアルタイムで監視することができる。
出芽酵母は、通常、3〜8μmの間のサイズです。一度に成熟状態にある細胞の割合は、出芽指数(BI)で説明されるように、増殖活力11、12、及び組換えタンパク質分泌との関係に関する情報を提供し、13であることが証明されている。ISMの助けを借りて、出芽および非出芽酵母細胞(芽の有無にかかわらず細胞)を区別した14.ストレス条件はまた、酵母集団内の細胞サイズのより広範な変動をもたらし得るが、最近スケールダウン栽培で示されているように、大規模な栄養限定飼料栽培の条件を模倣した3。
したがって、ISMは、最適な培養条件の同定、またはプロセス制御の目的のために、バイオプロセスのすべての段階において、単一細胞レベルで増殖活力および製品形成を監視する可能性を有する。ここで説明する方法は、単一細胞を用いた微生物用途に焦点を当てていますが、ヒトおよび動物細胞、細胞凝集体および糸状生物のペレットのようなより大きな粒子にも適用可能です。

<table><tbody><tr><td>センサーMM 2.1 - MFC</td><td>SOPAT GmbH、ドイツ</td><td>n.a.</td><td>インライン単眼顕微鏡プローブバージョン2.1、Mircoフローセル</td></tr><tr><td>Sofwareバージョンv1R.003.0092</td><td>SOPAT GmbH、ドイツ</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>厚さ計</td><td>n.n.It</td><td></td><td>は、任意のサプライヤー、DIN 2275:2014-03</td></tr>エ<tr><td>タノール70%</td><td>n.n.It</td><td></td><td>任意のサプライヤーSOPAT</td></tr><tr><td>マニュアルバージョンにすることができます2.0.5</td><td>SOPAT GmbH、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学レンズ紙</td><td>VWR</td><td>470150-460</td><td></td></tr><tr><td>フィジー、ImageJ</td><td>オープンソース</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL円錐形遠心分離管</td><td></td><td></td><td>それは任意のサプライヤーにすることができます</td></tr></tbody></table>

イン・シトゥバイオプロセスにおける単細胞形態のリアルタイム測定のための顕微鏡検査

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

微生物バイオプロセスにおけるその過程でのモニタリングは、主に培地の化学的および物理的性質(例えば、pH値および溶存酸素濃度)に制限される。それにもかかわらず、細胞の形態は、成長状態、製品蓄積および細胞ストレスに依存して変化するので、最適な条件のための適切な指標となり得る。さらに、単一細胞サイズ分布は、栽培条件に関する情報だけでなく、集団の不均一性に関する情報も提供する。このような情報を得るために、生体反応器における細胞懸濁液中の単一細胞サイズ分布のモニタリングを直接可能にするために、その上の顕微鏡装置1における光光学を開発した。自動画像解析は、ニューラルネットワークモデルに基づいて顕微鏡に結合され、ユーザーに付け込まれた画像でトレーニングされます。顕微鏡の捕捉から得られるいくつかのパラメータは、代謝活性のような細胞の関連する特徴を処理するために相関している。これまで、その場で提示された顕微鏡プローブシリーズを適用して、糸状菌懸濁液中のペレットサイズを測定した。微細藻類培養における単細胞サイズを区別し、脂質蓄積に関連させるために用いられた。細胞粒子の形状は、酵母培養における出芽に関連していた。顕微鏡分析は、一般に、(i)画像取得、(ii)粒子同定、(iii)データ分析の3つのステップに分けることができます。すべてのステップは生物に適応する必要があり、したがって、信頼性の高い結果を達成するために特定の注意を引いた情報が必要です。細胞形態の変化を直接ラインまたはインライン(バイパス)で監視する機能により、プロセス開発や生産規模でのモニタリングと制御のためのリアルタイム値が可能になります。オフラインデータがリアルタイム データと相関している場合、セル サイズに対する未知の影響を持つ現在の退屈なオフライン測定は不要になります。

ISMによる酵母培養における細胞サイズ検出と、出芽細胞と非出芽細胞を区別する自動画像検出が成功した。ストロボスコープの強度と測定ギャップの選択の両方に許容範囲があり、粒子同定は影響を受けません。例えば、S.セレビシエ細胞は、4gL-1の乾燥バイオマス濃度で11%の変動範囲内で種々のストロボスコープ強度で測定した。対応する画像は鋭い細胞境界を提供したので、粒子同定は細胞サイズの許容可能な変化(1%)ストロボスコープの強度に関係なく。ストロボスコープの強度が適切に調整されていない場合、画像はオーバーライティングに苦しんでいて、適切なセル識別は実現不可能です(図4)。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57823/57823fig4a.jpg"> 図 4:...

細胞懸濁液中の単一細胞の大きさを直接監視するために、その上の顕微鏡装置の光光学を開発した。リアルタイム測定は、光光学滅菌可能プローブを自動画像解析に結合して行います。形態学的変化は、成長状態および栽培条件に依存して現れる。

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

この方法は、細胞の形態学的評価を通じて集団の不均一性の主要な質問に答えることができます。その場合の顕微鏡検査では、研究の栽培条件、プロセス収率、および製品品質を可能にします。この技術の主な利点は、サンプリングや汚染のリスクを持たずにリアルタイムデータを提供するin situ測定です。自動画像認識と結合されたinsitu顕微鏡では、細胞構造、形状、および細胞凝集に関する追加情報をサイズを超えて提供することができます。また、細胞濃度を測定することも可能です。この方法は信頼性の高いツールであることが証明されています。サンプル調製のための短い時間と低い労力で同じ情報を提供する代替方法はありません。この方法は、様々なバイオプロセスおよび微生物、SEG糸状菌、微小アレルギー、および酵母に適応されてきた。プローブはコンピュータと組み合わせて使用されます。ハードウェアは、高解像度CCDカメラを備えた単一のロッドプローブで構成されています。調整可能な測定ギャップを通過するセルは、カメラによって画像化されます。光はカメラの反対側の隙間に入り、照明は伝送による。予測範囲に及ぶセル濃度を使用して、ハードウェアパラメータを設定します。オフライン測定の準備を始めます。厚さゲージを使用して、測定ギャップを調整します。次に、プローブスクリューナットを回して、測定ギャップを予想される最大セル径の5倍または10倍に設定します。コンピュータで、プローブコントローラソフトウェアを開きます。ソフトウェアで、目的のプローブを選択し、セクションアクションに移動します。次に、[接続] をクリックします。次に、[プローブ制御]タブに移動して開きます。再生ボタンを押してビデオストリーミングを開始します。プローブを三脚に固定し、測定ごとに次の手順を実行します。測定ギャップでプローブとスプレーエタノールを使用します。光紙でほこりや汚れを慎重に拭き取ってください。コンピュータでは、ライブビューを使用して、センサーのガラスに粒子が含まないことを確認します。次に、測定ギャップにドライ光学紙を配置して、焦点を合わせます。拘束ねじを回して、フォーカスを手動で移動します。測定ギャップに紙の単繊維がはっきりと見える場合は、焦点を合わせるのをやめてください。さて、文化スープで満たされたチューブを取得します。マイクロスコープをスープに浸し、隙間が細胞懸濁液で完全に覆われているようにします。結合ねじを使用して、セルの焦点を微調整します。このフォーカスが完了したら、実験中に再び変更しないでください。実験用のソフトウェアに戻ります。トリガーメニューに移動します。[トリガー]メニューで、フレームレートを設定します。オフライン測定にはヘルツを1つお勧めします。そこから、トリガーあたりのフレーム数フィールドに移動し、良好な統計情報のために必要に応じて設定します。ここでは、約200。また、[全般] メニューに移動します。そこで、イメージを保存するディレクトリを選択します。[イメージ トリガーの取得開始] ボタンを使用して、画像の取得を開始します。チューブを静かに動かして、測定ギャップの流れを誘発します。実験の最初の実行の画像をトレーニングセットとして使用します。オープンソースソフトウェアフィジーの準備をして、そのウィンドウに実験から画像をドロップします。完了したら、[分析]を選択し、[ツール]を選択してから[ROI マネージャ]を選択します。次に、選択ツールを選択します。画像内で、フォーカスしているコメントを付けるパーティクルを決定します。選択ツールを使用して、円を囲みます。[追加]を押して、ROI マネージャに注釈を追加します。次に、ブラシ ツールを選択し、適切なピクセル サイズを選択します。ブラシ ツールを使用して、選択を調整します。約 15 の画像で、同じ方法ですべての対象をマーキングし続けます。アナンスファイルを保存し、トレーニングセットとして使用します。認識アルゴリズムがトレーニングされ、準備が整ったら、それを使用して結果を視覚化します。結果分析ツールで、[ファイル] に移動し、[ファイルのインポート] をクリックします。そこで、目的の結果ファイルを選択します。[グラフの作成] ボタンをクリックして続行します。[分布グラフ] を選択します。これにより、培養の形態分布が表示されます。[グラフを作成]に戻って感度プロットを選択します。表示される情報は、必要な精度を得るために解析する必要があるセルの数を判断するのに役立ちます。オフライン測定を完了した後、オンライン測定を実行します。オンライン測定の場合は、プローブをバイオリアクターに直接接続します。接続したら、アセンブリを適切に殺菌します。ダッシュボードで [監視] を選択します。画像取得を開始する再生ボタンと終了ボタンがあります。再生ボタンを押します。バイオリアクターで、培養の接種を開始する。カメラは細胞のビデオをキャプチャし、自動的に分析のためにそれらを識別します。このモニタリングは、発酵中の細胞サイズと異なる細胞形態の形状のオンラインデータを提供します。リアルタイムの結果は、さまざまな方法でフォーマットすることができ、さらに分析するためにエクスポートすることもできます。このS.Cerevisiae細胞径の累積分布のプロットは、この手法を用いて分析されたデータから作成されます。これは、自動細胞認識が出芽細胞と非出芽細胞を区別できることを示しています。実線曲線は、3時間での栽培中の分布です。点線曲線は7時間で同じ栽培の分布です。破線曲線は、13時間で収集されたデータを表します。注釈手順は時間がかかりますが、セルの識別に必要な精度を達成するための鍵となります。この手順では、測定時間がプロセスダイナミクスよりも短い場合、リアルタイム測定をプロセス制御に使用することができます。この技術は、初期のプロセス開発段階から生産規模までの微生物栽培のプロセスパラメータとして、集団の不均一性の測定を使用する道を開きます。

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その時 液体中の生物学的集合体のTEM

生体内の生体分子の研究は、生物学的な文脈における分子機能を理解するために非常に重要です。ここでは、DNAやタンパク質などの蛍光生体分子を生きた微生物に取り込むことができる新しい方法について説明します。蛍光顕微鏡で記録されたin...

エレクトロポ生きた微生物で内在化および蛍光生体分子の観測

粒子追跡マイクロレオロジーによりバイオフィルムの機械的特性のその場でのマッピング

この記事では、タンパク質の細胞内局在ダイナミクスを調査し、バチルス・サチリスおよび黄色ブドウ球菌における高分解能蛍光顕微鏡を用いて形態学的変化を監視するためのステップバイステップガイドを提供します。...

細菌における細胞内タンパク質の局在化と細胞形態の変化を調べる生細胞蛍光顕微鏡

このプロトコルは、生きた3次元イメージングのための細菌サンプルを調製し、マウントする方法と、それらの画像から大腸菌の三次元形状を再構築する方法を説明します。...

正確な細胞表現と正確なタンパク質局在化のための細菌細胞の三次元イメージング

細菌細胞のイメージングは、大きな高分子機械の機能を決定する静的および動的プロセスの定義に焦点を当てた新しいシステム生物学アプローチです。ここでは、定量的ライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の統合により、レジオネラ菌型肺炎球体系IV型分泌系のアーキテクチャと機能を研究しています。...

レジオネラ肺球菌ドット/Icm分泌系の空間的特徴を解決するためのライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の適用

クライオSTEMトモグラフィーは、埋め込み、切片作成、またはその他の侵襲的な調製物なしで、無傷の細胞の細胞小器官を視覚化する手段を提供します。得られた3D解像度は現在、数ナノメートルの範囲であり、数マイクロメートルの視野および1μmのオーダーのアクセス可能な厚さを有する。...

クライオSTEMトモグラフィーによるオルガネラのin situ 可視化

学ぶイン・シトゥ顕微鏡法による単細胞のリアルタイム形態測定。培養条件の影響を評価し、細胞サイズや凝集構造を自動画像解析で評価する信頼性の高い手法です。

イン・シトゥバイオプロセスにおける単細胞形態のリアルタイム測定のための顕微鏡検査

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